第一章發(fā)酵工程第1節(jié)傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用一、發(fā)酵與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)（P4）1．發(fā)酵的歷史：約9000年前，我們的祖先就會(huì)利用微生物將谷物、水果等發(fā)酵成含酒精的飲料。（P5）2.1857年，法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，酒精發(fā)酵是由活的酵母菌引起的。（P5)3.腐乳的發(fā)酵參與發(fā)酵的微生物：多種微生物，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。（P5)4.腐乳的發(fā)酵發(fā)酵原理：經(jīng)過(guò)微生物的發(fā)酵，豆腐中的蛋白質(zhì)被分解成小分子的肽和氨基酸,味道鮮美，易于消化吸收。（P5）5.發(fā)酵的概念：人們利用微生物，在適宜的條件下，將原料通過(guò)微生物的代謝轉(zhuǎn)化為人類(lèi)所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。（P5）6.發(fā)酵原理：不同的微生物具有產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的能力，因此利用它們既可以生產(chǎn)出人們所需要的多種產(chǎn)物。（P5）7.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發(fā)酵保存下來(lái)的發(fā)酵物中的微生物進(jìn)行發(fā)酵、制作食品的技術(shù)一般稱(chēng)為傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)。（P5）8.使用酵母制作饅頭屬于傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)嗎？不屬于，使用前一次發(fā)酵保存下來(lái)的面團(tuán)進(jìn)行的才算；例如直接利用空氣中毛霉孢子制作腐乳屬于傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，若直接接種毛霉，則不屬于。（P5）9.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的特點(diǎn):以混合菌種的固體發(fā)酵及半固體發(fā)酵為主，通常是家庭式或作坊式的。（P5）10.傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的主要食品:有腐乳、醬、醬油、醋、泡菜和豆豉。二、嘗試制作傳統(tǒng)發(fā)酵食品（P5）1．乳酸發(fā)酵微生物乳酸菌的特點(diǎn)：厭氧細(xì)菌，原核生物，以二分裂方式增殖，代謝類(lèi)型為異養(yǎng)厭氧型，在無(wú)氧的情況下能將葡萄糖分解成乳酸，反應(yīng)簡(jiǎn)式：C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量。（P5）2.乳酸發(fā)酵的生產(chǎn)應(yīng)用：用于乳制品的發(fā)酵、泡菜的腌制等。（P5）3.乳酸菌的分布空氣、土壤、植物體表、人或動(dòng)物的腸道內(nèi)。（P5）4.常見(jiàn)的乳酸類(lèi)型乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。（P6）5.酒精發(fā)酵微生物酵母菌的特點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)胞真菌，真核生物，兼性厭氧微生物，能以多種糖類(lèi)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的來(lái)源。，在無(wú)氧條件下能進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵原理（反應(yīng)簡(jiǎn)式）為C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。溫度是影響酵母菌生長(zhǎng)的重要因素；釀酒酵母的最適生長(zhǎng)溫度約為為28℃。（P6）6.酒精發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用：用于釀酒、制作饅頭和面包等。（P7）7.醋酸發(fā)酵微生物—醋酸菌的代謝特點(diǎn)：好氧細(xì)菌，代謝類(lèi)型為異養(yǎng)需氧型，當(dāng)O2、糖源都充足時(shí)能將糖分解成醋酸，反應(yīng)簡(jiǎn)式為C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up15(酶))2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量；當(dāng)缺少糖源時(shí)則將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，再將乙醛變?yōu)榇姿?，反?yīng)簡(jiǎn)式為C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up15(酶))CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量。最適生長(zhǎng)溫度為30～35_℃。（P7）8.醋酸發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用：用于制作各種風(fēng)味的醋。（P6）9.制作泡菜發(fā)酵原理:①利用植物體表面天然的乳酸菌來(lái)進(jìn)行發(fā)酵；②發(fā)酵期間，乳酸會(huì)不斷積累，當(dāng)它的質(zhì)量百分比為0.4%0.8%時(shí)，泡菜的口味、品質(zhì)最佳。（2）制作泡菜發(fā)酵條件:適宜的溫度、嚴(yán)格控制厭氧條件。（3）制作泡菜方法步驟:配制鹽水→蔬菜裝壇→加鹽水→封壇發(fā)酵①配制鹽水:用清水和食鹽配制質(zhì)量百分比為5%~20%的鹽水,并將鹽水煮沸,冷卻待用。②蔬菜裝壇:將新鮮蔬菜洗凈,切成塊狀或條狀,混合均勻,晾干后裝壇,裝至半壇時(shí),放入蒜瓣、生姜、及ITA香辛料,繼續(xù)裝至八成滿。③加鹽水:將冷卻好的鹽水緩緩倒入壇中,使鹽水沒(méi)過(guò)全部菜料。④封壇發(fā)酵:蓋好壇蓋,向壇蓋邊沿的水槽中注滿水,發(fā)酵過(guò)程中注意補(bǔ)充水,根據(jù)室內(nèi)溫度控制發(fā)酵時(shí)間。制作泡菜實(shí)驗(yàn)分析①鹽的作用：調(diào)味，抑制其他微生物生長(zhǎng)及調(diào)味。②鹽水濃度為質(zhì)量百分比為5%20%。鹽水濃度要適宜的原因：鹽水濃度太高會(huì)引起乳酸菌細(xì)胞滲透失水，影響乳酸菌生長(zhǎng)繁殖，甚至導(dǎo)致乳酸菌死亡；過(guò)低，雜菌易繁殖，導(dǎo)致泡菜變質(zhì)。③鹽水煮沸的目的：殺菌，去除水中的溶解氧。④鹽水冷卻后使用的目的：為了不影響乳酸菌的生命活動(dòng)（為了保證乳酸菌等微生物的生命活動(dòng)不受影響）。⑤在冷卻后的鹽水中可加入少量“陳菜泡液”，目的是增加乳酸菌數(shù)量，縮短泡菜制作時(shí)間。⑥泡菜壇子使用之前要檢查密封性的目的：給泡菜壇內(nèi)創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，嚴(yán)格控制厭氧條件，利于乳酸菌發(fā)酵。⑦用水密封泡菜壇的目的：給泡菜壇內(nèi)創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，嚴(yán)格控制厭氧條件。⑧泡菜制作過(guò)程中，是否只有乳酸菌起作用？不是，還有一些酵母菌和大腸桿菌。（4）蔬菜應(yīng)新鮮的原因：若不新鮮，蔬菜中的亞硝酸鹽含量會(huì)升高。（5）泡菜壇應(yīng)裝至八成滿？為什么？防止由于產(chǎn)生CO2而導(dǎo)致發(fā)酵液溢出壇外（初期大腸桿菌、酵母菌會(huì)產(chǎn)生）防止因裝太滿使鹽水未完全淹沒(méi)菜料而導(dǎo)致菜料變質(zhì)腐爛。（6）為什么含有抗生素的牛奶不易發(fā)酵為酸奶？牛奶發(fā)酵為酸奶主要依靠乳酸菌的作用，而抗生素能夠殺死或抑制乳酸菌。（7）發(fā)酵中期時(shí)，由于前期乳酸的積累，pH下降，嫌氣狀態(tài)形成，乳酸桿菌進(jìn)行活躍的同型乳酸發(fā)酵（發(fā)酵產(chǎn)物只有乳酸或達(dá)到80%以上），大腸桿菌、酵母菌等微生物的活動(dòng)受到抑制。試分析這種微生物消長(zhǎng)現(xiàn)象的原因（為什么乳酸菌會(huì)逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種）：乳酸菌比其他種類(lèi)微生物更耐酸；發(fā)酵中期pH下降，導(dǎo)致其他種類(lèi)的微生物的生命活動(dòng)受到抑制。（8）說(shuō)出乳酸發(fā)酵過(guò)程中下列變化乳酸菌數(shù)量變化先增多后減少；乳酸含量變化持續(xù)增多，最后保持穩(wěn)定；亞硝酸鹽含量變化先增多后減少，最后保持穩(wěn)定。（9）泡菜制作過(guò)程中，各階段菌種變化：①發(fā)酵初期：主要是大腸桿菌、酵母菌活躍，消耗大量氧氣，使壇內(nèi)形成無(wú)氧環(huán)境，會(huì)使好氧菌生命活動(dòng)逐漸被抑制。②發(fā)酵中期（風(fēng)味最佳）：乳酸菌活躍使乳酸不斷積累，pH下降，會(huì)使不耐酸菌被抑制。③發(fā)酵后期：乳酸繼續(xù)增加，到一定程度后會(huì)使乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制。（10）泡菜壇的發(fā)酵液表面會(huì)長(zhǎng)出一層白膜，這層白膜是乳酸菌嗎？不是，是酵母菌繁殖形成的，因?yàn)楸砻嫜鯕夂控S富，不適于乳酸菌生長(zhǎng)。（P6）（11）進(jìn)一步探究——亞硝酸鹽：泡菜在腌制過(guò)程中會(huì)有亞硝酸鹽產(chǎn)生；膳食中的亞硝酸鹽一般不會(huì)危害人體健康，但如果人體攝入過(guò)量，會(huì)發(fā)生中毒，甚至死亡；亞硝酸鹽為強(qiáng)氧化劑，能夠把血液中的低鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而導(dǎo)致缺氧性中毒癥狀；膳食中的絕大部分亞硝酸鹽在人體內(nèi)以“過(guò)客”形式隨尿排出，只有在特定的條件下(如適宜的pH、溫度和一定的微生物作用)，才會(huì)轉(zhuǎn)變成致癌物──亞硝胺。（霉變的食品亞硝胺可增至數(shù)十倍至數(shù)百倍）。（P8）（12）拓展應(yīng)用：某同學(xué)在制作泡菜前，查閱資料得知，可以向泡菜壇中加人一些“陳泡菜水”；在用質(zhì)量百分比為5%的食鹽水制作泡菜時(shí)，他在不同時(shí)間測(cè)定了泡菜中亞硝酸鹽的含量，結(jié)果見(jiàn)曲線圖。請(qǐng)你幫他分析相關(guān)問(wèn)題。①據(jù)圖分析，從亞硝酸鹽的含量來(lái)看，你認(rèn)為該泡菜在什么時(shí)間食用比較合適?為什么?應(yīng)該在11天后食用比較合適；因?yàn)檫@時(shí)亞硝酸鹽含量已經(jīng)降到較低的水平。②他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成這個(gè)結(jié)果最可能的原因是什么?可能是食鹽濃度過(guò)高，抑制乳酸菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生乳酸較少，導(dǎo)致泡菜未能正常發(fā)酵（也可能是由于溫度較低）。③加入“陳泡菜水”的目的是什么？“陳泡菜水”中含有純度較高的乳酸菌，加入“陳泡菜水”相當(dāng)于接種乳酸菌。④泡菜制作過(guò)程中影響亞硝酸鹽含量的因素哪些？腌制方法、食鹽用量、腌制時(shí)間長(zhǎng)短、溫度高低。泡菜中亞硝酸鹽的含量與腌制時(shí)間、腌制溫度和有關(guān)。溫度過(guò)高、食鹽用量過(guò)低、腌制時(shí)間過(guò)短，易造成細(xì)菌大量繁殖，使亞硝酸鹽含量增加。（P7）10.制作果酒發(fā)酵原理：(1)許多新鮮水果的果皮表面附著有大量的不同種類(lèi)的野生酵母菌；(2)在酵母菌的作用下，水果可以發(fā)酵成果酒；（通過(guò)有氧呼吸大量繁殖，通過(guò)無(wú)氧呼吸進(jìn)行酒精發(fā)酵產(chǎn)酒精）(3)相關(guān)反應(yīng)式C6H12O6＋6O2＋6HO2eq\o(→,\s\up15(酶))6CO2＋12HO2＋能量C6H12O6eq\o(→,\s\up15(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量（P7）11.制作果酒發(fā)酵條件：(1)溫度——將溫度控制在1830℃進(jìn)行發(fā)酵；(2)氧氣含量a.氧氣充足的情況下，大量繁殖；b.無(wú)氧條件下，進(jìn)行酒精發(fā)酵.（P7）12.制作果酒方法步驟:器具消毒→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵①器具消毒:將發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈,用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒,晾干備用。②沖洗:新鮮葡萄用清水沖洗1~2次,再去除枝梗和腐爛的的籽粒,瀝干。③榨汁:用榨汁機(jī)榨取葡萄汁,裝人發(fā)酵瓶中,留大約1/3的空間,蓋好瓶蓋。④酒精發(fā)酵:溫度控制在18~30℃,每隔12h左右將瓶蓋擰松一次,但不要打開(kāi)瓶蓋。發(fā)酵時(shí)間為10~12d。⑤醋酸發(fā)酵:葡萄酒制作完成后,打開(kāi)瓶蓋,蓋上一層紗布,進(jìn)行葡萄醋發(fā)酵,溫度為30~35℃,時(shí)間為7~8d。13.制作果酒實(shí)驗(yàn)分析:(1)用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精給發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)消毒。(2)沖洗葡萄的目的：去除表面灰塵、污物。(3)沖洗12次即可，能否連續(xù)沖洗？為什么？不能，防止果皮表面的野生菌種數(shù)量減少。(4)去梗之前沖洗還是去梗之后沖洗？之前。為什么？避免葡萄破損，減少被雜菌污染的機(jī)會(huì)。(5)葡萄汁裝入發(fā)酵瓶時(shí)，能裝滿嗎？不能，要留約1/3的空間。為什么？a.先讓酵母菌進(jìn)行有氧呼吸，快速繁殖，耗盡O2后，再進(jìn)行酒精發(fā)酵；b.防止發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CO2造成發(fā)酵液溢出。(6)每隔12h左右將瓶蓋擰松一點(diǎn)的目的：排出氣體（CO2）。(7)能全部打開(kāi)嗎？不能為什么？防止雜菌污染。(8)果酒制作過(guò)程中，在不滅菌的情況下，酵母菌是如何成為優(yōu)勢(shì)菌種的？發(fā)酵后期在缺氧和酸性發(fā)酵液中，絕大多數(shù)微生物的生命活動(dòng)受到抑制，而酵母菌可以適應(yīng)這一環(huán)境成為優(yōu)勢(shì)菌種。(9)在制作果酒過(guò)程中，除了酵母菌，是否還有其他微生物生長(zhǎng)？它們會(huì)對(duì)果酒發(fā)酵產(chǎn)生影響嗎？如果有，如何避免這種影響？還有一些乳酸菌和醋酸菌；乳酸菌能將糖分解為甘油、酒石酸等，從而使果酒變質(zhì)，而在有氧的情況下，醋酸菌能把糖分解成醋酸或者把乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛進(jìn)而轉(zhuǎn)化為醋酸。可以通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵的溫度、pH等來(lái)控制乳酸菌含量；可以通過(guò)減少O2含量、調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度、pH來(lái)控制醋酸菌含量。（10）如何檢測(cè)果酒的發(fā)酵情況:聞、品嘗、用酸性重鉻酸鉀溶液檢測(cè)（橙色→灰綠色）。（11）葡萄酒呈現(xiàn)深紅色的原因：在發(fā)酵過(guò)程中，紅葡萄皮的色素進(jìn)入發(fā)酵液中，使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色。（12）果酒制作中，酒精含量達(dá)一定程度后不變，CO2也不產(chǎn)生，原因可能是原料耗盡或高濃度的酒精抑制了酵母菌細(xì)胞呼吸。14.制作果醋參與發(fā)酵的主要微生物及來(lái)源：空氣中的醋酸菌。15.制作果醋的發(fā)酵原理：（1）在有氧的條件下，果酒經(jīng)醋酸菌的作用可以進(jìn)一步發(fā)酵成果醋；（2）當(dāng)糖源、氧氣充足時(shí)，醋酸菌還可以直接將糖分解為醋酸；（3）相關(guān)反應(yīng)式：C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up15(酶))CH3COOH(醋酸)＋H2O＋能量C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up15(酶))2CH3COOH(醋酸)＋2H2O＋2CO2＋能量16.制作果醋的發(fā)酵條件：（1）溫度——發(fā)酵溫度為3035℃。（2）氧氣含量——氧氣供應(yīng)充足。17.制作果醋的步驟：果酒制作→打開(kāi)瓶蓋，蓋上紗布→果醋檢測(cè)18.制作果醋的實(shí)驗(yàn)分析（1）在制作果醋的過(guò)程中，酵母菌是否還會(huì)繼續(xù)發(fā)酵？隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的pH、發(fā)酵溫度等均不利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，因此酵母菌活性很低，不會(huì)繼續(xù)發(fā)酵。（2）醋酸菌從何而來(lái)？打開(kāi)瓶蓋后，空氣中的醋酸菌會(huì)進(jìn)入果酒發(fā)酵液中大量繁殖，其他的菌因不適應(yīng)環(huán)境條件（不能利用乙醇）而不能繁殖。（3）采用什么措施可以加快果醋的制作？在工業(yè)上，后期醋的發(fā)酵需要人工接種醋酸菌；或者買(mǎi)一瓶醋，將其打開(kāi)暴露于空氣中，一段時(shí)間后在醋的表面會(huì)有一層薄膜（即醋酸菌膜），用這層薄膜進(jìn)行接種亦可。（4）在制作果酒和果醋的過(guò)程中，發(fā)酵液分別有哪些變化？其中最明顯的變化發(fā)生在發(fā)酵后多少天？引起變化的原因是什么？a.在葡萄酒的制作過(guò)程中，發(fā)酵液會(huì)產(chǎn)生氣泡，這是因?yàn)榻湍妇l(fā)酵產(chǎn)生了CO2；b.開(kāi)始發(fā)酵后，CO2產(chǎn)生越來(lái)越多，會(huì)使發(fā)酵液出現(xiàn)“沸騰”現(xiàn)象，在發(fā)酵的10天后，這種現(xiàn)象最明顯；c.發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)熱，會(huì)使發(fā)酵液溫度上升，應(yīng)注意控溫；d.發(fā)酵過(guò)程中，由果皮進(jìn)入發(fā)酵液的花青素會(huì)越來(lái)越多，因而發(fā)酵液的顏色會(huì)逐漸加深變成深紅色；e.果醋發(fā)酵完成后，發(fā)酵液的液面上會(huì)出現(xiàn)一層菌膜，即醋酸菌膜。（5）在果酒和果醋制作中，哪些做法可防止發(fā)酵液被污染？a.發(fā)酵瓶、榨汁機(jī)等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精消毒，晾干備用；b.處理葡萄時(shí)應(yīng)先沖洗再去除枝梗；c.排氣時(shí)只需擰松瓶蓋，不要打開(kāi)瓶蓋。（6）如何檢測(cè)果醋的發(fā)酵情況？聞、品嘗、使用pH試紙檢測(cè)檢測(cè)和比較發(fā)酵前后的pH值、觀察醋酸菌膜是否形成。19.果酒和果醋制作的發(fā)酵裝置（見(jiàn)右圖）（1）充氣口：在酒精發(fā)酵時(shí)應(yīng)關(guān)閉；在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵泵入無(wú)菌空氣。（2）排氣口：酒精發(fā)酵時(shí)排出酵母菌產(chǎn)生的CO2；醋酸發(fā)酵時(shí)排出剩余的空氣、CO2。（3）出料口：取樣、監(jiān)測(cè)。（4）排氣口連接長(zhǎng)而彎曲的膠管目的是防止空氣中微生物的污染。1.酒精發(fā)酵時(shí)一般將溫度控制在

18~30°C。(√)2.葡簡(jiǎn)酒釀造過(guò)程中需加入紅色素，使葡萄酒呈深紅色。(x)

3.在葡簡(jiǎn)酒的自然發(fā)酵過(guò)程中，起主要作用的是附著在葡萄皮上的野生型酵母菌。(√)

4.當(dāng)缺少糖源，但氧氣充足時(shí)，醋酸菌將乙醛變?yōu)橐掖迹賹⒁掖甲優(yōu)橐宜帷?x)

5.醋酸菌是一

種好氧細(xì)菌，只有當(dāng)氧氣充足時(shí)，才能進(jìn)行旺盛的生理活動(dòng)，但短時(shí)間的缺氧，不會(huì)導(dǎo)致其死亡。(x)

6.在用帶蓋的瓶子制葡萄酒過(guò)程中，每隔12h左右，將瓶蓋打開(kāi)一次，

以放出CO2。(x）

7.葡萄酒發(fā)酵時(shí)，將葡萄汁裝人發(fā)酵瓶要留有的空間。(√)

8.在堿性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。(x)

9.膳食中的亞硝酸鹽不會(huì)危害人體健康。(x)

10.在泡菜的腌制過(guò)程中，要注意控制腌制的時(shí)間、溫度和食鹽的用量。(√)

11.參與腐乳制作的微生物只有毛霉，毛霉是一種絲狀真菌。

(x)

12.制作泡菜時(shí)清水和食鹽配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~

20%鹽水，煮沸后立即使用。(x)

13.在發(fā)酵工程中，可通過(guò)誘變育種、基因工程育種獲得菌種。(√)

14.分離、提純酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)的單細(xì)胞蛋白，可采用過(guò)濾.沉淀等方法。(√)

15.在連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充的同種培養(yǎng)液和空氣領(lǐng)先滅菌。(√)

16.乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生產(chǎn)。(x）

17.發(fā)酵罐中微生物的生長(zhǎng)繁殖、代謝物的形成速度都與攪拌速度有關(guān)。(√)

18.單細(xì)胞蛋白是從微生物細(xì)胞中提取出來(lái)的。(x)

第1章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用一、微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)1.防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物是研究和應(yīng)用微生物的前提（即發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)）。2.在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物：一方面：為微生物提供合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件（培養(yǎng)基）。另一方面：要確保其他微生物無(wú)法混入，并將需要的微生物分離出來(lái)（無(wú)菌技術(shù)）。（一）培養(yǎng)基的配制1．培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2.培養(yǎng)基作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3．培養(yǎng)基的分類(lèi)（按照物理性質(zhì)分類(lèi)）（1）液體培養(yǎng)基：不含凝固劑（如瓊脂），呈液體狀態(tài)。用途：擴(kuò)大培養(yǎng)獲得大量菌種、常用于工業(yè)生產(chǎn)。目的是增加目的菌的數(shù)量。（2）固體培養(yǎng)基：含凝固劑（如瓊脂），呈固體狀態(tài)。用途：分離、計(jì)數(shù)、鑒定等。4.如何將液體培養(yǎng)基制成固體培養(yǎng)基？加入適量瓊脂。5.微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱(chēng)，包括細(xì)菌、真菌、病毒及一些原生生物等。本章中提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細(xì)菌和真菌。6.實(shí)驗(yàn)室中最常用的培養(yǎng)基之一：瓊脂固體培養(yǎng)基。7.微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基的表面或內(nèi)部生長(zhǎng)，可以形成菌落。8.培養(yǎng)基的基本成分：各種培養(yǎng)基一般都含有水、碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及O2的需求。如培養(yǎng)乳酸菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌(真菌)時(shí)需將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧微生物時(shí)則需要提供無(wú)氧的條件。9.牛肉膏和蛋白胨來(lái)源于動(dòng)物原料，含有糖、維生素和有機(jī)氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蛋白胨提供的主要營(yíng)養(yǎng)為氮源、維生素。牛肉膏提供的主要營(yíng)養(yǎng)為碳源、磷酸鹽、維生素。10.為什么培養(yǎng)基需要氮源？培養(yǎng)基中的氮元素是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。11.含C、H、O、N的有機(jī)物可作為異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。12.自養(yǎng)型微生物與異養(yǎng)型微生物培養(yǎng)基的主要差別在于碳源。13.能否根據(jù)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)判斷微生物的代謝類(lèi)型？可以，例如自養(yǎng)型微生物所需的碳源來(lái)自無(wú)機(jī)碳源，異養(yǎng)型微生物所需的碳源來(lái)自有機(jī)碳源。14.無(wú)機(jī)氮源能給自養(yǎng)型微生物提供能源嗎？可以，例如NH3既作為硝化細(xì)菌的氮源，也作為能源（NH3氧化釋放的化學(xué)能）。15.無(wú)機(jī)鹽除了可以調(diào)節(jié)酸堿平衡、維持一定的滲透壓之外，還能有什么功能？有些無(wú)機(jī)鹽離子可以作為化能合成菌的能源（如鐵細(xì)菌）有些無(wú)機(jī)鹽離子可以激活某些酶（如Mg2+激活DNA聚合酶）16.是否所有培養(yǎng)基中都必須添加碳源、氮源？不是，例如分離固氮菌不需要額外添加氮源，其可以直接利用空氣中的氮?dú)?。（二）無(wú)菌技術(shù)1．獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵：防止雜菌污染。無(wú)菌技術(shù)應(yīng)圍繞如何避免雜菌的污染展開(kāi)。無(wú)菌技術(shù)主要包括消毒和滅菌。2.無(wú)菌技術(shù)（消毒和滅菌）工作主要包括兩個(gè)方面：(1)對(duì)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒。常用的消毒方法有：煮沸消毒、巴氏消毒。(2)對(duì)用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。滅菌的方法有：濕熱滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌。3.做好消毒滅菌工作后，要注意：實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲方佑|。4.為避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，應(yīng)如何操作？在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰附近進(jìn)行。5.無(wú)菌技術(shù)除用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么作用？無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者被微生物感染。6.消毒:(1)概念：是指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。(2)方法:a.日常生活中經(jīng)常用到煮沸消毒法，操作方法：100℃煮沸5～6min；b.對(duì)于一些不耐高溫的液體如牛奶，可使用巴氏消毒法，操作方法：62～65℃消毒30min或80～90℃消毒30s1min；c.生物活體、水源等還可使用化學(xué)藥物進(jìn)行消毒，操作方法：用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源等；d.接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)在使用前，可以用紫外線照射，操作方法：紫外線照射30min。7.滅菌:（1）概念：是指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。（2）方法:a.培養(yǎng)基等一般用濕熱滅菌法，其中高壓蒸汽滅菌的效果最好，操作方法：高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa，溫度121℃,15～30min。b.耐高溫的和需要保持干燥物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)、金屬用具等，可以用干熱滅菌法，操作方法：物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h。c.接種過(guò)程中，微生物的接種工具、試管口、瓶口通過(guò)灼燒滅菌法來(lái)滅菌，操作方法：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒。8.使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)，能不能直接密封升溫？不能，一定要將鍋內(nèi)冷空氣徹底排出，才能密封升溫，否則，可能引起鍋內(nèi)壓力達(dá)到設(shè)定值而溫度不能達(dá)到要求。9.高壓蒸汽滅菌鍋滅菌完畢后，可以立刻放氣減壓?jiǎn)幔坎荒?，若立即放氣減壓瓶?jī)?nèi)液體會(huì)劇烈沸騰，沖掉瓶塞而外溢，甚至導(dǎo)致容器爆裂（須待滅菌鍋內(nèi)壓力降至與大氣壓相等后才可打開(kāi)排氣閥開(kāi)蓋）。10.酒精消毒的最適范圍是體積分?jǐn)?shù)為70%75%的酒精。原因：酒精濃度過(guò)高時(shí)，菌體表面蛋白質(zhì)變性過(guò)快，從而凝固形成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中，酒精濃度過(guò)低時(shí)，殺菌能力減弱。11.用紫外線進(jìn)行消毒時(shí)，可以怎么做來(lái)加強(qiáng)消毒效果？照射前，適當(dāng)噴灑酒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液。12.高壓蒸汽滅菌使用的儀器為高壓蒸汽滅菌鍋，以水蒸氣為介質(zhì)，滅菌條件為壓力200kPa、溫度121℃、時(shí)間1530min。13.干熱滅菌法使用的儀器為干熱滅菌箱，以熱空氣為介質(zhì)，滅菌條件為溫度160170℃、時(shí)間23h。14.灼燒滅菌是將需滅菌的用具直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，優(yōu)點(diǎn)是可以迅速?gòu)氐椎販缇?5.培養(yǎng)基的滅菌方法高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法）；培養(yǎng)皿的滅菌方法干熱滅菌（也可用濕熱滅菌法）。（三）微生物的純培養(yǎng)1．純培養(yǎng)概念：在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含特定種類(lèi)微生物的群體稱(chēng)為培養(yǎng)物。2.純培養(yǎng)物概念：由單一個(gè)體繁殖所獲得的微生物群體稱(chēng)為純培養(yǎng)物，獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。3.獲得純培養(yǎng)物的過(guò)程就是純培養(yǎng)。4.微生物純培養(yǎng)的步驟：微生物的純培養(yǎng)包括配制培養(yǎng)基、滅菌、接種、分離和培養(yǎng)等步驟。5.微生物純培養(yǎng)的原理：采用平板劃線法和稀釋涂布平板法將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后得到的單菌落一般是由單個(gè)微生物形成的純培養(yǎng)物。6.酵母菌的純培養(yǎng):用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母菌。菌落：分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。一個(gè)單菌落即一個(gè)種群。菌落通?？梢杂脕?lái)作為鑒定菌種的重要依據(jù)。獲得單菌落的方法：平板劃線法和稀釋涂布平板法。(2)酵母菌的純培養(yǎng):制備培養(yǎng)基、接種和分離酵母菌、培養(yǎng)酵母菌。制備培養(yǎng)基的步驟：配制培養(yǎng)基→滅菌→倒平板。①配制培養(yǎng)基：稱(chēng)取去皮的馬鈴薯200g,切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過(guò)濾。向?yàn)V液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、1520g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。②將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞；取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。③倒平板時(shí)使培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，在酒精燈火焰附近倒平板。a.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時(shí)開(kāi)始倒平板？瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時(shí)，溫度過(guò)高，太燙，不易操作；若低于50℃不及時(shí)操作，瓊脂會(huì)凝固。b.為什么倒平板和接種整個(gè)過(guò)程要在酒精燈火焰旁進(jìn)行？因?yàn)榫凭珶艋鹧娓浇嬖谥鵁o(wú)菌區(qū)域,避免避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染。拔掉瓶塞后為什么要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。c.在倒平板的過(guò)程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？不能。為什么？因?yàn)榭諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。d.倒平板時(shí)，能將培養(yǎng)皿的皿蓋拿下來(lái)放在一邊嗎？不能。應(yīng)如何做？用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙。為什么？防止雜菌污染培養(yǎng)基。f.剛倒完平板，可以直接倒置嗎？不能，應(yīng)等培養(yǎng)基冷卻凝固。g.培養(yǎng)基冷凝后，為什么要將培養(yǎng)皿倒過(guò)來(lái)放置（倒置）？既可防止皿蓋上冷凝的水滴滴人培養(yǎng)基造成污染;又可避免培養(yǎng)基表面的水分過(guò)快蒸發(fā)。接種和分離酵母菌:①通過(guò)接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)及表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單個(gè)菌落。②平板劃線法接種、劃線的工具接種環(huán)。③連續(xù)劃線的目的：將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面，經(jīng)過(guò)數(shù)次劃線后培養(yǎng)可以分離得到單菌落。④平板劃線法過(guò)程中，接種環(huán)蘸了1次菌液；若分五個(gè)區(qū)劃線，則接種環(huán)共需灼燒6次；灼燒次數(shù)＝劃線次數(shù)＋1。⑤灼燒后的接種環(huán)可以直接劃線嗎？不可以。應(yīng)如何操作？待接種環(huán)冷卻后再劃線。目的？避免溫度過(guò)高殺死菌種。⑥從第二次劃線開(kāi)始，都應(yīng)從上一次劃線的末端開(kāi)始往下一區(qū)域劃線。⑦整個(gè)操作中灼燒接種環(huán)的不同目的：第一次灼燒（取菌種前）：殺死接種環(huán)上原有微生物，避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種。以后每次劃線前灼燒：殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上一次劃線的末端。劃線結(jié)束灼燒：及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者。⑧除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開(kāi)始，目的是什么？將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面，經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落（使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落）。⑨為什么劃線時(shí)要注意不能劃破培養(yǎng)基？a.一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；b.存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。=10\*GB3⑩用平板劃線法接種劃線某個(gè)平板培養(yǎng)后，第一區(qū)域的劃線上都不間斷地長(zhǎng)滿了菌，第二劃線區(qū)域所劃的第一條線上無(wú)菌落，其他環(huán)線有菌落。造成劃線無(wú)菌落的原因：a.接種環(huán)未冷卻。b.劃線未從第一區(qū)域末端開(kāi)始劃線（第二區(qū)域的第一條線未接到第一區(qū)域末端）。培養(yǎng)酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板（一般做三組，目的：平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)）和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類(lèi)的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h。7.如何確定所倒平板未被雜菌（主要是細(xì)菌）污染？將未接種的空白培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底(該操作也可確定培養(yǎng)基滅菌是否徹底）。8.未接種的培養(yǎng)基直接培養(yǎng)起什么作用？做空白對(duì)照，判斷培養(yǎng)基是否被污染，判斷培養(yǎng)基滅菌是否徹底；若培養(yǎng)后培養(yǎng)基表面無(wú)菌落，則說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有污染。9.若未接種的培養(yǎng)基表面出現(xiàn)菌落，說(shuō)明了什么？說(shuō)明培養(yǎng)基被污染，實(shí)驗(yàn)組的菌落中可能存在雜菌。10.注意：（1）在實(shí)驗(yàn)室中，切不可飲食，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染；（2）使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。二、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)（一）選擇培養(yǎng)基1.尋找耐高溫DNA聚合酶的思路是什么？根據(jù)微生物對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。2．水生棲熱菌的篩選：水生棲熱菌能在70～80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。3.從環(huán)境中獲得某種特定種類(lèi)的微生物的原理：某些微生物適應(yīng)某些特定的環(huán)境條件，而絕大多數(shù)微生物在這種條件下不能生存，就可以從特定的環(huán)境中篩選得到特定種類(lèi)的微生物。（1）在被石油污染的土壤中可以篩選石油分解微生物。（2）在冰川凍土層可以篩選耐寒微生物。（3）漆酶屬于木質(zhì)降解酶類(lèi)，分離產(chǎn)漆酶菌株的首選樣品是生活污水嗎？不是。4.實(shí)驗(yàn)室篩選微生物原理：人為提供有利于目的菌生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度和pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。5．選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。6.選擇培養(yǎng)基三種篩選方法：（1）利用營(yíng)養(yǎng)缺陷進(jìn)行選擇培養(yǎng)。某種營(yíng)養(yǎng)缺陷的微生物不能正常生長(zhǎng)（2）利用添加某種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行選擇培養(yǎng)。*添加殺傷性物質(zhì)，有抗性的可以生長(zhǎng)，無(wú)抗性的死亡（3）利用改變培養(yǎng)條件進(jìn)行選擇培養(yǎng)。*調(diào)節(jié)溫度、pH等生長(zhǎng)條件，只有適應(yīng)的可以生長(zhǎng)7.選擇培養(yǎng)基實(shí)例（1）目的：分離酵母菌、霉菌等真菌，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。原理：青霉素能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)真菌無(wú)作用。配制：使用加入青霉素的培養(yǎng)基。（2）目的：分離固氮菌。原理：固氮微生物能利用空氣中的氮?dú)狻Ｅ渲疲菏褂貌患拥矗ㄒ訬2為氮源）的培養(yǎng)基。（3）目的：分離自養(yǎng)型微生物。原理：自養(yǎng)型微生物能利用無(wú)機(jī)碳源。配制：使用不加有機(jī)碳源（以CO2為碳源）的培養(yǎng)基。（4）目的：分離耐酸菌。原理：耐酸菌能在pH為酸性的條件下生長(zhǎng)。配制：使用將pH調(diào)至酸性的培養(yǎng)基。8.選擇培養(yǎng)基的制備原理：根據(jù)不同微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)ζ淠骋换瘜W(xué)、物理因素的抗性不同而制備選擇培養(yǎng)基。9.如何設(shè)計(jì)培養(yǎng)基篩選分解尿素的細(xì)菌？以尿素作為唯一氮源設(shè)計(jì)選擇培養(yǎng)基，只有能合成脲酶的細(xì)菌才能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖。10.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？除以尿素作為唯一氮源外，該培養(yǎng)基的其他營(yíng)養(yǎng)成分與普通培養(yǎng)基基本相同。11.在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的一定是所選擇的目的菌嗎？不一定，有些微生物可以利用目的菌的代謝產(chǎn)物來(lái)生長(zhǎng)繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。12.怎么證明一個(gè)選擇培養(yǎng)基具有選擇性？應(yīng)該設(shè)置基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）或完全培養(yǎng)基作為對(duì)照，若基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落數(shù)菌多于該選擇培養(yǎng)基，則該選擇培養(yǎng)基具有選擇性。13.尿素可為尿素分解菌提供氮源的原因？尿素可為尿素分解菌提供碳源嗎？為什么？尿素分解菌能合成脲酶，脲酶能催化分解尿素產(chǎn)生NH3和CO2，NH3可作為尿素分解菌的氮源。但不能作為碳源，因?yàn)槟蛩胤纸饩皇亲责B(yǎng)生物，不能利用CO2作為氮源。（二）微生物的選擇培養(yǎng)1.稀釋涂布平板法（活菌計(jì)數(shù)法），稀釋涂布平板法基礎(chǔ)操作包括：梯度稀釋和涂布平板。2.稀釋涂布平板法方法概述：由于土壤細(xì)菌的數(shù)量龐大，要想得到特定微生物的純培養(yǎng)物，必須要對(duì)土壤進(jìn)行充分稀釋?zhuān)缓笤賹⒕和坎嫉街苽浜玫倪x擇培養(yǎng)基上。3.平板劃線法的作用：分離純化微生物。稀釋涂布平板法的作用：分離純化微生物、統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。4.分離純化微生物具體含義：將單個(gè)微生物分散在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落（即純培養(yǎng)物）。6.③號(hào)試管稀釋倍數(shù)為104。7．分解尿素的細(xì)菌的分離：分解尿素的細(xì)菌能合成脲酶，該酶能催化尿素分解產(chǎn)生NH3，以此作為細(xì)菌生長(zhǎng)的氮源。要將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)，培養(yǎng)基的配方設(shè)計(jì)思路是培養(yǎng)基中除含有細(xì)菌必需的碳源、水、無(wú)機(jī)鹽外，只含有尿素一種氮源。8．稀釋涂布平板法分離分解尿素的細(xì)菌操作過(guò)程如下：采集土樣→將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋→取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面（多了不易被吸收）→將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中→將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布→用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻→涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30～37℃的恒溫箱中培養(yǎng)1～2d，在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的單菌落。注意：①在涂布平板時(shí)，滴加到培養(yǎng)基表面的菌懸液量不宜過(guò)多（0.1ml）的原因是培養(yǎng)基表面的菌菌懸液會(huì)出現(xiàn)積液，導(dǎo)致菌體堆積，影響分離效果。梯度稀釋原因：培養(yǎng)液中菌體濃度高，直接培養(yǎng)很難分離得到單菌落；目的：將聚集的菌體分散開(kāi)，以便獲得單菌落。②梯度稀釋中，每次取樣前需用手指輕壓移液管橡皮頭，吹吸三次，目的是使微生物和無(wú)菌水混合均勻。③涂布器浸在酒精中的主要目的是為涂布器的灼燒滅菌做準(zhǔn)備；為保證菌液均勻分布，應(yīng)在涂布時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿。④將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過(guò)熱的涂布器放到盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。⑤a.以上操作均在酒精燈火焰旁進(jìn)行，防止雜菌污染。b.若要分離并統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，應(yīng)選用稀釋涂布平板法。c.平板劃線法不能用于活菌計(jì)數(shù)的原因是菌落連成片，無(wú)法計(jì)數(shù)。（三）微生物的數(shù)量測(cè)定1.微生物的數(shù)量測(cè)定方法：間接計(jì)數(shù)法——稀釋涂布平板法直接計(jì)數(shù)法——顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、濾膜法。2．稀釋涂布平板法原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。3.樣品的稀釋度將直接影響平板上的菌落數(shù)目。4.稀釋涂布平板法的計(jì)數(shù)原則：（1）選擇菌落數(shù)為30300的平板計(jì)數(shù)；（2）同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。5.稀釋涂布平板法結(jié)果分析：（1）統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少；這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。（2）統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來(lái)表示。6.C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)菌落數(shù)的平均值；V代表涂布平板時(shí)吸取的稀釋液體積數(shù)值(mL)；M代表稀釋倍數(shù)；則每g樣品中的細(xì)菌數(shù)=（C÷V）×M。7.將1ml水樣稀釋100倍，在三個(gè)平板上用涂布法分別接入0.1ml稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個(gè)平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。8.恰當(dāng)?shù)南♂尪取⑼坎际欠窬鶆蚴浅晒y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。9．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法原理：利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算一定體積的樣品中微生物的數(shù)量。10.顯微直接計(jì)數(shù)法使用的計(jì)數(shù)工具：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板常用對(duì)相對(duì)較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等計(jì)數(shù)；細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。11.顯微直接計(jì)數(shù)法優(yōu)點(diǎn)：快速直觀。12.顯微直接計(jì)數(shù)法缺點(diǎn)：（1）統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。原因：不能區(qū)分死菌與活菌。（2）個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1.實(shí)驗(yàn)原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。2.實(shí)驗(yàn)步驟：土壤取樣→制備培養(yǎng)基→樣品的稀釋與涂布平板→微生物的培養(yǎng)與觀察。3.土壤取樣：（1）取樣地點(diǎn)要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。原因：細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長(zhǎng)。（2）取樣過(guò)程：取樣時(shí)一般要鏟去表層土。原因：細(xì)菌絕大部分分布在距地表38cm的土壤層。(3）注意事項(xiàng)：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。4.制備培養(yǎng)基:（1）作對(duì)照：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。作用：作為對(duì)照組，來(lái)判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。（2）實(shí)驗(yàn)組：選擇培養(yǎng)基。特點(diǎn)：以尿素為唯一氮源。KH2PO4和Na2HPO4的作用：提供無(wú)機(jī)鹽、調(diào)節(jié)pH。尿素作用：氮源。葡萄糖作用：碳源。5.樣品的稀釋與涂布平板:(1)1g土的體積約為_(kāi)1_ml，10g土加入到90ml無(wú)菌水，相當(dāng)于稀釋了10倍。假如104稀釋度下涂布的3個(gè)平板的菌落數(shù)分別為42、40和38，則1ml稀釋液中的菌株數(shù)為400，104稀釋度的試管中的菌株數(shù)為4×103，102稀釋度的試管中的菌株數(shù)為4×105，101稀釋度的錐形瓶中的菌株數(shù)為4×107。101稀釋度的錐形瓶中的菌株來(lái)自于10g土，所以1g土中的菌株數(shù)為4×106。（2）每個(gè)濃度至少設(shè)置4個(gè)平板。平板是實(shí)驗(yàn)組，為選擇培養(yǎng)基，做3組的目的平行重復(fù)。4是對(duì)照組，為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。（3）整個(gè)實(shí)驗(yàn)還需要設(shè)置2個(gè)平板，是哪兩個(gè)？不涂布稀釋液的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。目的：用來(lái)判斷培養(yǎng)基中是否含有雜菌（培養(yǎng)基滅菌是否合格）。（4）為獲得菌落數(shù)在30300之間適于計(jì)數(shù)的平板，測(cè)細(xì)菌時(shí)，一般選用104、105、106倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。（5）在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒(méi)有把握，怎樣才能保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？選用稀釋范圍更大的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)（例如可以將1×1031×107倍稀釋的稀釋液分別涂布平板上培養(yǎng)）。（6）本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記，例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。（7）標(biāo)記時(shí)注意標(biāo)記在皿底，不能標(biāo)記在皿蓋。6.微生物的培養(yǎng)與觀察（1）培養(yǎng)條件：細(xì)菌一般在3037℃的溫度下培養(yǎng)12d。（2）觀察：每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。（3）為什么選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果？防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。（4）一般來(lái)說(shuō)，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。7.結(jié)果分析（1）說(shuō)出下列各組培養(yǎng)基的目的：3組接種的選擇培養(yǎng)基：對(duì)土壤中分解尿素的細(xì)菌分離和計(jì)。1組接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。不接種的選擇培養(yǎng)基：驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基中是否含有雜菌。不接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：驗(yàn)證牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中是否含有雜菌。（2）說(shuō)出以下現(xiàn)象對(duì)應(yīng)的結(jié)果分析：現(xiàn)象分析未涂布培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)培養(yǎng)基未被雜菌污染未涂布培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng)培養(yǎng)基被雜菌污染牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目選擇培養(yǎng)基具有選擇作用（3）樣品稀釋操作成功的標(biāo)志是什么？得到2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)在30300的平板。（4）得到的菌落一定是分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，還需要進(jìn)一步的鑒定。進(jìn)一步探究——分解尿素細(xì)菌的進(jìn)一步鑒定1.原理:分解尿素細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為CO2和NH3，NH3溶于水會(huì)電離出NH4+和OH，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來(lái)判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌；2.方法:在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)紅色環(huán)帶；紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說(shuō)明分解能力越強(qiáng)。拓展應(yīng)用纖維素分解菌的分離纖維素分解菌的篩選方法是剛果紅染色法。剛果紅(簡(jiǎn)稱(chēng)CR)是一種染料，能與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被分解后，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，透明圈的大小可反應(yīng)細(xì)菌降解纖維素的能力。實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。選擇纖維素含量豐富的土壤環(huán)境采集土樣。1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。(x)2.培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時(shí)需將培養(yǎng)基的pH調(diào)至中性或微堿性。(x)3.倒平板操作需要在酒精燈火焰旁。(√)

4.平板劃線時(shí)，接種環(huán)放在火焰上灼燒冷卻后再蘸取菌液，操作要在火焰旁進(jìn)行。(√)

5.在稀釋度足夠高的菌液里，微生物可以被分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在液體培養(yǎng)基中形成單個(gè)的菌落。(√)

6.稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比實(shí)際數(shù)目高。(x)

7.測(cè)定土壤中細(xì)菌、真菌的數(shù)量選用的稀釋范圍相同。(x

)

8.在以尿素為唯一

氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。(√)

9.測(cè)定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目可以用濾膜法，即將已知體積的水過(guò)濾后，將濾膜放在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)計(jì)算黑色菌落的數(shù)目，計(jì)算出水樣中大腸桿菌的數(shù)目。(√)10.某研究小組從有機(jī)廢水中分離微生物用于廢水處理。接種后的培養(yǎng)m需放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(x)

11.在瓊脂固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落含有多種細(xì)菌。(x)

12.培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)皿后進(jìn)行滅菌。(x)

13.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目時(shí)為保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)目最多的平板進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(x)

14.消毒的原則是既殺死部分的微生物，又減少消毒劑對(duì)細(xì)胞的傷害。(√)

15.平板劃線法中每

次

劃線后要將接種環(huán)灼燒。(√)第一章發(fā)酵工程第3節(jié)發(fā)酵工程及其應(yīng)用一、發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)1.發(fā)酵工程的基本環(huán)節(jié)：菌種的選育，擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基的配制、滅菌，接種，發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，產(chǎn)品分離、提純等方面。(1)選育菌種①選育菌種目的：獲得性狀優(yōu)良的菌種。②選育方法（菌種來(lái)源）：可以從自然界中篩選出來(lái)，也可以通過(guò)誘變育種或基因工程育種獲得。③)菌種選育的重要性（意義）:優(yōu)良的菌種不僅具有健壯，不易退化，其發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量高、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，它往往還會(huì)賦予發(fā)酵產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味，因此菌種選育環(huán)節(jié)在很大程度上決定了生物發(fā)酵產(chǎn)物的成敗。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：①目的：獲得更多的菌種。②原因：工業(yè)發(fā)酵罐的體積一般較大，因此，需要接入的菌種總體積大（數(shù)目多）。③擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)基：一般為液體培養(yǎng)基。（3）配制培養(yǎng)基的要求：①在菌種確定之后，（結(jié)合菌種代謝特點(diǎn)）選擇原料制備培養(yǎng)基。②在生產(chǎn)實(shí)踐中，培養(yǎng)基的配方要經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)才能確定。（即不斷優(yōu)化培養(yǎng)基）滅菌①目的：避免因雜菌污染而影響產(chǎn)品的品質(zhì)和產(chǎn)量。②培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌原因：發(fā)酵工程中所用的菌種大多是單一菌種。一旦有雜菌污染，可能導(dǎo)致產(chǎn)量大大下降。（4）接種：擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種和滅菌后的培養(yǎng)基加入發(fā)酵罐中。大型發(fā)酵罐有計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，能對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH、溶解氧、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營(yíng)養(yǎng)等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。（5）發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵①發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵是發(fā)酵工程的中心環(huán)節(jié)。②發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵嚴(yán)格控制發(fā)酵條件的原因：a.環(huán)境條件不僅會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，而且影響微生物代謝物的形成；b.嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，有利于使發(fā)酵全過(guò)程處于最佳狀態(tài)。③發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵要求：在發(fā)酵過(guò)程中，要隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中的微生物數(shù)量、產(chǎn)物濃度等，以了解發(fā)酵進(jìn)程。還要及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分，要嚴(yán)格控制溫度、pH和溶解氧等發(fā)酵條件。④不同發(fā)酵條件的影響實(shí)例——谷氨酸發(fā)酵a.在中性和弱堿性條件下會(huì)積累谷氨酸。b.在酸性條件下則容易生成谷氨酰胺和N乙酰谷胺酰胺。⑤發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)和用途a.培養(yǎng)物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的加入口、放料管、閥門(mén)：制培養(yǎng)物以一定速度進(jìn)入、流出發(fā)酵罐，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。b.空氣入口：控制溶解氧。c.觀察孔、取樣管、pH計(jì)、生物傳感器裝置、溫度傳感器和控制裝置：通過(guò)肉眼觀察、儀器檢測(cè)等監(jiān)控發(fā)酵條件以及發(fā)酵過(guò)程，取樣管處抽取樣品進(jìn)一步檢測(cè)。d.冷卻水進(jìn)入口、冷卻水排出口：通過(guò)控制冷水流速調(diào)節(jié)罐溫。e.排氣管：調(diào)節(jié)罐壓。f.電動(dòng)機(jī)、攪拌葉輪：電機(jī)帶動(dòng)葉輪轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)行攪拌，使微生物與發(fā)酵液混合均勻，加快氧氣溶解以及散熱。⑥現(xiàn)代發(fā)酵工程使用的發(fā)酵罐的優(yōu)點(diǎn)：均有計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，能對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH、溶氧量、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營(yíng)養(yǎng)等進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，還可以進(jìn)行反饋控制，使發(fā)酵全過(guò)程處于最佳狀態(tài)。(6)產(chǎn)品的分離、提純①產(chǎn)品的分離、提純目的：獲得產(chǎn)品。②產(chǎn)品的兩種形式：微生物細(xì)胞本身、代謝物。③分離、提純產(chǎn)物采取手段：如果發(fā)酵產(chǎn)品是微生物細(xì)胞本身，可在發(fā)酵結(jié)束之后，采用過(guò)濾、沉淀等方法將菌體分離和干燥得到產(chǎn)品。如果產(chǎn)品是代謝物，可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采取適當(dāng)?shù)奶崛?、分離和純化措施來(lái)獲得產(chǎn)品。2.微生物菌種資源豐富，選擇發(fā)酵工程用菌時(shí)，需要考慮哪些因素？（1）在低成本的培養(yǎng)基上能迅速生長(zhǎng)繁殖。（2）生產(chǎn)所需代謝物的產(chǎn)量高。（3）發(fā)酵條件易控制。（4）菌種不易變異，退化等。3.怎樣對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)控以滿足微生物的生長(zhǎng)需要？（1）反復(fù)試驗(yàn)確定培養(yǎng)基的配方；（2）對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌；（3）隨時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量、產(chǎn)物濃度等；（4）及時(shí)添加必需的營(yíng)養(yǎng)組分；（5）嚴(yán)格控制溫度、pH和溶氧量等發(fā)酵條件，使用計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)對(duì)各種條件進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，以及反饋控制。4.在產(chǎn)物分離和提純方面，發(fā)酵工程與傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)相比有哪些改進(jìn)之處？傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)獲得的產(chǎn)物一般不是單一的組分，而是成分復(fù)雜的混合物，很多時(shí)候不會(huì)再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離和提純處理，或者僅采用簡(jiǎn)單的沉淀、過(guò)濾等方法來(lái)分離提純產(chǎn)物。發(fā)酵工程中使用的分離和提純產(chǎn)物的方法較多。在產(chǎn)物的初分離階段，常采用沉淀、萃取、膜分離、吸附或離子交換等方法；在進(jìn)一步純化階段，會(huì)采用液相層析法、結(jié)晶法等方法。發(fā)酵工程產(chǎn)物無(wú)論是代謝物還是菌體本身，都需要進(jìn)行質(zhì)量檢查，合格后才能成為正式產(chǎn)品。5.在進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí),排出的氣體和廢棄培養(yǎng)液等能直接排放到外界環(huán)境中嗎?為什么？不能；因?yàn)樵谶M(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)，微生物及其代謝物中都可能含有危害環(huán)境的物質(zhì)。為了減少或避免污染物的產(chǎn)生和排放，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，應(yīng)該對(duì)排出的氣體和廢氣培養(yǎng)液進(jìn)行二次清潔或滅菌處理。6.注意：（1）谷氨酸發(fā)酵常用菌種為谷氨酸棒狀桿菌；（2）谷氨酸棒狀桿菌的代謝類(lèi)型為異養(yǎng)需氧型，其與有氧呼吸有關(guān)的酶主要存在于細(xì)胞膜上；（3）C:N的數(shù)值也會(huì)影響谷氨酸發(fā)酵過(guò)程：C:N=4:1時(shí)，菌體大量繁殖，谷氨酸產(chǎn)生量較少；C:N=3:1時(shí)，菌體繁殖受抑制，谷氨酸產(chǎn)生量較多。發(fā)酵工程的應(yīng)用1.發(fā)酵工程以其生產(chǎn)條件溫和、原料來(lái)源豐富且價(jià)格低廉、產(chǎn)物專(zhuān)一、廢棄物對(duì)環(huán)境的污染小和容易處理。等特點(diǎn)，在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)等等許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。2.食品工業(yè)是微生物最早開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的領(lǐng)域。一直以來(lái)，與發(fā)酵有關(guān)的食品工業(yè)的產(chǎn)量和產(chǎn)值都居于發(fā)酵工業(yè)的首位。3.發(fā)酵工程在食品工業(yè)的應(yīng)用包括：(1)生產(chǎn)傳統(tǒng)的發(fā)酵產(chǎn)品，如醬油、各種酒類(lèi)。(2)生產(chǎn)各種各樣的食品添加劑，如通過(guò)黑曲霉發(fā)酵制得的檸檬酸，由谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)味精。常見(jiàn)的食品添加劑種類(lèi)：酸度調(diào)節(jié)劑、增味劑、著色劑、增稠劑、防腐劑。食品添加劑優(yōu)點(diǎn)：增加食物的營(yíng)養(yǎng)，改善食品的口味、色澤和品質(zhì)，延長(zhǎng)食品的保存期。(3)生產(chǎn)酶制劑，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、果膠酶、氨基肽酶、脂肪酶等。酶制劑應(yīng)用：食品的直接生產(chǎn)、改進(jìn)生產(chǎn)工藝、簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程、改善產(chǎn)品的品質(zhì)和口味、延長(zhǎng)食品儲(chǔ)存期和提高產(chǎn)品產(chǎn)量等。酶制劑來(lái)源：少數(shù)由動(dòng)植物生產(chǎn)，絕大多數(shù)通過(guò)發(fā)酵工程生產(chǎn)。4.發(fā)酵工程在生產(chǎn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的意義：使這些產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量明顯提高。5.啤酒是以大麥為主要原料經(jīng)酵母菌發(fā)酵制成的。6.發(fā)酵工程在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用：（1）采用基因工程的方法，將植物或動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移到微生物中，獲得具有某種藥物生產(chǎn)能力的微生物。（2）直接對(duì)菌種進(jìn)行改造，再通過(guò)發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)所需要的產(chǎn)品。7.利用基因工程生產(chǎn)疫苗具體操作：將病原體的某個(gè)或某幾個(gè)抗原基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)奈⑸锛?xì)胞，獲得的表達(dá)產(chǎn)物就可以作為疫苗使用。8.發(fā)酵工程在農(nóng)牧業(yè)的應(yīng)用：(1)生產(chǎn)微生物肥料。微生物肥料的作用：微生物肥料利用了微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、生物活性物質(zhì)等來(lái)增進(jìn)土壤肥力，改良土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。有的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生長(zhǎng)，從而減少病害的發(fā)生。常見(jiàn)的有根瘤菌肥、固氮菌肥等。(2)生產(chǎn)微生物農(nóng)藥。微生物農(nóng)藥的作用：利用微生物或其代謝物來(lái)防治病蟲(chóng)害的。微生物農(nóng)藥作為生物防治的重要手段，將在農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。(3)生產(chǎn)微生物飼料。生產(chǎn)微生物飼料的原理：微生物含有豐富的蛋白質(zhì)，且繁殖速度快。微生物飼料實(shí)例：①單細(xì)胞蛋白：以淀粉或纖維素的水解液、制糖工業(yè)的廢液等為原料，通過(guò)發(fā)酵獲得了大量的微生物菌體，即單細(xì)胞蛋白，用單細(xì)胞蛋白制成的微生物飼料，能使家畜、家禽增重快，產(chǎn)奶或產(chǎn)蛋量顯著提高。②乳酸菌：在青貯飼料中添加乳酸菌，可以提高飼料的品質(zhì)，使飼料保鮮，動(dòng)物食用后還能提高免疫力。9．在其他方面的應(yīng)用（1）解決資源短缺與環(huán)境污染問(wèn)題：隨著對(duì)纖維素水解研究的不斷深入，利用纖維廢料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、乙烯等能源物質(zhì)已取得成功。（2）將極端微生物應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐：自然界中還存在著一定數(shù)量的極端微生物，它們能在極端惡劣的環(huán)境（高溫、高壓、高鹽和低溫等環(huán)境）中正常生活。例如嗜熱菌、嗜鹽菌可以用來(lái)生產(chǎn)洗滌劑，嗜低溫菌有助于提高熱敏性產(chǎn)品的產(chǎn)量。細(xì)胞工程第一節(jié)細(xì)胞工程一、植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)1.細(xì)胞工程概念：細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等多學(xué)科的原理和方法，通過(guò)細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品的一門(mén)綜合性生物工程。①原理方法：細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)；②操作水平：細(xì)胞器、細(xì)胞或組織水平；③目的：得特定的細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體或其產(chǎn)品；④分類(lèi)：植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程。（一）植物細(xì)胞的全能性1．概念：細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細(xì)胞的潛能。2.在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，并不是所有細(xì)胞都表現(xiàn)出全能性，比如：芽原基的細(xì)胞發(fā)育為芽，葉原基的細(xì)胞發(fā)育為葉。這是因?yàn)樵谔囟ǖ臅r(shí)間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性地表達(dá)。3.是否表現(xiàn)出全能性的判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后是否產(chǎn)生完整生物體。4.細(xì)胞具有全能性的原因（物質(zhì)基礎(chǔ)）：一般來(lái)說(shuō)，生物體的細(xì)胞中都含有該物種的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所需的全部遺傳信息。5.生物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞不表現(xiàn)全能性的原因（不離體的細(xì)胞無(wú)法表現(xiàn)出全能性的原因）：在特定的時(shí)間和空間條件下，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性地表達(dá)（從而形成生物體的不同組織和器官）。6.是不是所有的活細(xì)胞都具有全能性？不是，例如哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞、植物成熟的篩管細(xì)胞。7.細(xì)胞具有的全能性一定能表現(xiàn)出來(lái)嗎？不是，例如動(dòng)物的體細(xì)胞。8.比較一般情況下下列細(xì)胞全能性的大小(1)受精卵＞生殖細(xì)胞＞體細(xì)胞(2)分化程度低的細(xì)胞＞分化程度高的細(xì)胞、(3)分裂能力強(qiáng)的細(xì)胞＞分裂能力弱的細(xì)胞(4)植物細(xì)胞＞動(dòng)物細(xì)胞(5)幼嫩的細(xì)胞＞衰老的細(xì)胞9.以下例子哪些能夠表現(xiàn)出了細(xì)胞的全能性：（1）、（3）、（4）、（6）、（7）(1)利用菊花莖段培養(yǎng)獲得試管苗。(2)芽原基的細(xì)胞發(fā)育為芽，葉原基的細(xì)胞發(fā)育為葉。(3)受精卵發(fā)育成個(gè)體。(4)蜜蜂的孤雌生殖中，卵細(xì)胞直接發(fā)育成雄蜂。(5)造血干細(xì)胞可分化形成多種血細(xì)胞。(6)通過(guò)花藥離體培養(yǎng)，獲得單倍體幼苗。(7)胚胎干細(xì)胞可分化發(fā)育成為各種組織器官的細(xì)胞。(8)種子發(fā)育成完整植株。（二）植物組織培養(yǎng)技術(shù)1．植物組織培養(yǎng)概念：將離體的植物器官、組織或細(xì)胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。2.離體培養(yǎng)的植物器官、組織或細(xì)胞被稱(chēng)為外植體。3.植物組織培養(yǎng)的原理：植物細(xì)胞的全能性。植物組織培養(yǎng)的生殖方式：無(wú)性生殖。植物組織培養(yǎng)的分裂方式：有絲分裂。4.菊花植物組織培養(yǎng)（1）菊花植物組織培養(yǎng)的原理①植物細(xì)胞一般具有全能性；②脫分化：在一定的激素和營(yíng)養(yǎng)等條件的誘導(dǎo)下，讓已經(jīng)分化的細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能，轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞的過(guò)程。結(jié)果：形成愈傷組織。③愈傷組織的特點(diǎn)：不定形的薄壁組織團(tuán)塊。一般不需要光照。此過(guò)程中涉及的生命活動(dòng)只有細(xì)胞增殖（有絲分裂），沒(méi)有細(xì)胞分化。④再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織，在一定的培養(yǎng)條件下，再分化出芽、根等器官，進(jìn)而形成完整的小植株。需要給予適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的光照，誘導(dǎo)葉綠素的合成，使試管苗能夠進(jìn)行光合作用。此過(guò)程中涉及的生命活動(dòng)既有細(xì)胞增殖（有絲分裂），又有細(xì)胞分化。再分化實(shí)質(zhì)：基因的選擇性表達(dá)。⑤激素的作用：植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵激素。它們的濃度、比例等都會(huì)影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向；生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用來(lái)的比值結(jié)果比值高有利于根的分化，抑制芽的形成比值低有利于芽的分化，抑制根的形成比值適中促進(jìn)愈傷組織的形成選材：經(jīng)常選擇根尖（分生區(qū)）、莖的韌皮部（形成層）等。原因：分裂能力強(qiáng)、分化程度低，容易誘導(dǎo)形成愈傷組織。（3）操作流程：①外植體的消毒：將流水沖洗后的外植體用酒精消毒30s，用無(wú)菌水清洗2～3次后，再用次氯酸鈉溶液處理30min，用無(wú)菌水清洗2～3次。若想縮短次氯酸鈉溶液處理時(shí)間應(yīng)適當(dāng)提高次氯酸鈉溶液的濃度。②外植體的分割：用無(wú)菌濾紙吸去表面的水分，用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長(zhǎng)的小段。大小應(yīng)適宜。③接種：在酒精燈火焰旁，并且實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基和所有的器械及每次使用后的器械都要滅菌，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記。接種時(shí)注意外植體的方向，不要倒插。④培養(yǎng)：將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養(yǎng)瓶置于18～22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察和記錄愈傷組織的生長(zhǎng)情況。誘導(dǎo)愈傷組織期間一般不需要光照，在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中，每日需要給予適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的光照。⑤轉(zhuǎn)移培養(yǎng)（再分化過(guò)程）：培養(yǎng)1520d后，將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上。長(zhǎng)出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上，進(jìn)一步誘導(dǎo)形成試管苗。⑥移栽：試管苗不可以直接移栽入土，需先打開(kāi)封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長(zhǎng)幾日，將試管苗移植到消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖上，壯苗后再移栽入土。（4）若培養(yǎng)物取自植物的幼莖、葉片等含有葉綠體的部位，愈傷組織中是否會(huì)含有葉綠體？為什么？愈傷組織中不含有葉綠體；培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化細(xì)胞，因此，愈傷組織中不含有葉綠體。（5）植物組織培養(yǎng)中細(xì)胞表現(xiàn)出全能性的條件①離體（最關(guān)鍵）。②嚴(yán)格的無(wú)菌條件。③適宜的培養(yǎng)條件。④適宜濃度和比例的激素。⑤一定的營(yíng)養(yǎng)條件。（6）為什么一定要離體才能表現(xiàn)出全能性？若細(xì)胞不離體，細(xì)胞中的基因會(huì)選擇性地表達(dá)，從而形成生物體的不同組織和器官，不能表現(xiàn)出全能性。（7）如何控制嚴(yán)格的無(wú)菌條件？①用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精對(duì)手、超凈工作臺(tái)、外植體進(jìn)行消毒,對(duì)外植體處理還需要質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%左右的次氯酸鈉溶液,清洗外植體需要使用無(wú)菌水。②)對(duì)培養(yǎng)基和器械進(jìn)行滅菌；③接種操作必須在酒精燈火焰旁進(jìn)行。（8）適宜的培養(yǎng)條件包括那些？①溫度（例如菊花植物組織培養(yǎng)應(yīng)為1822℃）。②光照（例如脫分化需避光，再分化需照光）。（9）一定的營(yíng)養(yǎng)條件如何保證？配制合適的培養(yǎng)基，包括有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分、特定濃度和比例的激素。（10）培養(yǎng)基組成①無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（水和無(wú)機(jī)鹽）,②有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分（蔗糖、氨基酸、維生素）,③特定濃度和比例的激素（主要是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素）。注意：蔗糖的作用：提供能量，調(diào)節(jié)滲透壓。培養(yǎng)基滅菌方法為：濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌）。（11）為什么整個(gè)過(guò)程要保證無(wú)菌操作？避免雜菌在培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)消耗營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)防止有些雜菌危害培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。（12）整個(gè)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基中是一成不變的嗎？不是。分別為誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基→誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基→誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基。（13）以上培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素的比值大小是如何變化的？比值適中→比值低→比值高。（14）接種后，外植體被污染的可能原因：①培養(yǎng)基、接種工具滅菌不徹底。②外植體消毒不徹底。③操作過(guò)程不符合無(wú)菌操作要求等。（15）若想探究生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的使用比例對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響，則應(yīng)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)？空白對(duì)照：不加任何激素。實(shí)驗(yàn)組1：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值為1；實(shí)驗(yàn)組2：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值大于1；實(shí)驗(yàn)組3：生長(zhǎng)素用量與細(xì)胞分裂素用量的比值小于1。（三）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1.用傳統(tǒng)的有性雜交方法都能得到雜種后代嗎？為什么？不是，因?yàn)閮煞N生物之間存在著生殖隔離。2．植物體細(xì)胞雜交的概念：將不同來(lái)源的植物體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新植物體的技術(shù)。3.植物體細(xì)胞雜交的主要步驟：植物細(xì)胞融合和植物組織培養(yǎng)。（1）在進(jìn)行體細(xì)胞雜交之前，必須先去除細(xì)胞壁：用纖維素酶和果膠酶去除植物細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。去壁原因：細(xì)胞壁阻礙著細(xì)胞間的雜交（阻礙了原生質(zhì)體間的融合）。（2）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法①物理法：電融合法、離心法等。②化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋－高pH融合法等。（3）細(xì)胞融合完成的標(biāo)志：再生出新的細(xì)胞壁。植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志：培育出雜種植株。（4）再生出細(xì)胞壁的相關(guān)的細(xì)胞器：高爾基體和線粒體。（5）驗(yàn)證再生出新壁的實(shí)驗(yàn)：質(zhì)壁分離和質(zhì)壁分離復(fù)原實(shí)驗(yàn)。4.纖維素酶和果膠酶的酶溶液中一般加入一定濃度的無(wú)機(jī)鹽離子和甘露醇，試分析原因？使溶液具有一定的滲透壓，防止原生質(zhì)體吸水過(guò)多而漲破，保持原生質(zhì)體正常。5.①植物體細(xì)胞雜交的原理：細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性。②植物體細(xì)胞雜交的生殖方式：無(wú)性生殖。③植物體細(xì)胞雜交的分裂方式：有絲分裂。④植物體細(xì)胞雜交的涉及的可遺傳變異類(lèi)型：染色體變異。6.獲得的所有細(xì)胞一定是需要的雜交細(xì)胞嗎？不一定；誘導(dǎo)融合后的產(chǎn)物有三類(lèi)：未融合的細(xì)胞、兩兩融合的細(xì)胞、多細(xì)胞融合體。7.植物體細(xì)胞雜交的意義：打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種等方面展示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。8.雜種植株包含兩個(gè)物種的全部遺傳物質(zhì)，各種基因都包含在內(nèi)，卻未按照人們的要求表現(xiàn)出親本所有的性狀，例如“番茄馬鈴薯”并沒(méi)有地上結(jié)番茄，地下長(zhǎng)馬鈴薯，這是為什么？生物體內(nèi)基因的表達(dá)不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，雜種植株的細(xì)胞中雖然具備兩個(gè)物種的遺傳物質(zhì)，但這些遺傳物質(zhì)的表達(dá)相互干擾，它們不能像在原植株細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)有序表達(dá)，因此不能按照人們的要求表現(xiàn)出親本所有的性狀。植物細(xì)胞工程的應(yīng)用植物細(xì)胞工程的應(yīng)用包括植物繁殖的新途徑、作物新品種的培育、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。（一）植物繁殖的新途徑1.植物繁殖的新途徑包括快速繁殖（也叫微型繁殖）和作物脫毒。2.快速繁殖(1)快速繁殖概念：用于快速繁殖優(yōu)良品種的植物組織培養(yǎng)技術(shù)。(2)優(yōu)點(diǎn)：可以高效、快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖；無(wú)性繁殖可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性；可實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)。注意：扦插、壓條、嫁接等不屬于微型繁殖技術(shù)。3．作物脫毒（1）適用范圍：無(wú)性繁殖的作物(馬鈴薯、草莓、香蕉）。（2）進(jìn)行作物脫毒的原因：用無(wú)性繁殖的方式進(jìn)行繁殖的作物，它們感染的病毒很容易傳給后代，病毒在作物體內(nèi)逐年積累，就會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差。（3）外植體選材部位：植物頂端分生區(qū)附近部位，如莖尖。（4）選分生區(qū)的原因：植物頂端分生區(qū)附近病毒極少，甚至無(wú)病毒。（5）優(yōu)點(diǎn)：脫毒作物的產(chǎn)量和品質(zhì)明顯優(yōu)于沒(méi)有脫毒的作物。（6）作物脫毒具體操作過(guò)程：切取一定大小的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生的植株就有可能不帶病毒，從而獲得脫毒苗。（7）脫毒苗是否不會(huì)再感染病毒？不是，脫毒苗≠抗毒苗。（8）實(shí)例：目前采用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)脫去病毒，在馬鈴薯、草莓、甘蔗、菠蘿、香蕉等主要經(jīng)濟(jì)作物上已獲得成功。（二）作物新品種的培育1.作物新品種的培育包括單倍體育種和突變體的利用。2.單倍體育種(1)過(guò)程：花藥（或花粉）離體培養(yǎng)（花藥取自二倍體植株）→單倍體幼苗eq\o(→,\s\up9(染色體加倍))純合子植株。當(dāng)年就能培育出遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定的純合二倍體植株。(2)優(yōu)點(diǎn)①后代是純合子，能穩(wěn)定遺傳。②極大地縮短了育種的年限，節(jié)約了大量的人力和物力。=3\*GB3③大多數(shù)單倍體植株可作為進(jìn)行體細(xì)胞誘變育種和研究遺傳突變的理想材料。為什么大多數(shù)單倍體植株可作為進(jìn)行體細(xì)胞誘變育種和研究遺傳突變的理想材料？大多數(shù)單倍體植株的細(xì)胞中只含一套染色體，染色體加倍后得到的植株的隱性性狀容易顯現(xiàn)。2．突變體的利用（1）過(guò)程：（2）誘變處理對(duì)象：一般為愈傷組織。（3）產(chǎn)生原因：在植物的組織培養(yǎng)過(guò)程中，易受培養(yǎng)條件和誘變因素(如射線、化學(xué)物質(zhì)等)的影響而產(chǎn)生突變。（4）原理：基因突變和植物細(xì)胞的全能性。（5）誘變育種的缺點(diǎn)：突變具有不定向性和低頻性，因此需大量處理實(shí)驗(yàn)材料。（6）誘變育種的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)人工誘變提高愈傷組織的突變率，從而篩選獲得抗病、抗鹽、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種，加快育種進(jìn)程。(7)利用：篩選出對(duì)人們有用的突變體，進(jìn)而培育成新品種。（三）細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)1.代謝產(chǎn)物的分類(lèi)a.初生代謝產(chǎn)物：初生代謝是生物生長(zhǎng)和生存所必需的代謝活動(dòng)；產(chǎn)物：糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等b.次生代謝產(chǎn)物：植物代謝會(huì)產(chǎn)生一些一般認(rèn)為不是生物生長(zhǎng)所必需的，一般在特定組織或器官中，并在一定的環(huán)境和時(shí)間條件下才進(jìn)行。產(chǎn)物：一類(lèi)小分子有機(jī)化合物（如酚類(lèi)、萜類(lèi)、含氮化合物等)2.細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)的目標(biāo)產(chǎn)物：次生代謝產(chǎn)物。3.次生代謝物作用：在植物抗病、抗蟲(chóng)等方面發(fā)揮作用，也是很多藥物、香料和色素等的重要來(lái)源。4.生產(chǎn)技術(shù)手段：植物組織培養(yǎng)技術(shù)（在離體條件下對(duì)單個(gè)植物細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)）。5.過(guò)程：6.細(xì)胞產(chǎn)物工廠化生產(chǎn)主要利用的是哪種結(jié)構(gòu)？愈傷組織。7.該過(guò)程中是否需要培養(yǎng)得到完整植株？一般不需要。8.優(yōu)點(diǎn)：不占用耕地，幾乎不受季節(jié)、天氣等的限制，對(duì)于社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境保護(hù)具有重要意義；生產(chǎn)速度快。9．實(shí)例：利用紫草細(xì)胞的組織培養(yǎng)生產(chǎn)的紫草寧具有抗菌、消炎和抗腫瘤等活性。利用紅豆杉細(xì)胞的組織培養(yǎng)生產(chǎn)的紫杉醇具有高抗癌活性。細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程包括：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞核移植。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)概念：指從動(dòng)物體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的技術(shù)。2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的原理：細(xì)胞增殖（有絲分裂）。3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的地位：動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。4.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵操作：原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件：營(yíng)養(yǎng)條件、無(wú)菌、無(wú)毒的環(huán)境、適宜的溫度、pH和滲透壓、適宜的氣體環(huán)境。2.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要包括：糖類(lèi)、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽、維生素等。未知營(yíng)養(yǎng)條件：使用合成培養(yǎng)基時(shí)，通常需加入血清等一些天然成分。其作用為：提供尚未全部研究清楚的細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括蔗糖和淀粉嗎？不包括。3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的物理性質(zhì)：培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞一般使用液體培養(yǎng)基，也稱(chēng)為培養(yǎng)液。4.保證無(wú)菌、無(wú)毒環(huán)境的具體措施（1）對(duì)培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理。（2）在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作。（3）還需要定期更換培養(yǎng)液。5.培養(yǎng)液的滅菌方法：濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌）。培養(yǎng)用具的滅菌方法：濕熱滅菌法（+烘干）或干熱滅菌法。6.怎樣保證無(wú)菌操作？對(duì)操作空間、操作者衣著和手進(jìn)行清潔和消毒，保證所有操作均在在超凈工作臺(tái)并在酒精燈火焰旁進(jìn)行。7.為什么培養(yǎng)液需要定期更換？以便清除代謝物，防止細(xì)胞代謝物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害。8.如何防止培養(yǎng)過(guò)程中的微生物污染？在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素。9.哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的溫度多以36.5±0.5℃為宜。10.多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞生存的適宜pH為。11.維持適宜滲透壓的目的維持細(xì)胞正常的形態(tài)和功能。12.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需氣體主要有O2和CO2。其作用分別為：O2是細(xì)胞代謝所必需的，CO2的主要作用維持培養(yǎng)液的pH。13.培養(yǎng)容器：通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)儀器：含有95%空氣和5%CO2的混合氣體的CO2培養(yǎng)箱。因此動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境為95%空氣和5%CO2。（二）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程取動(dòng)物組織→制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液原代培養(yǎng)→分瓶→傳代培養(yǎng)1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取材：動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官。取材原因：細(xì)胞分化程度低，增殖能力強(qiáng)，容易培養(yǎng)。2.制成細(xì)胞懸液的步驟（1）將組織分散成單個(gè)細(xì)胞。（2）用培養(yǎng)液將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。3.將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的原因（1）從動(dòng)物體取出的成塊組織中，細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了生長(zhǎng)和增殖；（2）能使細(xì)胞與培養(yǎng)液充分接觸，更易進(jìn)行物質(zhì)交換。4.將組織分散成單個(gè)細(xì)胞的方法(1)機(jī)械法;(2)用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時(shí)間。5.（1）用胰蛋白酶分散細(xì)胞，可以說(shuō)明什么問(wèn)題？動(dòng)物細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。（2）可以用胃蛋白酶分散細(xì)胞嗎？不可以。為什么？胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時(shí)，胃蛋白酶就會(huì)失去活性，多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒(méi)有活性，所以用胃蛋白酶不行。6.酶解法較溫和，一定不會(huì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞造成損傷嗎？不是，使用胰蛋白酶時(shí)，要控制好作用時(shí)間，因?yàn)橐鹊鞍酌覆粌H能分解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間作用還會(huì)分解細(xì)胞膜蛋白等，對(duì)細(xì)胞造成損傷。7.體外培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的兩大類(lèi)：（1）能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增殖。（2）大多數(shù)需要貼附于某些基質(zhì)表面才能生長(zhǎng)增殖（細(xì)胞貼壁）。8.兩類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)（1）懸浮生長(zhǎng)類(lèi)：會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻。（2）貼壁生長(zhǎng)類(lèi)：除會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻外，還會(huì)發(fā)生接觸抑制。9.“細(xì)胞增殖到互相接觸的時(shí)候，糖蛋白識(shí)別了這種信息，就會(huì)使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖，出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象”試結(jié)合上述解釋?zhuān)e例說(shuō)明哪種細(xì)胞最可能無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，并闡述原因：癌細(xì)胞，癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上糖蛋白等物質(zhì)減少。11．原代培養(yǎng)（1）原代培養(yǎng)：通常將分瓶之前的細(xì)胞培養(yǎng)，即指動(dòng)物組織經(jīng)處理后的初次培養(yǎng)。（2）原代培養(yǎng)的具體做法：將初次制備好的細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)。13．傳代培養(yǎng)（1）傳代培養(yǎng)：將分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)。（2）分瓶傳代培養(yǎng)的具體做法:①收集細(xì)胞a.懸浮生長(zhǎng)類(lèi)：直接用離心法收集。b.貼壁生長(zhǎng)類(lèi)：重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個(gè)細(xì)胞，然后再用離心法收集。②將收集的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分瓶培養(yǎng)。14.為什么動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中需分瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)？細(xì)胞會(huì)因細(xì)胞密度過(guò)大、有害代謝物積累和培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等因素而分裂受阻，貼壁細(xì)胞還會(huì)發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象。15.離心的作用：在沉淀中得到細(xì)胞，同時(shí)去掉上清液中的胰蛋白酶。17.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有沒(méi)有體現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的全能性？未體現(xiàn)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)只是細(xì)胞增殖的過(guò)程。18.正常細(xì)胞不能一直傳代培養(yǎng)下去；細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一般傳至10代后就不易傳下去，這時(shí)細(xì)