關(guān)于實(shí)驗(yàn)中的樣本制備

在臨床基本擴(kuò)增檢驗(yàn)中，由于臨床標(biāo)本中常含有蛋白和脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)，因而核酸提取是進(jìn)行核酸擴(kuò)增前不可或缺的一個(gè)步驟。核酸分離純化技術(shù)起源于20世紀(jì)50年代，在70年代和80年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣，第2頁,共85頁，2024年2月25日，星期天但由于傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟，不但繁瑣，而且增加了環(huán)境因素對標(biāo)本以及標(biāo)本間相互污染的機(jī)會，不但在RNA檢測時(shí)，易出現(xiàn)假陰性，而且當(dāng)使用極為敏感的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）及體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)檢測時(shí)，易得到假陽性結(jié)果。第3頁,共85頁，2024年2月25日，星期天同時(shí)，由于這些方法要用到一些揮發(fā)性的有機(jī)溶劑，故對實(shí)驗(yàn)操作人員的身體健康有一定的影響。因此，簡單而又高效且無需使用酚和氯仿的核酸提取方法對上述敏感的基因擴(kuò)增檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用有重要意義。第4頁,共85頁，2024年2月25日，星期天此外，標(biāo)本的處理及保存對DNA和RNA（尤其是RNA）的影響較大，因此，在核酸測定時(shí)，樣本的處理及保存，對保證測定的準(zhǔn)確有效尤為重要。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)中常涉及的標(biāo)本有血清（漿）、全血、外周血單個(gè)核細(xì)胞、分泌物、拭子、膿、體液、石蠟切片、新鮮組織等，這些臨床標(biāo)本的處理和保存方法各有不同。第5頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)臨床標(biāo)本的處理和保存

血清（漿）標(biāo)本第6頁,共85頁，2024年2月25日，星期天在某些病原體如乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus,HCV）和人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus,HIV）等的PCR臨床測定中，標(biāo)本的獲取和保存，對于DNA測定，可能按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大，第7頁,共85頁，2024年2月25日，星期天但對于RNA測定，標(biāo)本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。有研究表明，用于RNA測定最好是使用EDTA抗凝（嚴(yán)禁使用肝素，因其對PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除）全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快（2小時(shí)內(nèi)）分離血清，標(biāo)本的短期（1-2周）保存可在-20℃下，較長期保存應(yīng)在-70℃。第8頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

以全血作為待測標(biāo)本時(shí)，必須注意抗凝劑的選擇，一般使用EDTA-Na2或枸櫞酸鈉，不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測，可4℃下短期保存，如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA全血標(biāo)本第9頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液，裂解全血中的紅細(xì)胞，經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌，即可得到單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不得取核酸，可保存于-70℃下。外周血單個(gè)核細(xì)胞第10頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

痰屬于分泌物，臨床上常用作為結(jié)核分枝桿菌DNA測定標(biāo)本。由于痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì)，故在核酸提取時(shí)，需對標(biāo)本進(jìn)行初步處理，即用1mol/LNaOH液化。痰第11頁,共85頁，2024年2月25日，星期天需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長，液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取，可保存于-70℃下。此外，如用于非結(jié)核分枝桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。第12頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

在使用PCR方法檢測性病病原體時(shí)，臨床標(biāo)本一般為棉拭子，可將棉拭子置于適量生理鹽水中，充分震蕩洗滌后，室溫靜置5-10分鐘，待大塊狀物下沉后，取上清立即離心，其后的沉淀即可用于DNA提取，如不立即用于核酸提取，則需保存于-70℃下。棉拭子第13頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

膿液的處理依情況而定，如用于分枝桿菌（如結(jié)核分枝桿菌）核酸測定的標(biāo)本，粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心，沉淀用生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。膿液第14頁,共85頁，2024年2月25日，星期天對于用于非分枝桿菌測定的膿液標(biāo)本，如過于粘稠，則加入適量生理鹽水，充分振蕩后，靜置，取上清立即離心，沉淀用于DNA提取；如為水樣，則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本的保存條件同樣為-70℃。第15頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

臨床體液標(biāo)本包括胸水，腹水，腦脊液，尿液等，可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后，提取核酸。沉淀樣本的保存同上。體液第16頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步驟首先用生理鹽水洗兩次，然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻，離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。組織第17頁,共85頁，2024年2月25日，星期天新鮮組織最好是保存于50%乙醇中，具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次，切成寬度小于1cm的小片，加入適量的生理鹽水，然后，邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%，這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日，4℃可保存6年。第18頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

石蠟切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脫蠟，再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取?？偠灾?，標(biāo)本的收集及適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，對用于PCR測定的核酸模板的成功提取，具有決定性作用。在這里要著重強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，所有用于上述臨床標(biāo)本收集的容器如試管或離心管，均應(yīng)使用前高壓滅菌。第19頁,共85頁，2024年2月25日，星期天其它標(biāo)本尿液前列腺液尿道口分泌物陰道分泌物宮頸口粘液咽喉拭子、鼻腔分泌物糞便第20頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)核酸的提取方法

一、DNA提取的經(jīng)典方法

DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的“酚-氯仿提取法”。這種方法提取的DNA純度高，效果好，缺點(diǎn)是較為繁瑣。方法如下：第21頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1．試劑

（1）蛋白酶K緩沖液：

50mmol/LKCl,

10-20mmol/LTris-HCl,

2.5mmol/LMgCl2,pH8.3,

1%laureth12(一種表面活性劑)

0.5%Tween20,

100ug/ml蛋白酶K。第22頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（2）飽和酚：市售酚經(jīng)重蒸餾后（如貯存，則于-20℃下，用前從冰箱取出，與室溫平衡后，68℃下使酚溶解），加入等體積的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)磁力攪拌15分種移出上層水相；重復(fù)上述抽提過程，直至酚相的pH大于7.8，酚達(dá)到平衡最后一次取出液相后，第23頁,共85頁，2024年2月25日，星期天加入0.1體積含有0.2%β-巰基乙醇的0.1mol/LTris–HCl(pH8.0)，這種形式的酚溶液可裝在不透光的瓶中并處于10mmol/LTris-HCl（Ph8.0）緩沖液層之下，可4℃下保存一個(gè)月。第24頁,共85頁，2024年2月25日，星期天TE緩沖液10mmol/LTris-Cl,1mmol/LEDTA,pH7.5或8.0。第25頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2．提取步驟

1、臨床標(biāo)本經(jīng)前處理后

加入蛋白酶K緩沖液

56℃溫育1小時(shí)

加入等體積飽和酚，充分振蕩混勻

第26頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

12000rpm離心5分種

取水相，加入等體積氯仿

混勻，12000rpm離心2分鐘

取水相，加1/10體積的3mol/L

NaAc和2倍體積的無水乙醇第27頁,共85頁，2024年2月25日，星期天-20℃30分鐘或過夜

12000rpm離心10分種

棄上清，用預(yù)冷75%乙醇洗3次

干燥

取20μlTE或無菌去離子水懸浮

4℃?zhèn)溆?/p>

第28頁,共85頁，2024年2月25日，星期天二、RNA的提取

RNA的提取條件較DNA要求嚴(yán)格，主要是因?yàn)榕R床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，存在大量對RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase較耐高溫，不易失活。因此在提取RNA時(shí)，如何避免RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解，是保證RNA成功提取的關(guān)鍵所在。第29頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（一）RNA提取所用器皿的處

理及溶液的準(zhǔn)備

經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管，離心管等基本上無RNase，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA，實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染，使用前必須于180℃干烤8小時(shí)以上，或用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其它用品。第30頁,共85頁，2024年2月25日，星期天DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上良量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。第31頁,共85頁，2024年2月25日，星期天要注意的是，DEPC有致癌性，操作時(shí)須小心。對于RNA提取所需溶液的配制，必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。第32頁,共85頁，2024年2月25日，星期天可能的話，溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘.須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液.第33頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（二）RNA提取中RNase污染的控制

實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。因此，在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí)，以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套。第34頁,共85頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)中，如觸摸“臟的”玻璃器皿和其它物品以后手套就可能會沾染上RNase，因此在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。常用的RNase抑制劑有以下幾種：第35頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1．RNase的蛋白質(zhì)抑制劑這種RNase的蛋白質(zhì)抑制劑是從人胎盤分離得到，可與多種RNase以非共價(jià)方式緊密結(jié)合，從而使RNase失活。其可置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50%甘油中，貯存于-20℃。第36頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2．釩核糖核苷復(fù)合物這種復(fù)合物由氧釩（IV）離子和4種核糖核苷之中的任一種所組成，能與多種RNase結(jié)合，并幾乎能百分之百地抑制RNase的活性。第37頁,共85頁，2024年2月25日，星期天3．硅藻土硅藻土是一種粘土，通過吸附RNase而去除其降解RNA的作用。第38頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（三）RNA提取方法

RNA提取的常用方法有：（1）表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法；（2）胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法；（3）胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。第39頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第一種方法所提取的RNA純度高，反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR擴(kuò)增的特異性好，缺點(diǎn)是操作繁瑣，易造成微量標(biāo)本的丟失或標(biāo)本間的交叉污染，還易因RNA降解而影響測定結(jié)果的可靠性及敏感性；第40頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第三種方法較為方便省時(shí)，不需氯仿-酚抽提，但對玻璃粉、二氧化硅等的質(zhì)量有要求；第二種方法雖較為復(fù)雜，但結(jié)果穩(wěn)定性最優(yōu)，因?yàn)槭褂脧?qiáng)烈變性劑加鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破環(huán)而從核酸上解離下來。第41頁,共85頁，2024年2月25日，星期天RNase可耐受多種處理（例如煮沸）而不失活，但卻會被4mol/L硫氰酸胍和β-巰基乙醇等還原劑所滅活，因此可聯(lián)用上述試劑從組織中提取完整無損的RNA。下面以血清（漿）的異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚說明RNA常用提取方法。第42頁,共85頁，2024年2月25日，星期天異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿-酚提取法第43頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（1）試劑

20%PEG6000

裂解液：

4mol/LGuSCN,

25mmol/L檸檬酸鈉pH7.0,

0.5%Sarkosyl（十二烷基肌酸鈉）

100mmol/Lβ-巰基乙醇

飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1）3mol/LNaAcPH5.2

無水乙醇

75%乙醇

DEPC處理的無菌去離子水

RNasin（RNA酶抑制劑）第44頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl20%PEG6000

4℃3小時(shí)，12000rpm離心15分鐘（4℃），棄上清

加入500μl裂解液混勻

第45頁,共85頁，2024年2月25日，星期天加入50μlNaAc、500μl飽和酚：

氯仿:異戊醇溶液

混勻，冰浴10分鐘

4℃12000rpm離心5分鐘

取上層水相再用氯仿-異戊醇抽提一次

加入1/10體積NaAc溶液、2.5體積無水乙醇

冰浴30-60分鐘

第46頁,共85頁，2024年2月25日，星期天4℃14000rpm離心10分鐘

棄上清

沉淀用75%乙醇洗一次

烘干或真空干燥

用10μlDEPC處理水溶解，加入2uRNasin

-20℃保存?zhèn)溆?/p>

第47頁,共85頁，2024年2月25日，星期天三、核酸提取的改良方法

（一）旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）提取第48頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

旋轉(zhuǎn)離心（SPINCOLUMN）技術(shù)是從生物樣品中分離純化微量核酸的較為簡便的方法，屬于硅吸附方法的一種。是美國和歐洲的科學(xué)家們從20世紀(jì)80年代未起開始研制的一種微量快速的核酸分離純化方法，第49頁,共85頁，2024年2月25日，星期天其克服了傳統(tǒng)核酸純化方法的缺陷，適合于現(xiàn)代分子生物學(xué)工作需要進(jìn)行大量微量核酸分離純化的工作特點(diǎn)。在美國，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)出現(xiàn)在90年代初，以后逐漸被市場和技術(shù)工作人員所接受，成為微量核酸分離純化的主導(dǎo)技術(shù)。第50頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)能夠快速、簡便地從生物樣品中分離純化包括人體DNA、質(zhì)粒DNA、總RNA、mRNA在內(nèi)的各類脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）大分子。盡管在市場上所見到旋轉(zhuǎn)離心柱各有特色，但是在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€(gè)部分：第51頁,共85頁，2024年2月25日，星期天第一部分是利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力而對其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。第52頁,共85頁，2024年2月25日，星期天旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的一次操作過程一般在10分鐘到20分鐘不等，比傳統(tǒng)純化方法的操作時(shí)間（幾個(gè)小時(shí)）大大減少。旋轉(zhuǎn)離心柱純化的DNA產(chǎn)物的OD260/OD280一般在1.80-2.00之間；分離純化效率在80%-100%之間。目前，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞核DNA、細(xì)菌DNA、質(zhì)粒DNA、細(xì)胞MRNA、膠上DNA或RNA等核酸的純化第53頁,共85頁，2024年2月25日，星期天核酸載體的膜化是旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)工業(yè)化使用的重要基礎(chǔ)。隨著微量核酸分離純化技術(shù)的出現(xiàn)，操作的簡便性、穩(wěn)定性和重復(fù)性一直是圍繞核酸分離純化技術(shù)應(yīng)用的核心問題。為了推出簡便、穩(wěn)定和重復(fù)性好的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)中的核酸載體先后用過玻璃珠和藻膠等各種材料，直至20世紀(jì)90年代初才最后確定為人工膜。第54頁,共85頁，2024年2月25日，星期天膜化后的旋轉(zhuǎn)離心柱產(chǎn)品具有操作簡便、穩(wěn)定、儲存方便、重復(fù)可靠等特點(diǎn)，成為核酸純化市場的主導(dǎo)產(chǎn)品。第55頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)的適用性很廣，可用于全血、抗凝血、血清、腦脊液、分泌物、唾液、痰尿、糞便、軟骨、動植物組織等各種樣品的核酸提取。第56頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（二）玻璃粉吸附法

DNA或RNA可特異地吸附于玻璃粉上，因此將玻璃粉懸液與臨床標(biāo)本混勻、離心、洗滌玻璃沉淀，即可從玻璃粉上獲得純化的核酸。第57頁,共85頁，2024年2月25日，星期天Yamada等為簡化使用PCR檢測病原體的核酸提取方法，使用玻璃粉懸液直接從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和血漿中提取核酸，這樣得到的核酸標(biāo)本用于DNA和RNA的擴(kuò)增檢測，得到滿意的結(jié)果。其提取方法分述如下：第58頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1．從細(xì)胞提取核酸

試劑

1%SDS（含10mmol/LEDTA）

4mol/LNaCl

玻璃粉懸液

乙醇洗滌（50%乙醇，10mol/LTris,pH7.4,1mol/LEDTA,50mmol/LNaCl）第59頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(2)操作步驟

人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）（2×105）

加入50μl1%SDS（含10mmol/LEDTA）

加入150μl4mol/LNaCl及50μl玻璃粉懸液混勻，置冰浴5分鐘

10000rpm離心1分鐘，傾去上清液

第60頁,共85頁，2024年2月25日，星期天用300μl乙醇洗滌液洗沉淀物3次

加入100μl水

3分鐘洗脫DNA，離心

上清液即為含純化DNA的核酸標(biāo)本第61頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2．從血清（漿）中提取用于RNA檢測的核酸

（1）試劑

6mol/LGuSCN

玻璃粉懸液

無水乙醇

第62頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2）操作步驟

200μl血清（漿）

加入200μl6M異硫氰酸胍及20μl玻璃粉懸液

室溫90分鐘

10000rpm離心1分鐘，棄上清液

沉淀用300μl乙醇洗2次

沉淀物中加入50μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，將RNA先轉(zhuǎn)錄為CDNA，再進(jìn)行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。第63頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（三）二氧化硅（SE）或

硅藻吸附法

除了玻璃粉以外，SE和硅藻（單細(xì)胞藻類的化石細(xì)胞壁，D）顆粒也具有特異吸附核酸的特性。Chaotropic試劑硫酸氰胍兼具細(xì)胞裂解及核酸失活兩種特性，因而在高濃度硫氰酸胍存在下，從細(xì)胞（包括細(xì)菌）或病毒顆粒中釋放出的核酸萬分可結(jié)合于SE或D顆粒上第64頁,共85頁，2024年2月25日，星期天BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D顆粒的上述特性，成功地從血清、尿液以及細(xì)胞中純化了DNA和RNA，可在不到1小時(shí)內(nèi)完成12個(gè)不同臨床標(biāo)本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D兩種提取方案，Y/SE方案為使用SE以提取血液和尿液等體液中的核酸；Y/D方案為使用D顆粒以提取細(xì)胞中的核酸。第65頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1、Y/SE方案

（1）試劑

裂解緩沖液L6：120gGUSCN溶于100ml0.1mol/LTris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/LEDTA,PH8.0(用NaOH調(diào)節(jié))溶液22ml及2.6gTritonX-100.

洗滌緩沖液L2:120GGUSCN溶于100mL0.1mol/LTris-HCl,pH6.4,為使GUSCN溶解加快,可在60~65℃水浴下攪拌第66頁,共85頁，2024年2月25日，星期天(2)操作步驟

50μl血清或尿液

加入900μl裂解緩沖液L6及40μlSE

立即旋轉(zhuǎn)混勻，5秒，室溫10分鐘

旋轉(zhuǎn)混勻5秒，離心（12000×g）15秒

用洗滌緩沖液L2將沉淀洗滌2次

第67頁,共85頁，2024年2月25日，星期天再用70%乙醇洗2次，用丙酮洗1次

去掉丙酮，反應(yīng)管開蓋56℃干燥10分鐘

加入洗提緩沖液TE

混勻，56℃干燥10分鐘

12000×g離心2分鐘

上清液即含純化的核酸第68頁,共85頁，2024年2月25日，星期天

使用上述Y/SE方案，可以從血清或尿液中高產(chǎn)量地（通常超過50%）提取單鏈、雙鏈、共價(jià)閉合或開環(huán)的DNA或RNA，其可作為限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶、大腸桿菌DNA多聚酶和TAQDNA多聚酶的良好基質(zhì)。第69頁,共85頁，2024年2月25日，星期天該方案雖適用于病毒及革蘭陰性菌（如腦膜炎球菌、傷寒桿菌、淋球菌等）的基因組核酸提取，但不能直接從革蘭陽性菌（如金黃色葡萄球菌、鏈球菌或酵母菌等）中提取核酸，原因可能是由于硫氰酸胍不能很好的裂解革蘭陽性菌。第70頁,共85頁，2024年2月25日，星期天此外，在提取用于HBV-DNA檢測的血清核酸標(biāo)本時(shí)，由于HBV-DNA的長負(fù)鏈5`未端共價(jià)結(jié)合有蛋白質(zhì)，而GUSCN不能將此蛋白從HBV-DNA上去掉，因此在上述提取方法中，由于有HBV-DNA結(jié)合蛋白的干擾，HBV-DNA難以從SE顆粒上洗脫下來。第71頁,共85頁，2024年2月25日，星期天為解決此問題，作者對上述方法分別作了兩種改良，稱為H方案和Y*方案。H方案是首先用SDS-蛋白酶K處理血清，使HBV-DNA長負(fù)鏈5`未端蛋白脫落，然后再按上述方法提取。第72頁,共85頁，2024年2月25日，星期天Y*方案是在用低鹽TE溶液從SE顆粒上洗脫HBV-DNA時(shí)，在TE溶液中加入蛋白酶K，使HBVDNA從SE上脫落下來。這兩種方案都可重復(fù)地從人血清中獲得相同時(shí)的HBV-DNA，與用經(jīng)典方法提取的DNA一樣，可作為PCR的良好的檢測標(biāo)本。第73頁,共85頁，2024年2月25日，星期天2、Y/D方案

該方案與上述方案基本相同，所不同的是使用顆粒較大的D取代SE，以提取相對量多（10~20μg）的細(xì)胞基因組核酸，因?yàn)槿缡褂肧E，由于DNA分子多，一個(gè)SE顆?？膳c數(shù)個(gè)DNA分子結(jié)合，從而在SE顆粒和DNA分子之間形成密實(shí)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而成為聚集物，第74頁,共85頁，2024年2月25日，星期天即使是高速旋轉(zhuǎn)也難以使其散開，使得核酸提取的后續(xù)步驟無法進(jìn)行。而D顆粒較SE顆粒大得多，在D和核酸分子之間不會形成密實(shí)的結(jié)構(gòu)，經(jīng)旋轉(zhuǎn)很容易散開第75頁,共85頁，2024年2月25日，星期天（四）微量全血核酸提取法

一般用于全血核酸提取的方法常需較大量的血液標(biāo)本，難以適于患兒，為此Loparey等于1991年提出了一個(gè)使用NaI的微量全血核酸提取法。

第76頁,共85頁，2024年2月25日，星期天1、試劑

6mol/LNaI

氯仿：異戊醇（24：1）

異丙醇和37%異丙醇

TE緩沖液：10mm