71.100.70C2682Y42

T/SHRH

023-2019________________________________________________________________________________________

test

cosmetics

In

vitro

skin

test

T/SHRH

023-2019 前言…………… 21

32.

規(guī)范性引用文件………… 33.

術(shù)語(yǔ)、定義……………… 34.

試驗(yàn)原則………………… 35.

試劑及儀器設(shè)備………… 36.

試驗(yàn)步驟………………… 47.

結(jié)果計(jì)算………………… 58.

質(zhì)量控制………………… 59.

結(jié)果判定………………… 6附錄

A

7T/SHRH

023-2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T1.1-2009

給出規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。公司、上海創(chuàng)元化妝品有限公司、福建片仔癀化妝品有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海綠瑞生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李瀟、張艷云、韓波、曹平、陳田、陳靜、聶菁、曾四立、吳梅芳、陳貞明、謝阿貴、廖峰、姜春鵬、趙奕竹、馬驍、王飛飛、李瓊、金堅(jiān)、陳亦華。T/SHRH

023-2019化妝品屏障功效測(cè)試

體外重組

表皮模型測(cè)試方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種基于體外重組

表皮模型的化妝品原料及成品的屏障功效測(cè)試方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有屏障提升作用的化妝品原料及駐留型化妝品成品的屏障功效性測(cè)試，不適用于洗去型化妝品。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

化學(xué)品

體外皮膚腐蝕

人體皮膚模型試驗(yàn)方法化妝品安全技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)、定義3.1

viability測(cè)定細(xì)胞群體總活力的指標(biāo)

[如細(xì)胞線粒體脫氫酶還原活性染料噻唑藍(lán)（3-（4，5-二甲基噻唑），5-二苯基四氮唑溴鹽，MTT]總數(shù)和活性細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。3.2

半數(shù)有效時(shí)間

，ET待測(cè)物在固定濃度下導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低

50％所需的暴露時(shí)間。3.3

吸光度

optical

OD種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成正比關(guān)系。4 試驗(yàn)原則4.1

3D

表皮模型（EpiKutis?），具有表皮的復(fù)層化結(jié)構(gòu)（基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層）和屏障功能。刺激物十二烷基硫酸鈉（）接觸模型，造成皮膚屏障與模型組織的損傷。4.2

屏障提升功效是通過一系列的物理、生物化學(xué)的作用，提升皮膚活細(xì)胞層與角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)功能，達(dá)到提升皮膚屏障功能的作用。的提升作用。5 試劑及儀器設(shè)備5.1

試劑和材料5.1.1

體外重組

表皮模型（?）。T/SHRH

023-20195.1.2

體外重組

表皮模型培養(yǎng)液（EpiGrowth

培養(yǎng)液）。5.1.3

磷酸鹽緩沖液（PBS）。5.1.4

X-100

(1%，V/V)。5.1.5

（CAS

）。5.1.6

異丙醇。5.1.7

陰性對(duì)照：十二烷基硫酸鈉（0.2%

）。5.1.8

陽(yáng)性對(duì)照：WY14643（α

激活劑）。5.2

儀器和設(shè)備5.2.1

移液器：

活塞排代式移液器及相應(yīng)吸頭，20μL~200μL、100μL~1000μL

移液器及相應(yīng)吸頭。5.2.2

培養(yǎng)箱：37℃±1℃，（5±1），95%相對(duì)濕度。5.2.3 酶標(biāo)儀：570nm。5.2.4 超凈工作臺(tái)。5.2.5 水平振蕩儀。5.2.6 分析天平（精度

）。6 試驗(yàn)步驟6.1

對(duì)照設(shè)置

9

ET測(cè)定中設(shè)置了

3

個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)

3

個(gè)模型重復(fù)，總計(jì)

9

個(gè)模型）。6.2

測(cè)試準(zhǔn)備陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的工作液按照附錄

A

配制。6.3

待測(cè)物預(yù)處理吸取

200μL

溶液（）和

μL

待測(cè)物置于

1.5mL

離心管中，旋渦混勻。6.4

模型準(zhǔn)備根據(jù)試驗(yàn)組別及模型數(shù)量，準(zhǔn)備

6

孔板，并在相應(yīng)孔中添加

的

EpiGrowth

培養(yǎng)液。6.5

化妝品成品給藥方式對(duì)陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，吸取

25μL

溶液（0.2%）涂抹于模型表面。對(duì)待測(cè)物組，吸取25μL

EpiGrowth

培養(yǎng)液中添加

μMWY14643。

6

孔板轉(zhuǎn)移到

培養(yǎng)箱中孵育

24h（℃、、95%相對(duì)濕度）。化妝品原料給藥方式對(duì)陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和待測(cè)物組，吸取

25μL

溶液（0.2%）涂抹于模型表面。對(duì)待測(cè)物組，需在

EpiGrowth

培養(yǎng)液中添加相應(yīng)濃度的待測(cè)物。對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組，需在

EpiGrowth

加

50μM

6

孔板轉(zhuǎn)移到

培養(yǎng)箱中孵育

24h（37±1℃、、相對(duì)濕度）。6.6

T/SHRH

023-2019模型孵育培養(yǎng)結(jié)束后，開始清洗程序。用無(wú)菌

PBS

溶液重復(fù)清洗模型表面

次，去除殘留的待測(cè)物。用無(wú)菌棉簽輕輕拭去模型內(nèi)、外殘留液體，放入新標(biāo)記的

6

孔板中，并在每孔中加入

EpiGrowth

培養(yǎng)液，用于

測(cè)定。6.7

測(cè)定：各組模型表面滴加

80μL

1%

，孵育時(shí)間設(shè)定為

0h，1h，3h，其中孵育時(shí)間設(shè)置為

0h的模型，不進(jìn)行給藥。模型孵育結(jié)束后，開始清洗程序。用無(wú)菌

PBS

溶液重復(fù)清洗模型表面

10

次，去除殘留的。每個(gè)模型的清洗總時(shí)間控制在

1~2

。根據(jù)模型總數(shù)量準(zhǔn)備

24

孔板，并向每孔加入

的

MTT

工作液。將模型轉(zhuǎn)移至

24

孔板中，置于

培養(yǎng)箱中（℃、

、95%相對(duì)濕度），孵育

。MTT

液器吸棄

溶液，加入

300μLPBS

溶液，清洗模型外表面，重復(fù)此清洗過程

3

次。將模型外表面用無(wú)菌棉簽擦干，轉(zhuǎn)移到新的

24

孔板中，在模型內(nèi)加入

2mL

異丙醇。用封口膜密封

24

孔板，于

4℃靜置過夜或在水平震蕩器上常溫震搖

。從每孔中吸取

2

份

200μL

96

零對(duì)照，酶標(biāo)儀

570nm

波長(zhǎng)讀取吸光度（OD）值。7 結(jié)果計(jì)算7.1

7.1.1

陽(yáng)性對(duì)照組：陽(yáng)性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)組織活力=（陽(yáng)性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

值）/（陽(yáng)性對(duì)照

0h

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

。7.1.2

陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)組織活力=（陰性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

值）/（陰性對(duì)照

0h

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

。7.1.3

空白對(duì)照組：空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)組織活力=（空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

值）/（空白對(duì)照

0h

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

。7.1.4

=（待測(cè)物組各時(shí)間點(diǎn)

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

/（待測(cè)物組

0h

OD

值-調(diào)零對(duì)照

OD

值）。7.1.5

ET值計(jì)算以各組組織活力鄰近

50%左右的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)組織活力為縱坐標(biāo)，繪制折線圖，計(jì)算線性回歸方程。根據(jù)公式，計(jì)算組織活力為

時(shí)，對(duì)應(yīng)的時(shí)間，即為該組的

8 質(zhì)量控制8.1

基本原則：每批次試驗(yàn)均需設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。試驗(yàn)中設(shè)置的各種對(duì)照應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)。如任一種對(duì)照出現(xiàn)非下述標(biāo)準(zhǔn)，則視為質(zhì)控不合格。8.2

陰性對(duì)照組：與空白對(duì)照組相比，模型組織活力（0h）下調(diào)

以上。同一孵育時(shí)間下三個(gè)重復(fù)模型組織活力標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

。8.3

陽(yáng)性對(duì)照組：與陰性對(duì)照組相比，模型組織活力（0h）上調(diào)

15%以上。同一孵育時(shí)間下三個(gè)重復(fù)模型組織活力標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

。T/SHRH

023-20198.4

待測(cè)物組：同一孵育時(shí)間下三個(gè)重復(fù)模型組織活力標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于等于

18%。9 結(jié)果判定以下條件說(shuō)明待測(cè)物具有屏障提升功效:與陰性對(duì)照組相比，待測(cè)物

0h

OD

值上調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；與陰性對(duì)照組相比，待測(cè)物

值升高；如待測(cè)物滿足上述部分條件，仍可說(shuō)明待測(cè)物具有屏障提升功效。T/SHRH

023-2019附錄

A（資料性附錄）1. 陰性對(duì)照組母液的配制用分析天平稱取

0.2g

，溶于

PBS，配制成

母液，使用前需用

0.22μm

濾膜過濾。2. 陰性對(duì)照組工作液配制用移液器吸取

25μL4%SLS

母液，