熒光定量PCR

1.細(xì)胞RNA提取樣品：293T細(xì)胞試劑：超純RNA提取試劑盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放。釋放出來(lái)的DNA和RNA由于在特定pH和鹽濃度下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以別離。2.細(xì)胞懸液離心，倒掉上清，參加1mlRLT；反復(fù)吹打，使樣本充分裂解；室溫放置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全別離1.裂解：2.抽提：參加200ul氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2min；4℃12,000rpm離心10分鐘，此時(shí)樣品分為三層；上層無(wú)色水相，中間白色蛋白質(zhì)相，下層紅色有機(jī)相，

RNA在上層水相中細(xì)胞RNA提取3.3.過(guò)柱子：吸取上層水相，至新的RNase-Free管中〔注：不要吸到中層〕參加等體積70%的乙醇，顛倒混勻；將溶液全部參加到已裝入收集管〔CollectionTube2ml)的吸附柱〔SpinColumnRM〕中。假設(shè)一次(700ul)不能加完溶液，可分屢次入；12,000rpm離心20s，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；4.洗滌：向吸附柱參加700μlBufferRW1，12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱中參加500μlBufferRW2〔使用前檢查是否已參加無(wú)水乙醇〕，12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；重復(fù)步驟8；12,000rpm離心2min，棄廢液，吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干；細(xì)胞RNA提取4.5.洗滌：將吸附柱置于一個(gè)新的無(wú)RNase離心管〔CollectionTube1.5ml〕中向吸附柱的中間部位參加30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置1min，12,000rpm離心1min，收集RNA溶液，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或-70℃保存RNA，防止降解。注意：1〕RNase-FreeWate體積不應(yīng)小于30μl，體積過(guò)小影響回收率。2〕假設(shè)提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50μl新的RNase-FreeWater重復(fù)步驟5。3〕假設(shè)提高RNA濃度，可將得到的溶液重新參加到吸附柱中，重復(fù)步驟5。6.RNA檢測(cè)：用ddH2O，對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)零；取1ul的RNA溶液進(jìn)行測(cè)定；測(cè)定樣品純度和濃度。純度：OD260/OD280=1.9-2.1<1.8蛋白質(zhì)或酚類(lèi)污染>2.2RNA水解

濃度：RNA(ug/ml)=40﹡OD260*稀釋倍數(shù)細(xì)胞RNA提取5.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)材料：HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒，RNA實(shí)驗(yàn)步驟：1.將RNA模板、PrimerMix、dNTPMix、DTT、RTBuffer、HiFi-MMLV和RNase-FreeWater溶解并置于冰上備用。2.根據(jù)以下表格配置反響體系，總體積為20μl。試劑20μl反應(yīng)體系dNTPMix，2.5mMEach4μlPrimerMix2μlRNATemplate2μl5×RTBuffer4μlDTT，0.1M2μlHiFi-MMLV，200U/μl1μlRNase-FreeWater5μl冰上配制短暫離心42℃50min70℃15min6.3.渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。4.42℃孵育30~50分鐘，70℃孵育15分鐘。反響結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。5.逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR和熒光定量PCR，或置于-20℃長(zhǎng)期保存。逆轉(zhuǎn)錄7.

熒光定量PCR材料：2×UltraSYBRGreenMixture，cDNA，actin引物實(shí)驗(yàn)步驟：1.稀釋模板：每稀釋一個(gè)倍數(shù)，需要將溶液混勻，并短暫離心。編號(hào)模板稀釋倍數(shù)水用量模板用量11倍0ul原液210倍45μl5μl（從1號(hào)管?。?100倍45μl5μl（從2號(hào)管?。?1000倍45μl5μl（從3號(hào)管?。?10000倍45μl5μl（從4號(hào)管?。?45ul對(duì)照8.2.配制PCR預(yù)混反響體系：做5個(gè)樣本，配制8個(gè)樣本的預(yù)混體系，配制方式如下：試劑配制的8個(gè)孔的預(yù)混體系20μl反應(yīng)體系2×UltraSYBRMixture80μl10μlForwardPrimer，10μM6.4μl0.8μlReversePrimer，10μM人cDNA0μl2μlRNase-FreeWater57.6μl7.2μl3.將配制的預(yù)混體系，分裝到八連管中。共加6個(gè)孔，每個(gè)孔中參加18μl的預(yù)混體系。

熒光定量PCR9.4.模板參加：每個(gè)孔中分別參加2μl模板，加樣順序如下：加樣孔123450樣品原液稀釋10倍稀釋100倍稀釋1000倍稀釋10000倍水加入體積2μl2μl2μl2μl2

μl2μl5.混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。6.PCR反響程序：步驟溫度時(shí)間預(yù)變性95℃10min變性95℃15s退火/延伸60℃1

min融解曲線分析

95℃

15s

60℃1

min

95℃