一、什么是動物克??？

動物克隆是一個經(jīng)過核移植過程進行無性繁殖技術(shù)。發(fā)育早期動物胚胎細(xì)胞，或成年動物體細(xì)胞，經(jīng)顯微手術(shù)移植到去掉細(xì)胞核卵母細(xì)胞中之后，在適當(dāng)條件下，能夠重新發(fā)育成正常胚胎。這種胚胎被移植到生殖周期相近母體之中，能夠發(fā)育成為正常動物個體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生動物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是經(jīng)過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動物個體技術(shù)，就叫做動物克隆。細(xì)胞工程專業(yè)知識第1頁核移植技術(shù)：所謂核移植技術(shù)就是利用顯微操作技術(shù)將一個細(xì)胞細(xì)胞核移植到另一個細(xì)胞中，或者將兩個細(xì)胞細(xì)胞核（或細(xì)胞質(zhì)）進行交換，從而可能創(chuàng)造無性雜交生物新品種一項技術(shù)。細(xì)胞工程專業(yè)知識第2頁胚胎克?。菏褂煤斯w細(xì)胞假如來自多細(xì)胞階段胚胎，叫做胚胎克隆。體細(xì)胞克隆：使用核供體細(xì)胞來自動物體，叫做

體細(xì)胞克隆。細(xì)胞工程專業(yè)知識第3頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第4頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第5頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第6頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第7頁二、兩棲類細(xì)胞核移植1938年Spemann最先提出將多細(xì)胞胚胎每一個細(xì)胞核移植到去掉核卵母細(xì)胞中，使它們重新發(fā)育成胚胎構(gòu)想。1952年，Briggs和King沿用Spemann思緒和試驗技術(shù)，首次取得兩棲動物美洲豹蛙胚胎細(xì)胞核移植后代．核供體為囊胚期胚胎細(xì)胞——試驗成功核供體為原腸胚期中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞——試驗失敗細(xì)胞工程專業(yè)知識第8頁1958年到1962年，英國劍橋大學(xué)JohnGurdon和Machineer利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育非洲爪蟾．1970年JohnGurdon以一樣方法，用青蛙腳蹼角質(zhì)化細(xì)胞進行移核試驗，蛙卵發(fā)育成了蝌蚪。細(xì)胞工程專業(yè)知識第9頁三、魚類核移植從1961年開始，童第周等以金魚和鳑鮍魚為材料，進行魚類不一樣亞科間細(xì)胞核移植取得成功，用以研究雜交細(xì)胞核與純種細(xì)胞核在發(fā)育功效上差異，以及細(xì)胞質(zhì)對細(xì)胞核影響．細(xì)胞工程專業(yè)知識第10頁1979年，中國科學(xué)院武漢水生物研究所利用鯽魚做移核試驗。他們把鯽魚囊胚期細(xì)胞經(jīng)過385天59代連續(xù)傳代培養(yǎng)后，再將此種培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞核移植到同種鯽魚未受精卵中。到1980年4月，他們成功地培育了兩尾無性繁殖幼魚，其中一條發(fā)育正常。細(xì)胞工程專業(yè)知識第11頁1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細(xì)胞核移入鯉魚去核未受精卵中，實現(xiàn)了不一樣種間核質(zhì)雜交，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種。細(xì)胞工程專業(yè)知識第12頁四、哺乳類細(xì)胞核移植1977年，美國緬因州巴爾港杰克遜試驗室用“亞無性繁殖”方式，培育出7只單親小鼠。細(xì)胞工程專業(yè)知識第13頁將卵細(xì)胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有適量細(xì)胞松馳B溶液中。經(jīng)此番處理卵細(xì)胞染色體復(fù)制后出現(xiàn)了兩個核，將此雙核細(xì)胞放入正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。卵中雙核細(xì)胞自動融合，而且細(xì)胞開始分裂。將此種胚胎移入母鼠子宮培育。生產(chǎn)出7只單親小鼠。細(xì)胞工程專業(yè)知識第14頁1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)和美國杰克遜試驗室合作，首次對小鼠卵進行移核試驗取得成功。他們將囊胚內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞核移入去核受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育至囊胚期，再將此胚胎移入同時孕鼠子宮內(nèi)，最終產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育個體。細(xì)胞工程專業(yè)知識第15頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第16頁五、核移植技術(shù)普通操作程序

核移植克隆哺乳動物技術(shù)操作過程主要包含核受體和核供體處理和制備、核移植、重組胚體外或體內(nèi)培養(yǎng)、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步驟。細(xì)胞工程專業(yè)知識第17頁1．核受體細(xì)胞準(zhǔn)備去核卵母細(xì)胞經(jīng)常作為核移植受體細(xì)胞。這是因為在卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)含有某種特定因子，能夠使移植核中所含有基因表示程序發(fā)生重新排列，使已經(jīng)分化了細(xì)胞重新回到發(fā)育過程原點，同受精卵一樣開始個體發(fā)育過程。卵母細(xì)胞起源有兩種方式：一是用激素對雌體進行超排處理，從輸卵管沖出體內(nèi)成熟MⅡ卵母細(xì)胞。二是從屠宰場搜集卵巢，吸出濾泡中卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在體外培養(yǎng)成熟后作為受體。細(xì)胞工程專業(yè)知識第18頁2．核供體細(xì)胞準(zhǔn)備在核移植操作中，細(xì)胞核供體細(xì)胞首先必須是完整二倍體，該細(xì)胞必須保持有供體動物完整基因組；其次，供體細(xì)胞核必須能夠在受體細(xì)胞質(zhì)作用下，產(chǎn)生細(xì)胞分化過程倒轉(zhuǎn)，變得如同剛才受精合子一樣，能重新完成從受精到發(fā)育成一個正常動物個體全過程。

供體細(xì)胞主要有兩大類：胚胎卵裂球和體細(xì)胞。另外，核供體細(xì)胞起源還有胚胎干細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞。

細(xì)胞工程專業(yè)知識第19頁3．細(xì)胞核移植

慣用核移植方法有兩種，即胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射是用一個外徑5～8μm注核針吸收供體核后直接注射進卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)方法。透明帶下注射則是把供體細(xì)胞核注射在透明帶與卵母細(xì)胞之間卵周隙中，核移植后用電刺激進行細(xì)胞融合。細(xì)胞工程專業(yè)知識第20頁4．激活卵母細(xì)胞激活包括原因很多，不論是受精引發(fā)卵母細(xì)胞激活還是人工激活，都會引發(fā)卵母細(xì)胞發(fā)生一系列反應(yīng)，這些反應(yīng)是胚胎發(fā)育所必需。其激活原理是經(jīng)過電刺激、鈣離子載體等方法，使卵母細(xì)胞從MII期中解放出來，并轉(zhuǎn)到“受精”狀態(tài)。細(xì)胞工程專業(yè)知識第21頁5．重組胚體內(nèi)或體外培養(yǎng)

經(jīng)融合和激活重組胚移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，觀察重組胚發(fā)育率。羊、牛、豬核移植胚常采取體內(nèi)培養(yǎng)方法取得桑椹胚和囊胚，即羊和牛重組胚用瓊脂包埋后移入休情期母羊結(jié)扎輸卵管中體內(nèi)培養(yǎng)4-7d，發(fā)育至桑椹胚和囊胚。豬核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內(nèi)作體內(nèi)培養(yǎng)7d，發(fā)育為囊胚。大鼠、小鼠和兔核移植胚多作體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚。細(xì)胞工程專業(yè)知識第22頁6．胚胎移植重組克隆胚胎移植受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不一樣、繁殖性能強、體格稍大當(dāng)?shù)仄贩N，進行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。細(xì)胞工程專業(yè)知識第23頁六、核移植技術(shù)應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動物，

進行生物藥品生產(chǎn)；2．培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群；3．開展異種動物克隆，拯救瀕危動物；4．與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆5．利用核移植技術(shù)，碩士物學(xué)基本問題。細(xì)胞工程專業(yè)知識第24頁七、克隆羊與體細(xì)胞核移植細(xì)胞工程專業(yè)知識第25頁a.胚胎細(xì)胞株,b.胚胎纖維母細(xì)胞

c.乳腺上皮細(xì)胞,d.PCRmicrosatellite細(xì)胞工程專業(yè)知識第26頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第27頁第一步取妊娠期6歲母綿羊（FinnDorset白品種母羊）乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用饑餓法使其進入休眠狀態(tài)而使全部基因含有活性。細(xì)胞工程專業(yè)知識第28頁第二步注射促性腺激素，促使母羊（SottishBlackface黑面母綿羊）排卵，28~33小時取其未受精卵，快速去核，放入10%FCS、1%FCS和0.5%FCS連續(xù)5天，使其進入G0期做受體細(xì)胞。細(xì)胞工程專業(yè)知識第29頁第三步乳腺細(xì)胞與無核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流作用下，將乳腺細(xì)胞融入卵中，形成一個含有新遺傳物質(zhì)卵細(xì)胞。細(xì)胞工程專業(yè)知識第30頁第四步新卵細(xì)胞植入羊結(jié)扎輸卵管內(nèi)，6天后發(fā)育為桑椹胚或囊胚（8~16個細(xì)胞）。細(xì)胞工程專業(yè)知識第31頁第五步將此早期胚胎移入假孕母羊子宮中，產(chǎn)下多利即為6歲母羊復(fù)制品，也為白色。細(xì)胞工程專業(yè)知識第32頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第33頁細(xì)胞工程專業(yè)知識第34頁為何是突破性工作：第一，處理了使供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞（去核卵細(xì)胞）同時方法。第二，處理了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因問題。細(xì)胞工程專業(yè)知識第35頁這一結(jié)果主要生物學(xué)意義：第一，它證實了一個已經(jīng)完全分化了動物體細(xì)胞依然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞全部遺傳信息，而且經(jīng)此技術(shù)處理后，體細(xì)胞恢復(fù)了失去全能性形成完整個體。細(xì)胞工程專業(yè)知識第36頁第二，多利是世界上首例利用成年哺乳動物體細(xì)胞作為供體細(xì)胞繁殖克隆羊，即成體母羊復(fù)制品。它成功提醒我們能夠深入做到，在培育體細(xì)胞成為核供體之前，利用“基因靶”技術(shù)準(zhǔn)確地誘發(fā)核基因遺傳改變或準(zhǔn)確地植入目標(biāo)基因，再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些產(chǎn)生了令人滿意改變細(xì)胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就是說，我們能夠按照人意志去改選、生產(chǎn)物種。細(xì)胞工程專業(yè)知識第37頁第三，在當(dāng)代生物學(xué)領(lǐng)域中，沿有任何一項研究結(jié)果能夠比經(jīng)過對基因進行有規(guī)律地控制而處理更多問題先例。多利羊誕生及生長表明，利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類動物最終技術(shù)障礙已被突破，在理論上已成為可能。細(xì)胞工程專業(yè)知識第38頁八、克隆技術(shù)存在問題

理