尺寸排阻色譜法尺寸排阻色譜法是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一種色譜分離方法。又稱為凝膠色譜法、分子排阻色潽法、凝膠過濾色譜法、分子篩色譜法和凝膠滲透色譜法等，是液相色譜的一種。主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等的分離。固定相凝膠為化學(xué)惰性、具有多空網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，凝膠的每個顆粒的結(jié)構(gòu)，猶如一個篩子，小的分子可以進入膠粒內(nèi)部，而大的分子則排阻于膠粒之外，從而達到分離的目的。一、基本原理(一)分子篩效應(yīng)

分子排阻色潽是根據(jù)溶質(zhì)分子大小的不同即分子篩選效應(yīng)而進行分離的。

在一根長的玻璃柱中填充用適當(dāng)溶劑溶脹的凝膠顆粒，這些凝膠顆粒內(nèi)部充滿著孔隙，孔隙大小不一，孔徑有一定范圍。把幾種分子大小不同的混合溶液加到色譜柱的頂部，然后用溶劑進行淋洗。此時溶液中分子量大的溶質(zhì)組分完全不能進入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中，只能經(jīng)過凝膠顆粒之間的孔隙隨溶劑移動。當(dāng)流完自由空間后就從柱的下端流出。

分子量小的組分，可滲入凝膠顆粒內(nèi)的孔隙中。因此在流完自由空間和全部凝膠顆粒的內(nèi)空隙之后，才從柱的下端流出。

介于大小分子之間的組分，只能進入一部分顆粒內(nèi)較大的孔隙，淋洗時此組分是流過全部自由空間加上它能進入的顆粒內(nèi)孔隙，才從柱的下端流出。在這一色譜柱的淋洗過程中，大分子的流程短，移動速度快，先流出色譜柱；小分子的流程長，移動速度慢，后流出色柱；而中等分子居兩者之間。這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。

各種凝膠的空隙大小分布有一個范圍。分子直徑比最大空隙直徑大的這種分子就全部被排阻在凝膠顆粒以外，叫做全排除，兩種或兩種以上的這樣的分子不能達到分離效果。直徑比最小孔隙直徑的分子能進入凝膠顆粒的全部孔隙，如果這樣的兩種或兩種以上的分子也不能達到分離效果。

二、凝膠的分類

葡聚糖凝膠的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

商品名：Sephadex。

控制交聯(lián)劑和葡聚糖的量，可以得到不同程度交聯(lián)度和多孔性的凝膠。由于分子內(nèi)含有大量羥基而具有極性，在水和其他極性溶劑如乙二醇、甲酰胺、二甲基酰胺、二甲亞砜等中溶脹成凝膠顆粒，因醚鍵的不活潑性，故具有較高的穩(wěn)定性。

交聯(lián)度大的孔隙小，吸液膨脹也少，可用于小分子量物質(zhì)的分離。交聯(lián)度小的孔隙大，吸液膨脹也大，適用于大分子量物質(zhì)的分離。

交聯(lián)度：每克干凝膠所吸收的水分重量。

商品凝膠型號多用吸水量的10倍數(shù)字來表示。如：G–25，表示每克干凝膠吸水量為2.5g。

注意：葡聚糖凝膠在水、鹽溶液、弱酸及弱堿溶液中穩(wěn)定性較好，但長期于強酸及強氧化劑接觸會破壞膠粒。微生物可使其降解，要注意防止發(fā)霉。

三、操作方法（一）凝膠的選擇

分子排阻色潽法對所用的凝膠的基本要求：

a.化學(xué)性質(zhì)惰性，不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，可以反復(fù)使用而不改變其色譜性質(zhì)。

b.盡可能不帶電荷以防止發(fā)生離子交換作用。

c.

顆粒大小均勻，機械強度盡可能高。

除以上基本要求外，可根據(jù)分離對象和分離要求選擇適當(dāng)型號的凝膠。1.組別分離

即從小分子物質(zhì)（K=1）中分離大分子物質(zhì)（K=0）或從大分子物質(zhì)中分離小分子物質(zhì)，即對于分配系數(shù)有顯著差別的分離叫組別分離。如制備分離中的脫鹽大多采用硬膠（G-75型以下），既容易操作，又可得到滿意的流速，常選用葡聚糖凝膠G-25、G-50；對于小肽和低分子量物質(zhì)（1000~5000）的脫鹽可采用葡聚糖凝膠G-10、G-25及聚丙烯酰胺凝膠P-2和P-4。

2.分級分離當(dāng)被分離的物質(zhì)之間分子量比較接近時，根據(jù)其分配系數(shù)的分布和凝膠的工作范圍，把某一分子量范圍內(nèi)的組分分離出來，稱作分級分離。分級分離的分辨率比組別分離高，但流出曲線之間容易重疊。例如，將纖維素部分水解，然后用葡聚糖凝膠G-25可以分離出1~6個葡萄糖單位纖維素糊精的低聚糖，它們的分子量范圍從180~990，恰在葡聚糖G-25的工作范圍（100~5000）內(nèi)。

分級分離常用于分子量的測定。根據(jù)分離要求選擇凝膠。這種分離要使物質(zhì)完全分離是比較困難的。

3.親脂性有機化合物的分離

可選用親脂性凝膠，如黃酮、蒽醌、色素等分離可選用葡聚糖凝膠LH-20。

在選用凝膠型號時，如果幾種型號都可使用，根據(jù)具體情況考慮：從大分子蛋白質(zhì)中除去氨基酸，各種型號葡聚糖凝膠均可使用，但最好選用交聯(lián)度大的G-25或G-50，因為這樣易于裝柱且流速快，可縮短分離時間，如果想把氨基酸收集于一較小體積內(nèi)，并與大分子蛋白質(zhì)完全分離，最好選用交聯(lián)度小的凝膠，如G-10、G-15，這樣可以避免由于吸附作用而是氨基酸擴散。由此可見，從大分子物質(zhì)中除去小分子物質(zhì)時，在適宜的型號中選擇交聯(lián)度大的為好。反之，欲使小分子物質(zhì)濃縮并與大分子物質(zhì)分離，則在適宜范圍內(nèi)選用交聯(lián)度小的型號為好。（二）裝柱將所需的干凝膠浸入相當(dāng)于其吸水量10倍的溶劑中，緩慢攪拌使其分散在溶液中，防止結(jié)塊，不能用機械攪拌器，避免顆粒破碎。溶脹時間依交聯(lián)度而定，交聯(lián)度小的吸水量大，需要時間長，也可加熱溶脹。所制備的凝膠勻漿不宜過稀，否則裝柱時易造成大顆粒下沉，小顆粒上浮，致使填充不均勻。在分子排阻色譜中，影響分離度的柱參數(shù)中最重要的是柱長度、顆粒直徑及填充的均勻性。雖然理論上認(rèn)為足夠長的柱可獲得不同程度的分離度，柱長加倍，分離度增加40%，但流速至少降低50%，在分子排阻色譜中原來就存在著分離速度慢的缺點，因此很少使用長于100cm的柱。當(dāng)分離K值較接近組分時，柱長卻需要超過100cm時，可采用幾根短柱串聯(lián)。裝柱填充時不應(yīng)有氣泡，填充后用同一種洗脫劑以2~3倍總體積使柱平衡。填充均勻與否可以用0.2%藍色葡聚糖（分子量2000，溶于同一洗脫劑中）溶液經(jīng)過柱床，觀察其在柱內(nèi)移動情況來判斷。分子排阻色譜的上樣量可比其他色譜形式大些，如果是組別分離，上樣量可以是柱床體積的25%~30%；如果分離K值相近的物質(zhì)，上樣量為柱床體積的2%~5%。

柱床體積：每克干凝膠溶脹以后在柱中自由沉積所成床的體積（三）洗脫

洗脫劑的作用原則上沒有其他液相色譜要求嚴(yán)格，因為樣品的分離并不依賴與溶劑和樣品間的相互作用力。一般要求洗脫劑與浸泡溶脹凝膠所用的溶劑相同。因為如果換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，從而影響分離效果。除非含有較強吸附的溶質(zhì)，一般洗脫劑用量也僅需一個柱體積。完全不帶電荷的物質(zhì)可用純?nèi)軇┤缯麴s水洗脫，若分離物質(zhì)有帶電基團，就