轉錄因子Pho4參與白念珠菌藥物敏感性的調控秦玉璘;許洪濤;張璐璐;張金宇;姜遠英;曹永兵【摘要】目的通過對缺失相應轉錄因子基因的白念珠菌進行抗真菌藥物敏感性的篩選,考察轉錄因子對白念珠菌耐藥性的影響及調控機制.方法通過微量液基稀釋法點板實驗(SpotAssay)檢測實驗菌株對抗真菌藥物的敏感性?采用實時定量PCR(RT-PCR)的方法檢測白念珠菌耐藥性相關MDR1,CDR1以及ERG11的表達，并通過檢測菌株對羅丹明6G的外排能力進一步檢測菌株對抗真菌藥物的外排能力?結果最低抑菌濃度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)測定和SpotAssay實驗結果表明,與親本菌相比,PHO4基因缺失菌對氟康唑、咪康唑的敏感性顯著升高.雖然耐藥相關基因的表達增加，但對羅丹明6G的外排能力降低，抗氧化應激能力下降結論轉錄因子Pho4的缺失可能通過降低白念珠菌的抗氧化應激能力，減弱對藥物的外排作用而導致對唑類藥物敏感，但其具體的調控機制有待進一步研究.期刊名稱】《中國真菌學雜志》年(卷),期】2016(011)002【總頁數(shù)】5頁(P65-69)【關鍵詞】白念珠菌;轉錄因子;藥物敏感性;藥物外排【作者】秦玉璘;許洪濤;張璐璐;張金宇;姜遠英;曹永兵【作者單位】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433;中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學藥學院新藥研究中心,上海200433【正文語種】中文【中圖分類】R379.4白念珠菌作為一種條件致病真菌，在正常人體內可以長期、無害地共生，并與其他菌群保持平衡，機體自身的免疫力足以抵御白念珠菌的侵襲。當機體免疫力下降時，對白念珠菌的抵抗能力隨之下降，引發(fā)從皮膚黏膜表層到危及生命的系統(tǒng)性真菌感染。近年來，隨著癌癥放化療增加，獲得性免疫缺陷綜合征患者不斷增多，器官移植及外植性器械的廣泛應用使得免疫缺陷患者劇增，白念珠菌的感染率和死亡率不斷升高。臨床上用于治療念珠菌病的抗真菌藥物種類有限，其中氟康唑由于具有較高的生物利用度和較低的毒性，在臨床應用最為廣泛。然而，在長期的臨床治療中，白念珠菌逐漸對氟康唑產生耐藥性，大大降低了臨床治療的效果[1]。目前，在抗真菌藥物的研究中，探索真菌耐藥的機制對解決真菌耐藥問題、發(fā)現(xiàn)抗真菌藥物的新靶點具有重要意義。白念珠菌在長期的演變中，逐步形成了多種唑類藥物耐藥機制，包括：①藥物作用靶酶突變，降低了對藥物的親和力，例如，編碼羊毛甾醇14a-去甲基化酶的基因ERG11的表達量增加使真菌細胞生長不受抑制。②藥物外排泵的過表達，包括易化擴散載體超家族(majorfacilitatorsuperfamily，MFS)及ABC轉運蛋白(ATP-bindingcassettetransporters)兩大類[2]。③白念珠菌生物被膜的形成。④應激反應誘導耐藥基因表達。⑤轉錄因子參與調控耐藥基因的表達。隨著基因水平研究的深入發(fā)展，臨床上在對氟康唑耐受的菌株中發(fā)現(xiàn)普遍鋅簇轉錄因子突變的現(xiàn)象，這些轉錄因子包括：Mrr1[3],Tac1[3-4],Upc2[5]。除鋅簇轉錄因子外，有研究顯示白念珠菌堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子Cap1通過激活耐藥基因MDR1使白念珠菌出現(xiàn)耐藥表型［6］。轉錄因子Ndt80通過控制藥物外排泵CDR1的表達來調控白念珠菌對唑類藥物的耐受性［7］。轉錄因子參與調控白念珠菌耐藥性的相關研究對于從基因調控方面探索白念珠菌耐藥機制具有重要意義，為解決真菌耐藥問題提供了新思路。本文通過篩選16株白念珠菌不同轉錄因子缺失菌，研究可能影響白念珠菌耐藥性的轉錄因子及未知的調控通路。材料菌株白念珠菌(Candidaalbicans)國際通用菌株ATCCMYA-2876(SC5314)由美國華盛頓喬治敦大學(DepartmentofMicrobiologyandImmunology,GeorgetownUniversity,Washington,U.S.A.)WilliamA.Fonzi教授惠贈。SN250及16株白念珠菌轉錄因子敲除菌由中國科學院上海生命科學院巴斯德所陳昌斌教授惠贈，菌株列表及敲除的轉錄因子見表1。主要試劑氟康唑注射液(Fluconazole,FLC)購自Pfizer，咪康唑(Miconazole,MCZ)購自Sigma;真菌RNAout試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司,PrimeScriptTMRTMasterMix,2xSYBRPremixExTaq均購自Takara;羅丹明6G(Rhodamine6G)購自生工生物；藥物母液配置：氟康唑為注射劑，濃度為2mg/mL，直接取用；咪康唑使用二甲亞砜(dimethylsulphoxide,DMSO)溶解，配置成6.4mg/mL儲備液，分裝后于-20工長期貯存?zhèn)溆谩Ｅ囵B(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)液：RPMI1640(GibcoBRL公司)10g,NaHCO32g,嗎啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,MOPS,Sigma)34.5g，加三蒸水900mL溶解，用1mol/LNaOH凋pH至7.0,定容至1000mL，過濾除菌，4工保存。YPD培養(yǎng)液(固體和液體)：蛋白胨20g，酵母浸膏10g，葡萄糖200g，加三蒸水定容至1000mL,固體加2%瓊脂，高壓滅菌后于4°C保存?zhèn)溆?。儀器7500型熒光定量PCR儀(ABI),MultiskanMK3型酶標儀(ThermoScientific),HZ-2111K-B型恒溫振蕩器(太倉市華利達實驗設備有限公司),HeraeusFresco21微量離心機(ThermoScientific)。方法抗白念珠菌藥物體外抑菌活性測定參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)制定的M27-A方案。采用微量液基稀釋法測定實驗菌株的MIC80，取96孔板，將FLC注射液用RPMI1640液體培養(yǎng)基倍比稀釋，藥物作用的最高濃度為64pg/mL,最低濃度為0.125pg/mL,每孔體積為100pL,100pLRPMI1640液體培養(yǎng)基作為空白對照,100pL菌液作為陽性對照，藥物作用的菌液濃度為1x103-5x103cells/mL。35°C孵育24h,48h測定實驗結果，MIC80為與陽性對照孔相比,菌株生長80%被抑制時對應的最低藥物濃度。實驗平行操作2-3次。SpotAssay實驗測定藥物體外抑菌活性配制含藥的YPD平板，氟康唑濃度為16pg/mL、8pg/mL和4pg/mL,咪康唑濃度為8pg/mL、4pg/mL和2pg/mL。挑取單克隆菌落于1mLYPD液體培養(yǎng)基，在30C培養(yǎng)箱，200r/min振蕩培養(yǎng)，活化16h。YPD調整菌液濃度為2x106cells/mL、2x105cells/mL、2x104cells/mL、2x103cells/mL和2x102cells/mL5個濃度梯度，每種菌株，每個濃度梯度取5pL點板。羅丹明6G檢測藥物外排于1mLYPD液體培養(yǎng)基,30C,200r/min振蕩活化菌株使其處于對數(shù)生長期。3000g離心5min,用PBS洗3次后重懸,30C,200r/min振蕩培養(yǎng)2h，使細胞內的能量被耗盡。10pmol/L羅丹明6G30C,200r/min孵育細胞，1h。用PBS洗去胞外的羅丹明6G,并調整菌濃度為5x107cells/mL,加入葡萄糖使終濃度達到2mmol/L，分別在15min,30min,45min,60min,90min取1mL菌液，離心，取上清100pL,測定熒光強度。RT-PCR考察耐藥相關基因的轉錄水平使用真菌RNAout試劑盒抽提菌株RNA并測定濃度和純度后按照TakaraPrimeScriptTMRTMasterMix試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA，反應條件為：37工15min;85°C5s;4X：冷卻。實時定量RealTimeRT-PCR按SYBRPremixExTaqRR420A說明書中的體系(20pL)進行PCR反應，反應條件為：預變性98C30s;PCR反應95C5s,60C34s,40個循環(huán)；熔解曲線分析95C30s;60C1min;95C15s。實驗中使用的引物見表1。使用ABI7500SDS軟件系統(tǒng)對實驗結果進行分析，RT-PCR實驗結果得到相應基因的Ct(thresholdcycle)值。以actin作為內參，并以其Ct值校正目的基因的Ct值，得到ACt值。用Ratio值(實驗組與對照組相比)表示基因表達差異，Ratio值=2(-AACt)。生長曲線于1mLYPD液體培養(yǎng)基,30C,200r/min振蕩活化菌株使其處于對數(shù)生長期。適當稀釋菌液，以YPD培養(yǎng)液調整菌液濃度，使OD630值為0.1。于5mL上述菌液中加入H2O2，使其終濃度為16pg/mL°30C,200r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、&10、12和24h取樣100pL,測定OD630值，以OD630值記錄菌株生長變化情況。統(tǒng)計分析使用GraphPadPrism5軟件對全部數(shù)據(jù)進行分析，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。藥物敏感性實驗通過微量液基稀釋法初步檢測16株轉錄因子缺失菌對臨床常用抗真菌藥物氟康唑的敏感性。PHO4缺失菌在表2中用編號CC007表示，初步的藥敏實驗結果顯示，PHO4缺失菌與親本菌SN250相比，對氟康唑的敏感性顯著升高，24h測得MIC80為0.25pg/mL,48h時測得MIC80為0.5pg/mL。其余15株轉錄因子基因敲除菌的氟康唑藥敏篩選結果列在表3中。SpotAssay實驗點板實驗考察PHO4基因缺失菌對氟康唑和咪康唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)在YPD固體培養(yǎng)基上，pho4-/-對氟康唑和咪康唑均敏感，隨著氟康唑的濃度增加，敏感性增加，對16pg/mL的氟康唑最敏感。然而，pho4-/-對咪康唑的敏感性明顯高于氟康唑，4pg/mL和8pg/mL咪康唑對pho4-/-均有明顯的抑制作用（見圖1）。2.3羅丹明6G外排實驗加入葡萄糖供能后60min，隨著時間的延長，親本菌和突變株對羅丹明6G的外轉運增加。從加入葡萄糖15min開始到90min,PH04敲除菌對羅丹明6G的外轉運能力低于親本菌SN250,PH04敲除菌中藥物外排泵活性低于SN250（見圖2）。2.4親本菌SN250和PH04敲除菌中耐藥相關基因的表達水平RT-PCR實驗結果顯示：PH04缺失菌中多藥耐藥基因MDR1,CDR1的轉錄水平均高于親本菌SN250。唑類藥物的作用靶酶羊毛甾醇14a-去甲基化酶的編碼基因ERG11在親本菌SN250及突變株中的轉錄水平無明顯差異（見圖3）。2.5H2O2對菌株生長的影響生長曲線實驗表明，16pg/mLH2O2對PH04基因缺失菌的生長有明顯的抑制作用，PH04基因的缺失降低了白念珠菌對H202的耐受能力（見圖4）。目前，臨床上廣泛應用的抗真菌藥物的耐藥現(xiàn)象日漸嚴重。白念珠菌產生耐藥現(xiàn)象的原因復雜，耐藥機制與多種因素有關。近年來，關于轉錄因子參與耐藥相關基因表達的調控逐漸深入，從分子水平給出了解決真菌耐藥問題的新途徑。轉錄因子Pho4對白念珠菌在缺乏磷酸鹽的環(huán)境中生長是必須的，PH04突變株在磷酸鹽缺乏的條件下發(fā)生廣泛的菌絲生長和顯著的毒力增加［8］。另有研究結果顯示，轉錄因子Pho4介導菌株對亞砷酸鹽的反應，但并未有該轉錄因子參與耐藥相關調節(jié)的報道。本研究應用經典的微量液基稀釋法對16株轉錄因子基因缺失菌的藥物敏感性進行了初步篩選，發(fā)現(xiàn)PH04基因缺失菌對氟康唑的敏感性有明顯升高，揭示其可能參與了白念珠菌耐藥性的調控。Spotassay實驗在固體YPD培養(yǎng)基中檢測突變株對氟康唑，咪康唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)缺失PHO4的白念珠菌對咪康唑的敏感性高于氟康唑。氟康唑和咪康唑作為臨床常用的抗白念珠菌感染藥物，均通過影響真菌細胞膜重要成分麥角甾醇的生物合成，即抑制ERG11編碼的羊毛甾醇14a-去甲基化酶發(fā)揮藥理作用。為進一步探究PH04參與調控耐藥的分子機制，通過RT-PCR實驗考察了ERG11的轉錄水平，并未發(fā)現(xiàn)PHO4缺失后顯著影響ERG11的表達。而羅丹明外排實驗顯示，與親本菌SN250相比，PHO4缺失菌對羅丹明6G的外排能力減弱，與其對唑類藥物的敏感性增加結果一致，但PHO4缺失菌中MDR1和CDR1的轉錄水平反而有增加。為什么多藥耐藥基因表達增加，但藥物外排能力卻下降？為進一步探索其機制，本研究進一步考察了缺失菌的抗應激能力。通過考察菌株在含H2O2培養(yǎng)基中的生長曲線，比較PHO4缺失菌與親本菌的敏感性，結果顯示PHO4缺失菌對H2O2的敏感性顯著增加，表明其抵抗氧化應激的能力下降。過氧化氫、金屬和非金屬鹽、溫度變化、滲透壓、營養(yǎng)物質缺乏、藥物作用等都是刺激白念珠菌產生應激反應的因素，而應激反應能力的改變也是藥物敏感性改變的原因之一［9-10］。已有的研究結果揭示缺失轉錄因子Pho4的白念珠菌對亞砷酸鹽和砷酸鹽敏感，與白念珠菌中HOG通路的激活狀態(tài)有關，該通路的激活參與調控砷酸鹽脫毒相關基因的轉錄水平。HOG通路是白念珠菌應對外界壓力，產生應激反應的主要通路［11-12］。缺失轉錄因子Pho4導致白念珠菌對砷酸鹽敏感，HOG通路受到抑制，Pho4的表達量增多則會促進Hog1的磷酸化，激活HOG通路［13］。因此推測，PHO4缺失菌對唑類藥物的敏感性增加也可能與其HOG通路被抑制，使其抗應激能力下降，導致藥物外排能力減弱有關。白念珠菌對藥物敏感性的調節(jié)涉及多種機制，對于Pho4參與耐藥調控的機制還有待于進一步研究。相關文獻】KontoyiannisDP,LewisRE.Antifungaldrugresistanceofpathogenicfungi[J].Lancet,2002,359(9312):1135-1144.MorschhauserJ.ThegeneticbasisoffluconazoleresistancedevelopmentinCandidaalbicans[J].BiochimBiophysActa,2002,1587(2-3):240-248.MorschhauserJ.Regulationofmultidrugresistanceinpathogenicfungi[J].FungalGenetBiol,2010:47(2):94-106.CosteAT,KarababaM,IscherF,etal.TAC1,transcriptionalactivatorofCDRgenes,isanewtranscriptionfactorinvolvedintheregulationofCandidaalbicansABCtransportersCDR1andCDR2[J].EukaryotCell,2004,3(6):1639-1652.ZnaidiS,WeberS,Al-AbdinOZ,etal.GenomewidelocationanalysisofCandidaalbicansUpc2p,aregulatorofsterolmetabolismandazoledrugresistance[J].EukaryotCell,2008,7(5):836-847.SasseC,SchilligR,ReimundA,etal.InducibleandconstitutiveactivationoftwopolymorphicpromoterallelesoftheCandidaalbicansmultidrugeffluxpumpMDR1[J].AntimicrobAgentsChemother,2012,56(8):4490-4494.SellamA,TebbjiF,NantelA.RoleofNdt80pinsterolmetabolismregulationandazoleresistanceinCandidaalbicans[J].Eukaryotcell,2009,8(8):1174-1183.RomanowskiK,ZaborinA,ValuckaiteV,etal.Candidaalbicansisolatesfromthegutofcriticallyillpatientsrespondtophosphatelimitationbyexpressingfilamentsandalethalphenotype[J].PloSOne,2012,7(1):e30119.SmithDA,NichollsS,MorganBA,etal.Aconservedstress-activatedproteinkinaseregulates