項目四抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)項目導(dǎo)讀

抗HER2單克隆抗體選擇性地作用于人表皮生長因子受體-2（HER2）的細(xì)胞外部位，適用于治療HER2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌，作為單一藥物治療已接受過一個或多個化療方案的轉(zhuǎn)移性乳腺癌；與化療藥物聯(lián)合，用于未接受化療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者?？笻ER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody重鏈輕鏈2

第一個獲批準(zhǔn)上市的抗HER2單克隆抗體藥物是赫賽?。ㄗ⑸溆们字閱慰梗?，采用哺乳動物細(xì)胞CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)，制劑劑型為凍干粉針。此外已經(jīng)開發(fā)出HER2抗體偶聯(lián)藥物。赫賽汀長期進(jìn)入全球藥物銷售TOP10的名單，2018—2021年的全球銷售額分別為69.29億美元、60.39億美元、40.41億美元和29.1億美元。三生國健和復(fù)宏漢霖等研發(fā)的國產(chǎn)曲妥珠單抗生物類似藥于2020年獲批上市。

本項目依托抗HER2單克隆抗體生產(chǎn)項目為載體，進(jìn)行生產(chǎn)和教學(xué)實踐。通過本項目，學(xué)生可掌握抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)工藝，重點掌握親和層析技術(shù)、料液濃縮技術(shù)、凍干技術(shù)等生物藥物分離技術(shù)。3學(xué)習(xí)抗HER2單克隆抗體生產(chǎn)技術(shù)重點：細(xì)胞復(fù)蘇與傳代、豐收液澄清技術(shù)、親和層析技術(shù)、濃縮技術(shù)和冷凍干燥技術(shù)抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody4項目實施說明1.項目描述

公司生產(chǎn)制造部發(fā)出生產(chǎn)指令，要求生產(chǎn)一批注射用抗HER2單克隆抗體，從原液生產(chǎn)工段的細(xì)胞培養(yǎng)組、純化組到制劑生產(chǎn)工段的配劑、洗瓶、灌裝、凍干組等開始啟動準(zhǔn)備工作。2.抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)指令抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody5抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)010204抗HER2單克隆抗體豐收液處理抗HER2單克隆抗體凍干03抗HER2單克隆抗體親和層析抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)0506抗HER2單克隆抗體疏水層析抗HER2單克隆抗體離子交換層析生產(chǎn)流程6項目四抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)任務(wù)一抗HER2單克隆抗體豐收液生產(chǎn)嚴(yán)格遵守GMP和抗HER2單克隆抗體豐收液生產(chǎn)崗位SOP，細(xì)胞培養(yǎng)組嚴(yán)格遵循細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)操作規(guī)程，利用抗HER2單克隆抗體CHO工程細(xì)胞，按照細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝要求開展細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞傳代培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)、反應(yīng)器生產(chǎn)等步驟的操作，收集含有細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的豐收液進(jìn)行初步檢測，用于后續(xù)分離純化工作。規(guī)范填寫生產(chǎn)記錄。任務(wù)學(xué)習(xí)路徑見思維導(dǎo)圖。任務(wù)描述抗HER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody8任務(wù)支撐（一）細(xì)胞工程制藥

細(xì)胞工程制藥是細(xì)胞工程技術(shù)在制藥工業(yè)方面的應(yīng)用。所謂細(xì)胞工程，就是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行設(shè)計和操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對人類有用的產(chǎn)品的一門應(yīng)用科學(xué)和技術(shù)?？笻ER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody9

（一）細(xì)胞工程制藥

細(xì)胞工程制藥主要由上游工程（包括細(xì)胞遺傳操作、細(xì)胞株構(gòu)建和保藏等）和下游工程（將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中用以生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程）兩部分構(gòu)成。

目前，利用動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)所生產(chǎn)的生物產(chǎn)品包括酶、單克隆抗體、多種疫苗以及胰島素、干擾素等基因工程產(chǎn)品。10（二）細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流程

從工作細(xì)胞庫復(fù)蘇一支種子細(xì)胞，檢查合格的復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)瓶的傳代擴增，接下來是搖瓶擴增（如為貼壁細(xì)胞則可進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶擴增），最后用細(xì)胞反應(yīng)器生產(chǎn)。對于更大規(guī)模的生產(chǎn)，在搖瓶與最終反應(yīng)器間還要加入種子反應(yīng)器擴增操作。生產(chǎn)流程如圖所示。細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流程111.細(xì)胞復(fù)蘇需要遵循的原則（三）細(xì)胞復(fù)蘇（1）在37℃的水浴中迅速將冷凍的細(xì)胞解凍（1min內(nèi)）。（2）用預(yù)熱的生長培養(yǎng)基緩慢稀釋解凍的細(xì)胞。（3）將解凍的細(xì)胞高密度接種，以提高細(xì)胞復(fù)蘇效果。（4）必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在A級潔凈度環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。（5）必須穿戴個人防護(hù)設(shè)備，包括面罩或護(hù)目鏡。儲存在液相中的凍存管解凍時有爆炸的危險。（6）如操作DMSO，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范。12（三）細(xì)胞復(fù)蘇2.細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟13

抗HER2單克隆抗體CHO工程細(xì)胞為懸浮細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇后由25cm2培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)接75cm2培養(yǎng)瓶，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶中培養(yǎng)，逐級放大至需要的體積。對終體積較大細(xì)胞的培養(yǎng)，還要進(jìn)行種子反應(yīng)器擴增。逐級放大時要保證種子在對數(shù)生長期傳代，接種密度（1～4）×106個/mL，擴增倍數(shù)為2～6倍。種子擴增過程中培養(yǎng)溫度控制在（37±0.5）℃，每天取細(xì)胞培養(yǎng)物1mL監(jiān)測細(xì)胞密度、活率，顯微鏡下觀察細(xì)胞大小形態(tài)，有無微生物污染。培養(yǎng)期間細(xì)胞密度控制在（2～8）×106個/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞活率要求大于90%。依據(jù)細(xì)胞的生長密度補充培養(yǎng)基。（四）細(xì)胞傳代與監(jiān)控14

每級擴增時間一般為1～5天，種子擴增階段總體要求培養(yǎng)時間不超過20天，限傳代次為20代。所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在A級潔凈度環(huán)境下進(jìn)行。傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時進(jìn)行。（四）細(xì)胞傳代與監(jiān)控15

傳代方法一般有直接傳代和離心傳代兩種。（1）直接傳代。使懸浮細(xì)胞沉降在瓶底，吸掉1/2～2/3的上清液，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。（2）離心傳代。將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，800～1000r/min離心5min，棄上清液，加入新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管輕輕吹打使之形成細(xì)胞懸液，然后傳代接種。懸浮細(xì)胞傳代多采用此法。（四）細(xì)胞傳代與監(jiān)控16

根據(jù)懸浮流加培養(yǎng)過程的生長特點及不同階段的控制要點，人為將生產(chǎn)反應(yīng)器的培養(yǎng)定義為兩個時期，即從接種生長至最適密度的生長期，以及維持高密度、長時間的培養(yǎng)，直至細(xì)胞收液的生產(chǎn)期。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)

1.接種量

（1）接種密度。過低的細(xì)胞接種密度，細(xì)胞生長遲緩期太長。接種密度過高，細(xì)胞難以長時間保持高活率。不同細(xì)胞的接種密度有差異，一般可選擇（2～4）×106個/mL。

（2）接種體積。接種體積影響細(xì)胞傳代的時間，大的接種體積可以減少細(xì)胞傳代所需時間；小的接種體積延長細(xì)胞的擴增期。但種子制備過程比較費時，因此以不低于反應(yīng)器工作體積10%的接種體積進(jìn)行接種比較適宜。17

2.生長期連續(xù)流加控制

細(xì)胞接種反應(yīng)器后，每日取樣觀察，監(jiān)測細(xì)胞生長密度。根據(jù)檢測結(jié)果通過連續(xù)流加培養(yǎng)基不斷擴大培養(yǎng)體積，使細(xì)胞密度維持在穩(wěn)定的范圍內(nèi)，并保持高細(xì)胞活率。當(dāng)細(xì)胞密度與體積達(dá)到要求后，進(jìn)入生產(chǎn)期。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)

3.生產(chǎn)期流加控制

生產(chǎn)期流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長速率、營養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物累積情況來流加濃縮培養(yǎng)液，流加的速率通常與消耗的速率相同，根據(jù)測得的糖消耗濃度來控制相應(yīng)的流加過程，以保證適宜的培養(yǎng)環(huán)境、較低的代謝產(chǎn)物累積水平、較高的細(xì)胞密度、較高細(xì)胞活率、持續(xù)時間和目標(biāo)蛋白高表達(dá)。18

4.不同糖濃度對細(xì)胞代謝的影響

理論上，葡萄糖的控制濃度越低，乳酸的累積量就會越少，糖的維持濃度直接影響到細(xì)胞代謝。葡萄糖的濃度維持過低，不容易實現(xiàn)細(xì)胞生長的穩(wěn)定控制。建議生產(chǎn)期葡萄糖濃度控制在0.5～1.5g/L，應(yīng)根據(jù)實際實驗結(jié)果進(jìn)行確定。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)

5.生產(chǎn)期溫度控制

CHO細(xì)胞培養(yǎng)最適的生長溫度為（37±0.5）℃。降溫培養(yǎng)可能減緩細(xì)胞生長速率，延長細(xì)胞存活時間，并可提高單抗產(chǎn)量。是否適于降溫，降溫程度及降溫時機需根據(jù)具體實驗來確定。生產(chǎn)期降溫一般不低于32℃。19

6.生產(chǎn)期pH控制

生產(chǎn)期的pH控制直接影響細(xì)胞生長速率、細(xì)胞活率及蛋白產(chǎn)量。CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)pH范圍一般控制在6.6～7.4，pH過高或過低都會對細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，葡萄糖代謝有乳酸產(chǎn)生，以及細(xì)胞代謝產(chǎn)生的CO2逐漸累積，pH會不斷下降，可以用NaHCO3調(diào)節(jié)。生產(chǎn)期建議pH采用6.9～7.2范圍。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)

7.生產(chǎn)期溶解氧控制

適宜的溶解氧是保證細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝的基礎(chǔ)。細(xì)胞在缺氧條件下不能生存，溶解氧過低，會影響細(xì)胞代謝和生長；溶解氧過高，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用抑制細(xì)胞生長。細(xì)胞在不同生長時期對氧的需求不同，通過調(diào)節(jié)空氣、氧氣和氮氣比例調(diào)節(jié)溶解氧的高低。生產(chǎn)期建議溶解氧范圍控制在40%～60%。20

8.收獲標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)生產(chǎn)期細(xì)胞活率低于80%，進(jìn)行收液。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到20天，細(xì)胞活率大于80%，也要停止培養(yǎng)，放料純化。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)

9.微生物污染監(jiān)測

生產(chǎn)期間，每天無菌取樣在顯微鏡下觀察是否有細(xì)菌、酵母菌、真菌等微生物污染。觀察結(jié)束后將廢棄物帶出無菌室，濕熱滅菌后排放。全程密封，保護(hù)培養(yǎng)環(huán)境，結(jié)束后用酒精和紫外線對環(huán)境進(jìn)行徹底消毒。21

10.培養(yǎng)物廢棄指標(biāo)

（1）每日取樣顯微鏡下檢查。發(fā)現(xiàn)存在微生物污染，培養(yǎng)物立即廢棄。

（2）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長狀態(tài)較差，細(xì)胞活率（低于90%）達(dá)不到工藝要求，培養(yǎng)物立即廢棄。

（3）生產(chǎn)期低于5天時，活率降低到80%以下時，應(yīng)廢棄。

（4）在培養(yǎng)過程中如出現(xiàn)如停電，環(huán)境破壞等突發(fā)事件，影響到細(xì)胞培養(yǎng)正常進(jìn)行。培養(yǎng)物應(yīng)該廢棄。（五）反應(yīng)器生產(chǎn)22任務(wù)實施（一）認(rèn)識抗HER2單克隆抗體

抗HER2單克隆抗體是共價交聯(lián)的四聚體，由兩條重鏈、兩條輕鏈組成，是一種糖基化蛋白。整個抗體含有4對鏈間二硫鍵，12對鏈內(nèi)二硫鍵，1個N連接糖基化位點。

抗HER2單克隆抗體生產(chǎn)用細(xì)胞株為采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）株系?？笻ER2單克隆抗體的生產(chǎn)ProductionofAnti-HER2MonoclonalAntibody重鏈輕鏈23（二）掌握抗HER2單克隆抗體生產(chǎn)工藝

由高效表達(dá)抗HER2單克隆抗體的CHO-S工程細(xì)胞株經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)、目標(biāo)產(chǎn)物分離和高度純化后獲得抗HER2單克隆抗體?？笻ER2單克隆抗體工藝流程如圖所示?？笻ER2單克隆抗體工藝流程24原液按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢定，質(zhì)量需符合2020年版《中國藥典》三部人用重組單克隆抗體制品總論要求。（三）熟悉抗HER2單克隆抗體原液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)250504030201生產(chǎn)前準(zhǔn)備細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞傳代反應(yīng)器生產(chǎn)清場（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)26生產(chǎn)前準(zhǔn)備01（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)（1）確認(rèn)是否有前批清場合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具符合要求；（2）確認(rèn)與填寫檢查記錄；（3）領(lǐng)料與溶液配制。細(xì)胞復(fù)蘇02（1）用鑷子將要復(fù)蘇的細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出。（2）將細(xì)胞凍存管立即放入37℃的水浴中，輕搖至迅速融化（1min內(nèi)）。

注意：

操作者進(jìn)行以上操作時，要佩戴護(hù)目鏡，防止因凍存管意外炸裂帶來傷害。27細(xì)胞復(fù)蘇02（3）將融化好的細(xì)胞凍存管放入離心機中，補加DMEM/F12培養(yǎng)基至10mL，1000r/min，離心10min，倒棄上清液。（4）用5mL吸管吸取適量DMEM/F12吹懸細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞吹散懸浮，轉(zhuǎn)入25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。（5）在培養(yǎng)瓶上寫明細(xì)胞的唯一性信息、復(fù)蘇日期及操作者等信息。（6）接種后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置5%CO2、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日可以換液，棄去漂浮的死亡細(xì)胞，此時存活的細(xì)胞大部分可生長并增殖，一般一支細(xì)胞凍存管復(fù)蘇后接種一瓶。24h后觀察細(xì)胞。（7）CHO細(xì)胞的復(fù)蘇工作完成后，操作人員應(yīng)及時填寫相應(yīng)的記錄表格。（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)28細(xì)胞傳代03（1）將25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞離心去掉舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的5mL

DMEM/F12培養(yǎng)基，接種至75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，補加5mL培養(yǎng)基，置于（37±0.5）℃，5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每間隔12～24h，檢測細(xì)胞密度，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及監(jiān)測是否有微生物污染。（2）待細(xì)胞密度生長至（2～4）×106個/mL，接種至50mL細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。適當(dāng)補充新鮮培養(yǎng)液至30mL，置于（37±0.5）℃恒溫懸浮培養(yǎng)，間隔12～24h取樣監(jiān)測細(xì)胞密度、細(xì)胞活率、有無微生物污染。（3）持續(xù)補加新鮮的培養(yǎng)液，維持細(xì)胞密度達(dá)到（2～4）×106個/mL直至細(xì)胞培養(yǎng)體積達(dá)到搖瓶上限，可轉(zhuǎn)移到250mL細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶內(nèi)繼續(xù)擴增培養(yǎng)。逐級將種子細(xì)胞放大到1L細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶、5L細(xì)胞培養(yǎng)搖瓶、50L種子反應(yīng)器。（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)29反應(yīng)器生產(chǎn)04（1）生產(chǎn)反應(yīng)器接種前準(zhǔn)備工作。①電極校正②在位滅菌③夾套進(jìn)水操作④無菌驗證⑤開啟溫度控制⑥開啟含氧量控制⑦開啟pH控制（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)30反應(yīng)器生產(chǎn)04（2）接種生產(chǎn)反應(yīng)器。在200L生產(chǎn)反應(yīng)器中接種體積不低于20L、細(xì)胞密度（2～4）×106cells/mL，活率90%以上的種子細(xì)胞。

培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置：培養(yǎng)溫度37℃，空氣流量0.1L/min，搖床轉(zhuǎn)速28rpm。（3）生長期培養(yǎng)。細(xì)胞接種反應(yīng)器后，擴增培養(yǎng)體積，空氣流量和搖床轉(zhuǎn)速逐漸增加。每天取樣監(jiān)測細(xì)胞密度、活率、糖含量、乳酸、滲透壓等，控制溫度（37±0.5）℃。（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)31反應(yīng)器生產(chǎn)04（4）生產(chǎn)期培養(yǎng)。細(xì)胞傳代至工作體積50%～70%，細(xì)胞密度在（8～10）×106cells/mL范圍時，降溫至（32±0.5）℃，控制pH為6.9～7.2、DO40%～60%、葡萄糖濃度為0.5～1.5g/L，每天取樣監(jiān)測細(xì)胞密度、活率、糖含量、乳酸、滲透壓等。（5）收液。當(dāng)細(xì)胞活率下降至80%以下，為保證回收蛋白具有較高純度及活性，收獲結(jié)束培養(yǎng)。（6）反應(yīng)器在位清潔。（四）抗HER2單克隆抗體豐收液的生產(chǎn)32清場05

檢查、整理各項記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺和潔凈室。最后，填寫清場合格證。注意：請在任務(wù)實施過程中規(guī)范填寫《抗HER2單克隆抗體豐收液生產(chǎn)》，不