不同炮制方法對(duì)商陸中商陸皂苷甲含量的影響

王燕2009127068中藥制藥河南中醫(yī)學(xué)院摘要：目的建立商陸中商陸皂苷甲的含量測(cè)定方法，并考察不同炮制方法對(duì)商陸中商陸皂苷甲含量影響的差異。方法分別用醋炙法、醋蒸法、清蒸法、綠豆蒸法、高壓蒸法炮制商陸,HPLC法測(cè)定不同炮制品中商陸皂苷甲含量，以SinoChromODSBP柱為分析柱，以1甲酸乙腈溶液和1甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,柱溫30,流速1.0mL/min。結(jié)果商陸醋炙或清蒸1h后，商陸皂苷甲含量升高，醋蒸，清蒸10h,綠豆蒸，高壓蒸后，商陸皂苷甲含量下降，尤以醋蒸品下降明顯。結(jié)論所建立的商陸皂苷甲含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但以商陸皂苷甲為指標(biāo)來控制商陸飲片的質(zhì)量較為單一，有必要進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞：商陸；商陸皂苷甲；炮制；高效液相商陸PhytolaccaacinosaRoxb始載于《五十二病方》，為傳統(tǒng)的瀉下逐水藥，但生商陸毒性較大，多用于外敷癰疽腫毒，制后毒性降低,以逐水消腫為主，多用于水腫脹滿。是故古今均極重視其炮制，《雷公炮炙論》記載：“每修事，先以銅刀刮去上皮了，薄切，架甑蒸，以豆葉一重了，與章陸一重，如斯蒸。從午至亥，出，仍去豆葉，暴干了,細(xì)到用。若無豆葉，只用豆代之”。［1］此后還有熬、炒黃、黑豆蒸、醋炙、醋蒸、酒制等?！吨腥A人民共和國藥典》2010年版以商陸科植物商陸PhytolaccaacinosaRoxb.或垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的干燥根作為中藥商陸入藥?，F(xiàn)今對(duì)于商陸中主要的毒性成分商陸皂苷甲的含量測(cè)定則有一定的研究，有薄層掃描法［2-3］、HPLCELSD法［4-5］等，但這些方法的準(zhǔn)確性或重復(fù)性多較差。本文采用HPLC梯度洗脫，DAD檢測(cè)一法，對(duì)商陸皂苷甲含量的測(cè)定進(jìn)行了全面的方法學(xué)考察，并對(duì)醋炙、醋蒸、清蒸、綠豆蒸、高壓蒸等不同炮制方法生產(chǎn)的商陸飲片中商陸皂苷甲含量的進(jìn)行了考察，為商陸的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為探尋商陸的炮制機(jī)理打下了基礎(chǔ)。1材料Agilent1100系列高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，Chemstationsystem工作站。商陸皂苷甲對(duì)照品（上海同田生物技術(shù)有限公司,E-0153)。生商陸飲片，為商陸科植物垂序商陸PhytolaccaamericanaL.的根。2方法2.1商陸皂苷甲含量測(cè)定2.1.1色譜條件SinoChromODSBP色譜柱(250mm4.6mm,5m),以1甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相A,1甲酸水溶液為流動(dòng)相B,按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm,柱溫30,進(jìn)樣量20L,理論板數(shù)按商陸皂苷甲計(jì)不低于3000。表1商陸皂苷甲含量測(cè)定梯度洗脫條件時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%0-435654-1535-4065-602.1.2供試品溶液的制備將生商陸飲片粉碎，過20日篩，取粉末約1g,精密稱定，置25mL量瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，超聲處理40min,冷卻后以甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過微孔濾膜(0.45m),取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.1.3線性范圍考察精密稱取商陸皂苷甲對(duì)照品4.7mg,置10mL量瓶中，用甲醇溶液定容至10mL,配成0.47mg/mL的溶液。分別進(jìn)樣3、6、9、12、15L,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，2.1.4精密度實(shí)驗(yàn)取濃度為0.47g/mL對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積,RSD為0.21%。2.1.5供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于0,1,2,4,6,8,12,24h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積,。2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取藥材粗粉6份，按上述方法制備樣品并測(cè)定含量2.1.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取生商陸飲片粗粉9份，每份0.5g,每3份一組，按樣品中商陸皂苷甲含量的120%,100%,80%3個(gè)水平分別精密加入商陸皂苷甲對(duì)照品溶液，然后按供試品溶液制備方法制備。2.2不同商陸飲片的炮制1） 醋炙商陸：取生商陸飲片100g,加入30mL米醋，悶潤(rùn)30min,待醋被吸干后，置預(yù)熱的炒鍋中文火炒干。2） 醋蒸商陸：取生商陸飲片100g,加入30mL米醋，悶潤(rùn)30min,待醋被吸干后，置蒸鍋中蒸1h,取出,70烘干。3） 清蒸商陸1:取生商陸飲片100g,置蒸鍋中蒸1h,取出，70烘干。4） 清蒸商陸2:取生商陸飲片100g,置蒸鍋中蒸10h,取出,70烘干。5） 綠豆蒸商陸：取生商陸飲片100g,加入100g綠豆，置蒸鍋中蒸10h,取出，分離綠豆,70烘干。6） 高壓蒸商陸：取生商陸飲片100g,置高壓蒸汽滅菌鍋中，以壓力4kPa,溫度121.3，蒸制30min后，取出，70烘干。2.3樣品測(cè)定將不同炮制方法制得的商陸樣品，分別按商陸皂苷甲含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算含量。3討論1）商陸中含有多種三萜皂苷，結(jié)構(gòu)變化較多，有加利果酸、熊果酸、熊果酸半乳糖苷、商陸皂苷、關(guān)商陸皂苷等20多種皂苷元和30多種皂苷。其中商陸皂苷甲具有特征性，含量較高，且《中華人民共和國藥典》2010年版亦選擇其為含量測(cè)定的指標(biāo)，故選擇測(cè)定飲片中商陸皂苷甲的含量來比較不同炮制方法對(duì)商陸的影響。樣品溶液制備方法的考察根據(jù)商陸中所含皂苷類化合物的性質(zhì)，選擇了不同濃度的甲醇溶液為提取溶劑，其中20mL純甲醇可以提取完全1g商陸粉末中的商陸皂苷甲，且雜質(zhì)相對(duì)較少。由于商陸皂苷甲為齊墩果烷型五環(huán)三萜，只有末端吸收，故選擇了210nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)采用乙臘水系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，可有效的避免雜質(zhì)的干擾和基線漂移，加入甲酸后更可以有效改善峰形。2)《中華人民共和國藥典》2010年版記載的商陸炮制法為醋炙法,同時(shí)歷史上還出現(xiàn)過醋蒸、清蒸、綠豆蒸等方法，如《雷公炮炙論》中記載的即為綠豆蒸的炮制方法，并且在歷史上沿用了較長(zhǎng)的時(shí)間，故選擇了醋炙、醋蒸、清蒸、綠豆蒸、高壓蒸等不同方法炮制商陸，并對(duì)其中商陸皂苷甲含量的進(jìn)行了考察。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見醋炙和清蒸1h后的商陸中，商陸皂苷甲的含量有所上升，醋炙品尤為明顯，升高達(dá)到26%;清蒸10h,綠豆蒸和高壓蒸后的商陸中，商陸皂苷甲的含量有所下降；醋蒸后商陸皂苷甲的含量下降明顯，下降了27%。推測(cè)原因醋炙和清蒸1h由于反應(yīng)條件溫和，可使商陸中含有的商陸皂苷庚等成分17位的酯鍵斷裂，生成商陸皂苷甲，從而提高商陸皂苷甲的含量；而清蒸10h、綠豆蒸、高壓蒸反應(yīng)條件則較為激烈,加熱時(shí)間長(zhǎng)，不但會(huì)使17位的酯鍵斷裂，還會(huì)導(dǎo)致部分商陸皂苷甲20位的酯鍵斷裂，從而導(dǎo)致商陸皂苷甲含量有所下降;而醋蒸的方法加入了酸性成分，還使飲片較長(zhǎng)時(shí)間處于高溫高濕的條件下，大量的酯鍵斷裂，很容易產(chǎn)生脫水、構(gòu)型轉(zhuǎn)變等反應(yīng)，因此醋蒸商陸中商陸皂苷甲的含量最低。從臨床使用情況來看，無論是醋炙商陸，還是綠豆蒸商陸都可以有效地減毒增效。由此可見商陸皂苷甲的含量與商陸的臨床療效并沒有直接的關(guān)系，因此，以商陸皂苷甲為指標(biāo)來控制商陸飲片的質(zhì)量，值得的商榷，有必要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：雷教.《雷公炮炙論》[M].上海：上海中醫(yī)學(xué)院出版社,1986:104.王祝舉，程明，原思通.薄層掃描法測(cè)定商陸飲片中商陸毒素含量[J].中國中藥雜志，1990,15(9):27.范大均，安登魁，李修祿，等.雙波長(zhǎng)薄層掃描測(cè)定商陸及制劑中商陸皂