中藥活性成分抑制耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的：探究中藥活性成分連翹脂苷-A、木犀草素、蜂毒素對(duì)臨床耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果。方法：取8株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌（標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17978作為對(duì)照），應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測(cè)10種抗生素的藥物敏感性；挑選其中4株臨床分離株和ATCC17978應(yīng)用微量肉湯稀釋法檢測(cè)中藥活性成分的最低抑菌濃度（MIC）；棋盤(pán)法檢測(cè)中藥活性成分和抗生素聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同抑菌效果；結(jié)晶紫染色法篩選生物膜形成能力較強(qiáng)的分離株，挑選其中1株，利用PCR檢測(cè)其生物膜形成相關(guān)基因，檢測(cè)中藥活性成分對(duì)其生物膜形成能力的影響，平板菌落計(jì)數(shù)測(cè)定其對(duì)蜂毒素的劑量依賴(lài)性曲線。結(jié)果：藥敏結(jié)果顯示8株臨床分離株藥敏對(duì)10種抗生素均為耐藥，ATCC17978對(duì)10種抗生素均為敏感；根據(jù)藥敏結(jié)果挑選其中4株臨床分離株和ATCC17978做中藥活性成分的最小抑菌濃度測(cè)定，MIC結(jié)果顯示連翹脂苷-A的MIC＞229μg/mL、木犀草素的MIC＞200μg/mL、蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL,MIC(ATCC17978)=4μg/mL；單獨(dú)抑菌效果顯示連翹脂苷-A、木犀草素對(duì)4株臨床耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌效果不明顯，蜂毒素有明顯抑菌效果；生物膜形成能力相關(guān)的基因結(jié)果顯示AB2菌株含有OMPA、BAP、pgaA和pgaC；生物膜形成能力結(jié)果顯示連翹脂苷-A、木犀草素單獨(dú)使用沒(méi)有明顯抑制效果，蜂毒素單獨(dú)使用能明顯地抑制生物膜形成能力。結(jié)論：中藥活性成分蜂毒素可以有效抑制臨床耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。關(guān)鍵詞：鮑曼不動(dòng)桿菌；最低抑菌濃度（MIC）；中藥活性成分；生物膜；PCRExperimentalstudyontheinhibitoryeffectofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineondrμg-resistantAcinetobacterbaumanniiAbstractObjective:ToinvestigatetheinhibitoryeffectoftheactiveingredientsoftraditionalChinesemedicine,suchasforsythiaglycosideA,luteolin,andmelittin,onclinicallyresistantAcinetobacterbaumannii.Methods:Take8clinicallyisolatedAcinetobacterbaumanniistrains(standardstrainATCC17978ascontrol)andusemicrobrothdilutionmethodtodetectthedrμgsensitivityof10antibiotics;FourclinicalisolatesandATCC17978wereselectedtodetecttheminimuminhibitoryconcentration(MIC)ofactiveingredientsintraditionalChinesemedicineusingmicrobrothdilutionmethod;CheckerboardmethodfordetectingthesynergisticantibacterialeffectofthecombinationofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineandantibiotics;Crystalvioletstainingmethodwasusedtoscreenstrainswithstrongbiofilmformationability.Onestrainwasselected,anditsbiofilmformationrelatedgenesweredetectedusingPCR.TheinfluenceofactiveingredientsoftraditionalChinesemedicineonitsbiofilmformationabilitywastested,andthedosedependentcurveofmelittinwasdeterminedbyplatecolonycounting.Results:Thedrμgsensitivityresultsshowedthat8clinicalisolateswereresistanttoall10antibiotics,whileATCC17978wassensitivetoall10antibiotics;Accordingtothedrμgsensitivityresults,4clinicalisolatesandATCC17978wereselectedforthedeterminationoftheminimuminhibitoryconcentrationoftheactiveingredientsintraditionalChinesemedicine.TheMICresultsshowedthattheMICofforsythiaglycosideAwas>229μg/mL,theMICofluteolinwas>200μg/mL,andtheMICofmelittinwas=4μG/mLand2μg/mL,MIC(ATCC17978)=4μG/mL;TheindividualantibacterialeffectshowedthatforsythiaglycosideAandluteolinhadnosignificanteffectonthefourclinicallyresistantAcinetobacterbaumanniistrains,whilemelittinhadasignificantantibacterialeffect;ThegeneresultsrelatedtobiofilmformationabilityshowedthatAB2straincontainsOMPA,BAP,pgaA,andpgaC;TheresultsofbiofilmformationabilityshowedthattheuseofforsythiaglycosideAandluteolinalonedidnothaveasignificantinhibitoryeffect,whilemelittinalonecouldsignificantlyinhibitbiofilmformationability.Conclusion:TheactiveingredientoftraditionalChinesemedicine,melittin,caneffectivelyinhibitclinicaldrμg-resistantAcinetobacterbaumannii.Keywords:Acinetobacterbaumannii;MIC;ActiveingredientsoftraditionalChinesemedicine;Biofilm;PCR前言鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii）是一種嚴(yán)格需氧、過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性、氧化酶陰性、非運(yùn)動(dòng)性葡萄糖非發(fā)酵性的革蘭陰性球桿菌，可引起免疫功能低下或危重癥患者的醫(yī)院獲得性感染，尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）環(huán)境中的危重患者中ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1,2]。近年來(lái)，臨床分離的多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌愈發(fā)多見(jiàn)，為臨床治療該病原體感染造成極大困難，其廣泛的抗生素耐藥性譜，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)界拉響警報(bào)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Howard</Author><Year>2012</Year><RecNum>79</RecNum><DisplayText>[2]</DisplayText><record><rec-number>79</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685175277">79</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Howard,A.</author><author>O'Donoghue,M.</author><author>Feeney,A.</author><author>Sleator,R.D.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiologicalSciences,CorkInstituteofTechnology,Bishopstown,Cork,Ireland.</auth-address><titles><title>Acinetobacterbaumannii:anemergingopportunisticpathogen</title><secondary-title>Virulence</secondary-title></titles><periodical><full-title>Virulence</full-title></periodical><pages>243-50</pages><volume>3</volume><number>3</number><edition>2012/05/02</edition><keywords><keyword>AcinetobacterInfections/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword><keyword>Acinetobacterbaumannii/drugeffects/*pathogenicity</keyword><keyword>CommunicableDiseases,Emerging/drugtherapy/epidemiology/microbiology</keyword><keyword>CrossInfection/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple,Bacterial</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Incidence</keyword><keyword>OpportunisticInfections/drugtherapy/*epidemiology/*microbiology</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>May1</date></pub-dates></dates><isbn>2150-5594(Print) 2150-5594</isbn><accession-num>22546906</accession-num><urls></urls><custom2>PMC3442836</custom2><electronic-resource-num>10.4161/viru.19700</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[2]。鮑曼不動(dòng)桿菌具有多種耐藥機(jī)制，包括β-內(nèi)酰胺酶、外排泵、通透性缺陷和靶位點(diǎn)修飾，這些耐藥機(jī)制的積累使得可用于治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的抗生素種類(lèi)不斷減少ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3]。使得鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)關(guān)鍵因素是它們具有強(qiáng)大的形成生物膜的能力。生物膜為其提供了足夠的保護(hù)，使其免受惡劣條件的侵害，并進(jìn)一步發(fā)展慢性感染ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]。OmpA、Bap、pgaA、pgaC等基因均與生物膜形成相關(guān)。OmpA在促進(jìn)鮑曼不動(dòng)桿菌粘附、侵襲和生物膜的形成以及隨后宿主上皮細(xì)胞凋亡等免疫反應(yīng)方面的作用至關(guān)重要ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5]。有研究表明，在饑餓等不利環(huán)境下OmpA表達(dá)有所下調(diào)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[6]；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Hfq的表達(dá)與OmpA的表達(dá)水平密切相關(guān)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]；在某些抗生素的亞抑菌濃度能夠促進(jìn)鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA的表達(dá)以及生物膜的形成ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8,9]。這些因素都能夠影響OmpA的表達(dá)調(diào)節(jié)，還有更多未知的調(diào)節(jié)機(jī)制亟待探索。生物膜相關(guān)蛋白（Bap）是一種在鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞表面大量表達(dá)的蛋白質(zhì)，是生物膜形成的關(guān)鍵因素，能夠增加對(duì)人體細(xì)胞的黏附用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10,11]。Bap基因的存在與鮑曼不動(dòng)桿菌分離株生物膜的形成之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Fallah</Author><Year>2017</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText>[12]</DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685202944">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Fallah,A.</author><author>Rezaee,M.A.</author><author>Hasani,A.</author><author>Barhaghi,M.H.S.</author><author>Kafil,H.S.</author></authors></contributors><auth-address>ImmunologyResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. StudentResearchCommittee,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. InfectiousandTropicalDiseasesResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. DepartmentofMicrobiology,FacultyofMedicine,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran. DrugAppliedResearchCenter,TabrizUniversityofMedicalSciences,Tabriz,Iran.</auth-address><titles><title>FrequencyofbapandcpaAvirulencegenesindrugresistantclinicalisolatesofAcinetobacterbaumanniiandtheirroleinbiofilmformation</title><secondary-title>IranJBasicMedSci</secondary-title></titles><periodical><full-title>IranJBasicMedSci</full-title></periodical><pages>849-855</pages><volume>20</volume><number>8</number><edition>2017/11/01</edition><keywords><keyword>Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>Antibioticresistance</keyword><keyword>Bap</keyword><keyword>Biofilm</keyword><keyword>CpaA</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Aug</date></pub-dates></dates><isbn>2008-3866(Print) 2008-3866</isbn><accession-num>29085575</accession-num><urls></urls><custom2>PMC5651469</custom2><electronic-resource-num>10.22038/ijbms.2017.9105</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[12]。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成為鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其主要成分多聚β1-6-N-乙酰氨基葡萄糖胺（PNAG）受pgaABC基因序列的編碼調(diào)控，ECM合成的缺失會(huì)影響鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>向軍</Author><Year>2011</Year><RecNum>97</RecNum><DisplayText>[13]</DisplayText><record><rec-number>97</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685203937">97</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>向軍</author><author>孫珍</author><author>宋菲</author><author>郇京寧</author></authors><translated-authors><author>XiangJun</author><author>S.U.N.Zhen</author><author>SongFei</author><author>HuanJing-ning</author></translated-authors></contributors><titles><title>燒傷患者鮑氏不動(dòng)桿菌pgaABC基因簇表達(dá)及生物膜表型變化</title><secondary-title>中華燒傷雜志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中華燒傷雜志</full-title></periodical><pages>100-103</pages><number>02</number><keywords><keyword>燒傷；感染；鮑氏不動(dòng)桿菌；基因；生物膜</keyword></keywords><dates><year>2011</year></dates><urls><related-urls><url>/ss201102/53780.htm</url></related-urls></urls><remote-database-provider>《中華醫(yī)學(xué)雜志》社有限責(zé)任公司</remote-database-provider><language>chi</language></record></Cite></EndNote>[13]。由于耐多藥鮑曼不動(dòng)桿菌的廣泛傳播對(duì)公共衛(wèi)生具有重要意義，世界衛(wèi)生組織（WHO）已于2017將該病原體置于優(yōu)先研發(fā)活性抗生素名單的首位ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lima</Author><Year>2023</Year><RecNum>99</RecNum><DisplayText>[14]</DisplayText><record><rec-number>99</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685204464">99</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lima,W.G.</author><author>deLima,M.E.</author></authors></contributors><auth-address>ProgramadePósGradua??oemMedicina-Biomedicina,FaculdadeSantaCasadeBeloHorizonte,BeloHorizonte30150-250,MG,Brazil.</auth-address><titles><title>TherapeuticProspectionofAnimalVenoms-DerivedAntimicrobialPeptidesagainstInfectionsbyMultidrug-ResistantAcinetobacterbaumannii:ASystematicReviewofPre-ClinicalStudies</title><secondary-title>Toxins(Basel)</secondary-title></titles><periodical><full-title>Toxins(Basel)</full-title></periodical><volume>15</volume><number>4</number><edition>2023/04/27</edition><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>*Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>AntimicrobialPeptides</keyword><keyword>*AcinetobacterInfections/drugtherapy/microbiology</keyword><keyword>Anti-BacterialAgents/pharmacology/therapeuticuse/chemistry</keyword><keyword>*ArthropodVenoms/pharmacology</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple,Bacterial</keyword><keyword>MicrobialSensitivityTests</keyword><keyword>Acinetobacterbaumannii</keyword><keyword>antimicrobialdevelopment</keyword><keyword>anura</keyword><keyword>arthropods</keyword><keyword>melittin</keyword><keyword>pneumonia</keyword><keyword>systemicinfection</keyword><keyword>venom</keyword><keyword>wound</keyword></keywords><dates><year>2023</year><pub-dates><date>Apr3</date></pub-dates></dates><isbn>2072-6651</isbn><accession-num>37104206</accession-num><urls></urls><custom2>PMC10143903</custom2><electronic-resource-num>10.3390/toxins15040268</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[14]。中醫(yī)是中華民族的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，歷經(jīng)上千年的沉淀，具有獨(dú)屬于自己的完整理論體系。同時(shí)，中藥材相較于抗生素，擁有毒副用有限、不易產(chǎn)生耐藥性、國(guó)內(nèi)資源豐富等優(yōu)點(diǎn)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15]。在多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的嚴(yán)峻情況下，抗菌肽（AMP）的應(yīng)用是一條新的途徑ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[16-18]。AMP有植物、動(dòng)物、真菌等多種來(lái)源，本研究抗菌肽源于蜜蜂毒液中提取的蜂毒素——由26種氨基酸組成的多肽，該多肽N端區(qū)域有+4個(gè)電荷，C端有+2個(gè)電荷，在生理pH下總共產(chǎn)生+6個(gè)電荷ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]。小兒青翹顆粒具有較好的廣譜抑菌活性，能抑制鮑曼不動(dòng)桿菌等多種常見(jiàn)呼吸道病原菌的生長(zhǎng)，組方為為山銀花，連翹，粉葛，大青葉，山豆根，柴胡，甘草ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[20,21]。其中連翹有清熱解毒之效，其有效活性成分連翹脂苷-A具有許多藥理活性，抗菌、抗氧化、抗病毒、抗炎、神經(jīng)保護(hù)，腎組織保護(hù)，肺組織保護(hù)和肝組織保護(hù)等ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22,23]。連翹脂苷-A對(duì)銅綠假單胞菌、嗜水氣假單胞菌等革蘭陰性菌有較明顯抗菌用，鮑曼不動(dòng)桿菌同為革蘭陰性菌，連翹脂苷-A能否有效抑制尚未可知。金銀花中可提取木犀草素，木犀草素是常見(jiàn)的黃酮之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗凋亡、抗過(guò)敏、抗糖尿病、化療、心臟保護(hù)和神經(jīng)保護(hù)特性ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>López-Lázaro</Author><Year>2009</Year><RecNum>109</RecNum><DisplayText>[24]</DisplayText><record><rec-number>109</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685245731">109</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>López-Lázaro,M.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofPharmacology,FacultyofPharmacy,UniversityofSeville,Spain.C/ProfesorGarciaGonzalez,41011,Sevilla,Spain.mlopezlazaro@us.es</auth-address><titles><title>Distributionandbiologicalactivitiesoftheflavonoidluteolin</title><secondary-title>MiniRevMedChem</secondary-title></titles><periodical><full-title>MiniRevMedChem</full-title></periodical><pages>31-59</pages><volume>9</volume><number>1</number><edition>2009/01/20</edition><keywords><keyword>Anti-InfectiveAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Anti-InflammatoryAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>AntineoplasticAgents/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Antioxidants/metabolism/pharmacology</keyword><keyword>Flavonoids/chemistry/pharmacology</keyword><keyword>Luteolin/chemistry/*pharmacology</keyword><keyword>Plants,Medicinal/chemistry</keyword></keywords><dates><year>2009</year><pub-dates><date>Jan</date></pub-dates></dates><isbn>1389-5575(Print) 1389-5575</isbn><accession-num>19149659</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.2174/138955709787001712</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[24]。目前，木犀草素的用研究多聚焦于其抗炎作用。

一、實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)菌株江蘇省盱眙縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收集臨床標(biāo)本分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，共8株。（二）實(shí)驗(yàn)試劑試劑、耗材廠家氯化鈉北京索萊寶科技有限公司胰蛋白胨OXOID瓊脂GMATE酵母提取物OXOID瓊脂糖Bioweste2×TaqPlusMasterMix南京諾唯贊生物科技股份有限公司96孔聚苯乙烯板無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司Goldview核酸染料生物工程(上海)股份有限公司MH培養(yǎng)基杭州濱和微生物試劑有限公司連翹脂苷-A阿拉丁生化科技股份有限公司木犀草素阿拉丁生化科技股份有限公司蜂毒素阿拉丁生化科技股份有限公司DL2000PIusDNAMarker南京諾唯贊生物科技股份有限公司抗生素：哌拉西林、替卡西林、頭孢他啶、美羅培南、多粘菌素E、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星購(gòu)買(mǎi)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；環(huán)丙沙星購(gòu)買(mǎi)自上海源葉生物科技有限公司。（三）實(shí)驗(yàn)儀器儀器廠家純水儀ULUP-Ⅲ-5T四川優(yōu)普超純科技有限公司立式高壓蒸汽滅菌鍋日本TOMY公司生物安全柜美國(guó)Thermo公司DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司恒溫?fù)u床德國(guó)Eppendorf公司PCR儀美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司電泳儀美國(guó)Bio-RAD公司全自動(dòng)凝膠成像儀英國(guó)SYNGENE公司細(xì)菌比濁儀英國(guó)OXOID公司微波爐格蘭仕集團(tuán)微量移液器賽默飛世爾科技公司冰箱（4℃和-20℃）海爾集團(tuán)多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Biotek公司（四）主要試劑配制LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，加入1.5%瓊脂。121℃，20min高壓滅菌。MH肉湯培養(yǎng)基：稱(chēng)取MH肉湯干粉10.5g，向其中加入500mL雙蒸水，121℃，0.15Mpa，20min高壓蒸汽滅菌。取出冷卻至室溫后，于4℃冰箱中冷藏備用。1%瓊脂糖凝膠：將0.4g瓊脂糖粉末溶于40mL1×TAE緩沖液中，微波爐加熱溶解，待冷卻片刻后加入4μlGoldView核酸染料，混勻后倒入制膠槽，待瓊脂糖凝固后備用。PBS緩沖液：將8gNaCl,2.9gNa2HPO4.H2O,0.2gKCL,0.24gKH2PO4,加入900mL超純水中溶解后，調(diào)節(jié)PH至7.4后，用超純水定容至1L，高壓備用。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.3-7.4。121℃，20min高壓滅菌。連翹脂苷-A溶液配制：10mg連翹脂苷-A粉末溶于1mLDMSO中，充分溶解，過(guò)濾除菌后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。木犀草素溶液配制?1.6mg木犀草素粉末溶于1mL乙醇中，充分溶解，過(guò)濾除菌后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。蜂毒素溶液配制?mg蜂毒素粉末溶于1mL高壓滅菌過(guò)得超純水中，充分溶解，過(guò)濾除菌后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆??？股厝芤号渲疲哼呃髁峙渲瞥?0mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，替卡西林配制?00mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，頭孢他啶配制成100mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，美羅培南配制成32mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，多粘菌素E配制成100mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，慶大霉素配制成100mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，妥布霉素配制?00mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，四環(huán)素配制成64mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，左氧氟沙星配制?00mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，環(huán)丙沙星配制成64mg/mL-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。二、?shí)驗(yàn)方法（一）藥敏試驗(yàn)菌液制備：從-80℃低溫冰箱取出凍存的鮑曼不動(dòng)桿菌菌種。于冰上解凍后在生物安全柜中，接種環(huán)蘸取少量菌液，四區(qū)劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)箱孵育18-24h。取復(fù)蘇后的細(xì)菌平板，挑取單克隆于2mLLB液體培養(yǎng)基中，然后將其置于37℃，200rmp恒溫?fù)u床中過(guò)夜培養(yǎng)。移液槍取20ul過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種于2mLMH肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)增，在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng),直至OD600為0.5，用MH液體培養(yǎng)基將其稀釋至1×106CFU/mL備用。藥液制備：用MH液體培養(yǎng)基將哌拉西林、替卡西林、頭孢他啶、氨曲南、美羅培南、多粘菌素E、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星稀釋成濃度分別為1024μg/mL、1024μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、64μg/mL、512μg/mL、512μg/mL、128μg/mL和512μg/mL。微量肉湯稀釋法：96孔聚苯乙烯板第1-7行每孔加入100ulMH培養(yǎng)基，再向第1行加入配制100ul的抗生素以及中藥母液，排槍依次倍比稀釋至第7行，棄去100ul，每種抗生素做3個(gè)復(fù)孔。第8行，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各3個(gè)復(fù)孔，陰性孔加入200ulMH液體培養(yǎng)基，陽(yáng)性孔加入100ulMH液體培養(yǎng)基和100ul菌懸液。除陰性對(duì)照外，各孔加入100ul配備好的菌懸液（終濃度為1×105CFU/mL），封口膜封口，置于37℃溫箱中孵育18-20h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照組澄清透亮，陽(yáng)性對(duì)照組渾濁或有菌沉淀，并根據(jù)CLSIM100文件判斷確定MIC。（二）臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌的中藥活性成分的最小抑菌濃度（MIC）用MH液體培養(yǎng)基制備1×106CFU/mL的菌懸液備用。用MH液體培養(yǎng)基將連翹脂苷-A、木犀草素和蜂毒素稀釋成濃度分別為229μg/mL、200μg/mL和16μg/mL。微量肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度。（三）中藥活性成分與常見(jiàn)抗生素聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)棋盤(pán)法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>張肖冰</Author><Year>2017</Year><RecNum>132</RecNum><DisplayText>[25]</DisplayText><record><rec-number>132</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685718387">132</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>張肖冰</author><author>楊事達(dá)</author><author>姚志成</author><author>單風(fēng)平</author></authors></contributors><auth-address>中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;遼寧省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科;遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;</auth-address><titles><title>替加環(huán)素與5種抗生素對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)的研究</title><secondary-title>微生物學(xué)雜志</secondary-title></titles><periodical><full-title>微生物學(xué)雜志</full-title></periodical><pages>82-87</pages><volume>37</volume><number>05</number><keywords><keyword>鮑曼不動(dòng)桿菌</keyword><keyword>替加環(huán)素</keyword><keyword>聯(lián)合用藥</keyword><keyword>FIC</keyword></keywords><dates><year>2017</year></dates><isbn>1005-7021</isbn><call-num>21-1186/Q</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[25]：用MH液體培養(yǎng)基制備1×106CFU/mL的菌懸液備用。取96孔聚苯乙烯板，縱向(A～H)為加入中藥藥液的升梯度方向，橫向(1～8)為加入抗生素溶液的降梯度方向。每孔分別加入50μL中藥藥液和50μL抗生素溶液后，再加入100μL菌懸液，混勻后，第11列4個(gè)復(fù)孔加200ulMH液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，第12列4個(gè)復(fù)孔加入100ulMH液體培養(yǎng)基和100ul菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，封口膜封口，置于37℃培養(yǎng)箱孵育18-20h，用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在595nm處的吸光度，計(jì)算平均光密度值。分?jǐn)?shù)抑制濃度（FIC）指數(shù)公式計(jì)算：FIC=（MIC藥物A聯(lián)合/MIC藥物A單獨(dú)）+（MIC藥物B聯(lián)合/MIC藥物B單獨(dú)）。FIC指數(shù)對(duì)應(yīng)藥物相互作用的類(lèi)型：協(xié)同作用，值n≤0.5部分協(xié)同作用，值0.5<n<1加性效應(yīng)，值n=1無(wú)差別效果，對(duì)于值1<n<4拮抗作用，值為4≤nADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Year>2019</Year><RecNum>128</RecNum><DisplayText>[26]</DisplayText><record><rec-number>128</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685440903">128</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>HighlySynergisticEffectsofMelittinwithConventionalAntibioticsAgainstMultidrug-ResistantIsolatesofAcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosa</title><secondary-title>MicrobialDrugResistance</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobialDrugResistance</full-title></periodical><pages>193-202</pages><volume>25</volume><number>2</number><keywords><keyword>burninfections,melittin,antibiotic,synergism,Acinetobacterbaumannii,Pseudomonasaeruginosa</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><accession-num>30281385</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/abs/10.1089/mdr.2018.0016</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1089/mdr.2018.0016</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]。（四）鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力的檢測(cè)結(jié)晶紫染色法：用MH液體培養(yǎng)基制備1×106CFU/mL的菌懸液備用。取96孔聚苯乙烯板孔，每株菌每孔200μL，做3個(gè)復(fù)孔，封口膜封口，置于37℃恒溫孵育24h，棄上清后用200ul的PBS輕柔清洗每孔兩次，加入0.5％結(jié)晶紫染色避光37℃孵育30min，PBS沖洗2次，最終加入95％乙醇脫色，37℃干燥后用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在595nm處的吸光度，讀取光密度（D）值。取其3次D平均值的均值為該菌株最終D值，以鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978為生物被膜形成陽(yáng)性對(duì)照菌株，MH液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照（均一式3孔）。生物被膜形成能力定量-定性判讀標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)定陰性對(duì)照（培養(yǎng)液）D值，以其平均D+3S定義為Dc，將待測(cè)菌株最終D與Dc進(jìn)行比較分為4類(lèi)：陰性（-）：D≤Dc；弱陽(yáng)性（1+）：Dc＜D≤2Dc；陽(yáng)性（2+）：2Dc＜D≤4Dc；強(qiáng)陽(yáng)性（3+）：D＞4DcADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>尹珍</Author><Year>2018</Year><RecNum>133</RecNum><DisplayText>[27]</DisplayText><record><rec-number>133</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685722752">133</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>尹珍</author><author>黃文祥</author><author>楊均均</author><author>李佳俊</author><author>劉成偉</author></authors></contributors><auth-address>重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科;</auth-address><titles><title>耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌流行克隆株生物被膜形成能力分析</title><secondary-title>中國(guó)感染與化療雜志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中國(guó)感染與化療雜志</full-title></periodical><pages>184-189</pages><volume>18</volume><number>02</number><keywords><keyword>鮑曼不動(dòng)桿菌</keyword><keyword>碳青霉烯類(lèi)耐藥</keyword><keyword>流行克隆</keyword><keyword>多位點(diǎn)序列分型</keyword><keyword>生物被膜</keyword></keywords><dates><year>2018</year></dates><isbn>1009-7708</isbn><call-num>31-1965/R</call-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.16718/j.1009-7708.2018.02.010</electronic-resource-num><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[27]。（五）PCR測(cè)定生物膜相關(guān)基因1、引物設(shè)計(jì)菌株基因序列(5'to3')長(zhǎng)度(bp)退火溫度（℃）OMPA-FGTCGTCCCCGCCTTCCT102358℃OMPA-RAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAB2BAP-FGGCAGCCGCATCTGTTAATG85052℃BAP-RCAAAGCGTGCCTGCGTATTTpgaA-FCCATAGCTATCTGGCAGCCC61856℃pgaA-RAAAACGGCCAAAGGAATGCCpgaC-FACCAATGACAATGGACGGCT116456℃pgaC-RGCACCGTCATGGGCAAATTT2、反應(yīng)體系成分體積（μl）正向引物F1反向引物R12×TaqPlusMasterMix12.5H2O（調(diào)整終體積至25ul）9.5PCR模板13、PCR擴(kuò)增條件引物OMPA的反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃5min

95℃30s58

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物BAP的反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃5min

95℃30s52

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物pgaA的反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃5min

95℃30s56

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞引物pgaC的反應(yīng)條件溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)95℃5min

95℃30s56

℃60s3572℃30s72℃8min4℃+∞4、瓊脂糖凝膠電泳：準(zhǔn)備洗凈的電泳所需器具，放好梳子。配制1%的瓊脂糖凝膠，室溫下凝固后，小心拔出梳子，并準(zhǔn)備點(diǎn)樣。電泳槽中加入30mL左右的電泳緩沖液，加樣完成的凝膠放入電泳槽中，排出孔內(nèi)氣泡。按照正負(fù)極，接通電源，電壓220v，40min。電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，凝膠成像儀觀察凝膠成像結(jié)果，與marker對(duì)比，確定片段大小。（六）中藥活性成分對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜抑制實(shí)驗(yàn)用MH液體培養(yǎng)基制備1×106CFU/mL的菌懸液備用。取96孔聚苯乙烯板孔，縱向（A-F），每行3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100ulLB液體培養(yǎng)基和100ul菌懸液。加入200ulLB液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，加入100ulLB液體培養(yǎng)基和100ul菌懸液作為陽(yáng)性對(duì)照，陰陽(yáng)對(duì)照組各3個(gè)復(fù)孔，封口后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。24h后，移液槍吸取板內(nèi)菌液，用PBS緩沖液輕柔洗板2次，每行依次加入200ul配制好的6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL藥液，陰陽(yáng)對(duì)照加入200ulLB液體培養(yǎng)基，封口置于37℃培養(yǎng)箱孵育24h。24h后，棄上清后用200ul的PBS輕柔清洗每孔兩次，加入0.5％結(jié)晶紫染色避光37℃孵育30min，PBS沖洗2次，最終加入95％乙醇脫色，37℃干燥后用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品在595nm處的吸光度，計(jì)算平均光密度值。（七））鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)蜂毒素的劑量依賴(lài)曲線測(cè)定從-80℃低溫冰箱取出凍存的鮑曼不動(dòng)桿菌菌種。于冰上解凍后在生物安全柜中，接種環(huán)蘸取少量菌液，四區(qū)劃線法接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在37℃培養(yǎng)箱孵育18-24h。取復(fù)蘇后的細(xì)菌平板，挑取單克隆于2mLLB液體培養(yǎng)基中，然后將其置于37℃，200rmp恒溫?fù)u床中過(guò)夜培養(yǎng)。移液槍取20ul過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種于2mLMH肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)增，在37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng),直至OD600為0.5，用MH液體培養(yǎng)基將其稀釋至1×106CFU/mL備用。蜂毒素配制濃度為6.25μg/mL，依次倍比稀釋為3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL備用。取一塊96孔板，第1-5行依次加入6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.57μg/mL、0.78μg/mL、0.39μg/mL的藥液100ul，第6行加入100ulLB液體培養(yǎng)基，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。陰性對(duì)照將入200ulLB液體培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照加入100ulLB液體培養(yǎng)基和100ul菌懸液，陰陽(yáng)對(duì)照組各3個(gè)復(fù)孔，封口后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。24h后，移液槍吸取板內(nèi)不同濃度菌液100ul，用PBS緩沖液以1:10稀釋后，點(diǎn)滴于LB固體平板上，37℃培養(yǎng)18-20h后計(jì)數(shù)，prism作圖。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）藥敏試驗(yàn)結(jié)果本研究中收集的8株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌均多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，藥敏結(jié)果如表1所示。以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978作為對(duì)照組，8株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)哌拉西林、替卡西林、頭孢他啶、四環(huán)素、美羅培南、慶大霉素及環(huán)丙沙星均表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)多粘菌素E均敏感；其中有4株臨床分離株對(duì)妥布霉素敏感，2株臨床分離株對(duì)左氧氟沙星敏感。表1ATCC17978及8株鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果抗生素ATCC17978AB1AB2AB3AB4AB5AB6AB7AB8哌拉西林SRRRRRRRR替卡西林SRRRRRRRR頭孢他啶SRRRRRRRR四環(huán)素SRRRRRRRR美羅培南SRRRRRRRR多粘菌素ESSSSSSSSS慶大霉素SRRRRRRRR妥布霉素SRRRSSRSS環(huán)丙沙星SRRRRRRRR左氧氟沙星SSIIRRSII（二）中藥活性成分單獨(dú)抑菌結(jié)果根據(jù)表1所示的藥敏結(jié)果，挑選耐藥性較強(qiáng)的4株臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978作為對(duì)照，微量肉湯稀釋法檢測(cè)中藥活性成分單獨(dú)抑菌效果，結(jié)果如表2所示。連翹脂苷-A的MIC＞229μg/mL、木犀草素的MIC＞200μg/mL、蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL，MIC(ATCC17978)=4μg/mL，木犀草素和連翹脂苷-A的單獨(dú)抑菌效果并不明顯，標(biāo)準(zhǔn)ATCC17978對(duì)兩種中藥活性成分也并未表現(xiàn)出敏感性，蜂毒素的單獨(dú)抑菌效果較為顯著。表2中藥活性成分抑制鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏結(jié)果中藥（μg/mL）ATCCAB1AB2AB3AB417978木犀草素＞229＞229＞229＞229＞229連翹酯苷-A＞200＞200＞200＞200＞200蜂毒素42244（三）中藥活性成分聯(lián)合常見(jiàn)抗生素抑制鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥菌株在臨床上愈發(fā)多見(jiàn)，單獨(dú)抗生素的使用已經(jīng)難以達(dá)到理想療效，通常會(huì)根據(jù)感染部位的不同，疊加使用不同抗生素治療，但是其對(duì)人體的毒副作用也是不可忽視的。所以，本研究期望可以通過(guò)中藥活性成分和常見(jiàn)抗生素聯(lián)用，以降低抗抗生素的使用濃度，聯(lián)合用藥的結(jié)果如圖1所示。中藥活性成分與抗生素聯(lián)合用藥的抑菌效果并不明顯，對(duì)照組的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17978的聯(lián)合用藥結(jié)果，主要是抗生素抑制其生長(zhǎng)，并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果；臨床分離株的聯(lián)合用藥效果也不理想，并未達(dá)到預(yù)期目的。圖1中藥活性成分連翹脂苷-A、木犀草素和蜂毒素聯(lián)合常見(jiàn)抗生素抑制AB2的效果（四）生物膜篩選結(jié)果陰性對(duì)照平均D+3S為0.4983+3×0.0377，故在Dc=0.536水平對(duì)挑選出的4株耐藥性較強(qiáng)的臨床分離菌株生物膜形成能力進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。4株臨床分離株中，2株生物膜形成能力弱，另外2株有較強(qiáng)的生物膜形成能力。表34株鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力強(qiáng)弱定性菌株生物膜形成能力陰性弱陽(yáng)性陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性MH*AB1*AB2*AB3*AB4*（五）PCR驗(yàn)證AB2生物膜相關(guān)基因根據(jù)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成能力篩查結(jié)果，挑選具備較強(qiáng)的生物膜形成能力的AB2，檢測(cè)其是否包含與生物膜形成相關(guān)的基因，結(jié)果如圖2所示。臨床分離株AB2包含OMPA、BAP、pgaA、pgaC與生物膜相關(guān)的基因。OmpA能夠促進(jìn)鮑曼不動(dòng)桿菌粘附、侵襲和生物膜的形成；BAP是生物膜形成的關(guān)鍵因素；pgaABC基因序列編碼調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而影響鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的形成。這些基因與鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的形成密切相關(guān)，從而驗(yàn)證了臨床分離株AB2確實(shí)具有較強(qiáng)生物膜形成能力。圖2AB2生物膜相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果（六）中藥活性成分對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜抑制結(jié)果生物膜的形成是鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性發(fā)展的一個(gè)重要因素，鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成能力與鮑曼不動(dòng)桿菌造成的感染性疾病病情加重密切相關(guān)。生物膜形成能力篩查和PCR驗(yàn)證，AB2具備較強(qiáng)的生物膜形成能力，檢測(cè)三種中藥活性成分對(duì)其的生物膜形成能力是否有影響，結(jié)果如圖2所示。木犀草素和連翹脂苷-A抑制AB2生物膜形成的效果不明顯，蜂毒素對(duì)AB2的生物膜形成有明顯的抑制效果。圖3中藥活性成分對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌AB2的生物膜抑制結(jié)果（七）鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)蜂毒素的劑量依賴(lài)曲線測(cè)定蜂毒素能夠抑制AB2生長(zhǎng)，對(duì)AB2的生物膜形成有很好的抑制效果，針對(duì)其對(duì)AB2的抑制效果作時(shí)間依賴(lài)性曲線，如圖所示。圖4鮑曼不動(dòng)桿菌AB2對(duì)蜂毒素的劑量依賴(lài)曲線四、討論鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性問(wèn)題已然成為現(xiàn)代醫(yī)療保健系統(tǒng)中亟待解決的問(wèn)題，本研究中的8株實(shí)驗(yàn)菌株均為多重耐藥菌株。目前，臨床上可選擇的抗生素種類(lèi)越來(lái)越有限，治療感染疾病的困難愈發(fā)加重，病人愈后并不理想ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[28]。目前常用的策略是考慮感染部位，選擇最適的抗生素聯(lián)合用藥ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[29]。研發(fā)新型抗生素需要時(shí)間，因此，尋求一種非抗生素的治療手段，例如中藥、佐劑、噬菌體療法等被認(rèn)為是一種不錯(cuò)的新型途徑。本研究中所用的三種中藥活性成分木犀草素、連翹脂苷-A、蜂毒素，其中木犀草素提取自金銀花，是常見(jiàn)黃酮之一；連翹脂苷-A源自小兒青翹顆粒組方；蜂毒素屬于抗菌肽，是目前潛力巨大的一種治療策略。本研究結(jié)果表明，蜂毒素相較于其他兩種中藥活性成分，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，蜂毒素的MIC=4μg/mL和2μg/mL，與文獻(xiàn)ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30]中的結(jié)果相一致。連翹脂苷-A、木犀草素并未找到有關(guān)其MIC的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)。中藥活性成分和常見(jiàn)抗生素聯(lián)用，并未達(dá)到降低抗生素或中藥活性成分的使用濃度，與\o"RezaAkbari"RezaAkbariADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Year>2019</Year><RecNum>135</RecNum><DisplayText>[26]</DisplayText><record><rec-number>135</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685805662">135</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>HighlySynergisticEffectsofMelittinwithConventionalAntibioticsAgainstMultidrug-ResistantIsolatesofAcinetobacterbaumanniiandPseudomonasaeruginosa</title><secondary-title>MicrobialDrugResistance</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobialDrugResistance</full-title></periodical><pages>193-202</pages><volume>25</volume><number>2</number><keywords><keyword>burninfections,melittin,antibiotic,synergism,Acinetobacterbaumannii,Pseudomonasaeruginosa</keyword></keywords><dates><year>2019</year></dates><accession-num>30281385</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/abs/10.1089/mdr.2018.0016</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1089/mdr.2018.0016</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。RezaAkbari等人的文獻(xiàn)中以蜂毒素和多尼培南、多西環(huán)素及多粘菌素-E三種抗生素聯(lián)合應(yīng)用，蜂毒素-多尼培南這一組合顯示了協(xié)同抑菌效果，聯(lián)用后降低了多尼培南的最低抑菌濃度。該文獻(xiàn)中，蜂毒素的MIC=0.25μg/mL和0.5μg/mL,遠(yuǎn)低于本研究結(jié)果。與文獻(xiàn)中的臨床分離株相比，本研究的臨床分離株的耐藥性較強(qiáng)，配制蜂毒素溶液所用溶劑為高壓滅菌的超純水（查閱文獻(xiàn)中未提及蜂毒素溶劑），所用蜂毒素的藥物純度與文獻(xiàn)中是否一致仍有待考證，以上眾多因素均可能導(dǎo)致聯(lián)合用藥效果不佳。生物膜已經(jīng)成為耐藥菌迅速發(fā)展的一個(gè)重要因素，在生物膜的保護(hù)之下，病原菌對(duì)抗生素和宿主的免疫調(diào)節(jié)具有更強(qiáng)抵抗力，同時(shí)提高病原菌在惡劣條件下的生存幾率。生物膜引起的慢性或亞急性感染，也是臨床治療上難以解決的棘手問(wèn)題ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Gedefie</Author><Year>2021</Year><RecNum>127</RecNum><DisplayText>[31]</DisplayText><record><rec-number>127</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="e0tfsavzo9dxenewdtpvtxxtp5tf0e9d2fr0"timestamp="1685440256">127</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Gedefie,A.</author><author>Demsis,W.</author><author>Ashagrie,M.</author><author>Kassa,Y.</author><author>Tesfaye,M.</author><author>Tilahun,M.</author><author>Bisetegn,H.</author><author>Sahle,Z.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMedicalLaboratorySciences,CollegeofMedicineandHealthScience,WolloUniversity,Dessie,Ethiopia. DepartmentofMedicalLaboratorySciences,DebreBirhanHealthScienceCollege,DebreBirhan,Ethiopia.</auth-address><titles><title>AcinetobacterbaumanniiBiofilmFormationandItsRoleinDiseasePathogenesis:AReview</title><secondary-title>InfectDrugResist</secondary-title></titles><periodical><full-title>InfectDrugResist</full-title></periodical><pages>3711-3719</pages><v