外源化學(xué)物的特殊毒性

第一節(jié)生殖毒性及評(píng)價(jià)方法要求：

1、掌握生殖發(fā)育毒性的基本概念

2、熟悉生殖發(fā)育毒性的評(píng)價(jià)方法

3、能完成常規(guī)生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)第2頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

概述繁殖過程:生殖細(xì)胞(配子)精子卵細(xì)胞發(fā)生卵細(xì)胞受精卵細(xì)胞著床胚胎形成胚胎發(fā)育器官發(fā)生分娩哺乳胎仔發(fā)育生殖毒理學(xué)發(fā)育毒理學(xué)幼仔發(fā)育第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天一、生殖毒性(reproductivetoxicity)

生殖毒性指對(duì)雄性和雌性生殖功能或能力的損害和對(duì)后代的有害影響。生殖毒性既可發(fā)生于妊娠期，也可發(fā)生于妊前期和哺乳期。表現(xiàn)為外源化學(xué)物對(duì)生殖過程的影響，例如生殖器官及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，對(duì)性周期和性行為的影響，以及對(duì)生育力和妊娠結(jié)局的影響等。第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天二、發(fā)育毒性(developmentaltoxicity)

發(fā)育毒性指在到達(dá)成體之前誘發(fā)的任何有害影響，包括在胚期(embryonicperiod)和胎期(fetalperiod)誘發(fā)或顯示的影響，以及在出生后誘發(fā)和顯示的影響。發(fā)育毒性的主要表現(xiàn)為：

1.發(fā)育生物體死亡(deathofthedevelopingorganism)2.生長改變(alteredgrowth)3.功能缺陷(functionaldeficiency)4.結(jié)構(gòu)異常(structuralabnormality)第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天雄性生殖毒性一、雄性生殖細(xì)胞的發(fā)生過程第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天二、外源化學(xué)物的雄性生殖毒性

（一）對(duì)睪丸生精細(xì)胞的影響睪丸曲細(xì)精管生殖細(xì)胞支持細(xì)胞精原細(xì)胞精母細(xì)胞精細(xì)胞提供營養(yǎng)、保護(hù)、支持第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天(二)對(duì)內(nèi)分泌功能的影響下丘腦垂體睪丸促性腺激素釋放激素GnRH促性腺激素雄性激素促卵泡素FSH黃體生成素LH(三)對(duì)性功能和生殖功能的影響第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天三、雄性生殖毒性的檢測(cè)方法

（一）精子分析

(1)精子計(jì)數(shù)：是雄性性功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，可提供有關(guān)精子發(fā)育與成熟方面的粗略信息。

(2)精子形態(tài)觀察：精子頭和尾的形態(tài)學(xué)改變可影響精子運(yùn)動(dòng)和穿透卵細(xì)胞的能力。

(3)精子狀態(tài)分析試驗(yàn)：包括有精液的pH、液化時(shí)間，精子運(yùn)動(dòng)能力，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和微量元素的含量等?？闪私饩铀幍奈h(huán)境及精子運(yùn)動(dòng)等情況。

（二）精子穿透實(shí)驗(yàn)精子穿透實(shí)驗(yàn)實(shí)際上就是精子體外授精的實(shí)驗(yàn)。第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

（三）睪丸中標(biāo)志酶活性檢測(cè)

一類酶其含量和活性隨著精子的形成、成熟而增高，如乳酸脫氫酶同工酶、山梨醇脫氫酶、透明質(zhì)酸酶、α-磷酸甘油脫氫酶等；一類則是隨著精子的形成、成熟，其活性下降，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、三磷酸甘油醛脫氫酶以及異檸檬酸脫氫酶等。第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（四）體外試驗(yàn)1.睪丸支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)2.睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

（五）雄性激素的檢測(cè)睪丸雄性激素FSHLH雄激素(睪酮)支持細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞雄性激素結(jié)合蛋白睪酮生殖功能第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（六）顯性致死試驗(yàn)（dominantlethalassay）

給予雄性動(dòng)物化學(xué)物，將其與未經(jīng)受試物處理的雌性動(dòng)物交配，觀察雌性動(dòng)物早期胚胎死亡情況，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)雄性動(dòng)物的生殖細(xì)胞有無損害作用的試驗(yàn)。由于此種損害在子代的第一代即可表現(xiàn)，故稱為“顯性”。該試驗(yàn)觀察指標(biāo)為早期胚胎死亡，所以稱之為顯性致死試驗(yàn)。

第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（七）雄性生殖細(xì)胞遺傳毒性檢測(cè)

小鼠睪丸染色體畸變分析、小鼠精子畸變分析、黑腹果蠅染色體隱性分析試驗(yàn)、單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（singlecellgelassay，SCG），又稱慧星試驗(yàn)（cometassey）。第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Figure1DNAofalivecell.NoDNAdamageisobserved.Figure2After30minutesofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX,mostofthenuclearDNAisintactbutsmallpieceshavemigrated.Figure3MoreDNAdamagebutthecellsarestillalive(1hrofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX).Figure4Thecellclearlydeadbyapoptosis.TheDNAinthecellisfragmentedandthenuclearDNAcanbarelyberecognized(2hoursofsonicationinthepresenceofencapsulatedDOX).第14頁,共39頁，2024年2月25日，星期天雌性生殖毒性一、雌性生殖細(xì)胞的發(fā)生過程第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天卵巢

卵泡

支持細(xì)胞卵細(xì)胞

顆粒細(xì)胞

膜細(xì)胞

（二）排卵和受孕排出黃體精子退化受孕白體進(jìn)一步形成第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天下丘腦垂體卵巢促性腺激素釋放激素GnRH促性腺激素雌激素促卵泡素FSH黃體生成素LH（三）內(nèi)分泌調(diào)節(jié)第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天二、外源化學(xué)物的雌性生殖毒性（一）對(duì)卵細(xì)胞的影響（二)對(duì)內(nèi)分泌功能的影響

(三)其它毒作用三、雌性生殖毒性檢測(cè)方法（一）體外試驗(yàn)應(yīng)用超排卵的卵子與化學(xué)物共培養(yǎng)或處理組雌性動(dòng)物的卵子進(jìn)行體外受精.第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天三、雌性生殖毒性檢測(cè)方法

（一）體外試驗(yàn)應(yīng)用超排卵的卵子與化學(xué)物共培養(yǎng)或處理組雌性動(dòng)物的卵子進(jìn)行體外受精.第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

整體動(dòng)物試驗(yàn)仍為主要評(píng)價(jià)方法。常用的有兩類：

1.一代繁殖試驗(yàn)或多代繁殖試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)；

2.三段生殖試驗(yàn)，它分別在三個(gè)不同階段給予受試物，即妊娠前期及初期、器官形成期、圍產(chǎn)期及授乳期。三階段生殖試驗(yàn)的第一、二階段與傳統(tǒng)的繁殖試驗(yàn)和傳統(tǒng)的致畸試驗(yàn)基本相似，第三階段是觀察外源化學(xué)物對(duì)胎兒出生后發(fā)育的影響。（二）動(dòng)物試驗(yàn)第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

—代生殖毒性試驗(yàn)：是指親代(F0)動(dòng)物直接染毒受試物，仔一代(F1)在宮內(nèi)和哺乳期接觸受試物，其交配僅在F0代間進(jìn)行，主要評(píng)價(jià)受試物對(duì)F0代青春期前后和成年動(dòng)物亞慢性暴露的影響；

兩代(多代)生殖毒性試驗(yàn)：是指仔代（F1和F2)從懷孕到出生前的宮內(nèi)持續(xù)暴露和斷奶前的持續(xù)暴露，即F0代直接染毒受試物，F(xiàn)1代既有直接接觸，也有經(jīng)母體的間接接觸，仔二代(F2)在官內(nèi)和哺乳期接觸受試物，其交配在F0代間和F1代間進(jìn)行，主要評(píng)價(jià)從染毒到發(fā)育全過程受試物對(duì)生殖功能的影響。第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天1、發(fā)情周期的觀察

2、排卵的觀察

3、雌性激素檢測(cè)4、病理組織學(xué)檢查

（三）其他輔助實(shí)驗(yàn)第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天致畸試驗(yàn)

致畸作用(teratogenicity)系在外源化學(xué)物對(duì)胚胎或胎兒發(fā)育過程的干擾作用下，造成胎兒在出生時(shí)，某種器官表現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的過程。能誘發(fā)致畸作用的外源化學(xué)物稱致畸物或致畸劑(teratogen)。第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天一、動(dòng)物致畸試驗(yàn)（一）基本原理：妊娠母體接觸某些具有致畸作用的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)于處在器官形成期的胚胎發(fā)育可產(chǎn)生不良影響，使胎仔形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生缺陷而呈現(xiàn)畸形。因此，可以通過觀察妊娠母體在敏感期接觸受試物后胚胎及胎仔的發(fā)育狀況來評(píng)價(jià)某種化學(xué)物質(zhì)有無致畸作用。第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（二）基本方法1.動(dòng)物選擇2.動(dòng)物交配處理3.劑量分組4.孕鼠狀況觀察5.動(dòng)物剖檢6.胎仔檢查

第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天1.動(dòng)物選擇

原則上應(yīng)選擇動(dòng)物體內(nèi)代謝途徑與人類似，胎盤結(jié)構(gòu)也基本與人相近，妊娠期短而一致，產(chǎn)仔數(shù)多，而且自發(fā)畸形率較低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為此多選用大鼠或小鼠。

大鼠首選原因：對(duì)外源化學(xué)物代謝過程基本與人相似。受孕率高，產(chǎn)仔多。胎仔大小適中，易于觀察。第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天2.動(dòng)物交配處理

健康成年未曾孕產(chǎn)的大鼠，體重200~250g，小鼠20~25g。雌雄動(dòng)物2:1比例于晚上合籠，次日早晨對(duì)雌鼠陰道涂片檢查，查見精子或發(fā)現(xiàn)陰栓者揭示已交配過，定為孕鼠，以這一天作為妊娠第0天計(jì)算妊娠日數(shù)。將查出的孕鼠按隨機(jī)區(qū)組法分組，每組10~20只。第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天3.劑量分組

一般高劑量組可選雌鼠LD50的1／3~1／5，低劑量組取1／30~1／50LD50的劑量；也可以亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)中的最大無作用劑量為高劑量，以其1／30為低劑量。染毒：在雌鼠妊娠的第7~15天染毒，每日1次。染毒途徑采用灌胃。

第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天4.孕鼠狀況觀察

在受試期間內(nèi)應(yīng)密切觀察孕鼠的一般狀況，每3天稱量體重1次，通過體重的增減反映出受試物對(duì)孕鼠及胚胎的毒性程度。5.動(dòng)物剖檢

應(yīng)在預(yù)期分娩的前一天處死母鼠進(jìn)行檢查。剖檢前要稱量交記錄母鼠最終體重。做大體觀察并記錄黃體數(shù)、活胎數(shù)及吸收胎數(shù)。

6.胎仔檢查

活胎數(shù)、晚期死胎數(shù)、早期死胎數(shù)、吸收胎數(shù)及各種胎仔的特征。逐一記錄胎仔外觀所見，對(duì)活胎仔要測(cè)量其體重、體長和尾長。

第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（三）結(jié)果判定1.母鼠妊娠期體重變化。2.平均著床數(shù)（％）＝3.平均活胎率=4.著床后死亡率（％）＝5.活胎仔平均體重、體長、尾長。6.畸形（外觀、內(nèi)臟及骨骼）總數(shù)。7.畸胎出現(xiàn)率（％）＝8.活胎仔畸形率（％）＝9.母體畸胎率（％）＝

第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天二、體外致畸作用試驗(yàn)

1.大鼠全胚培養(yǎng)(wholeembryoculture)2.器官培養(yǎng)(organculture)3.胚胎細(xì)胞微團(tuán)培養(yǎng)(micmmassculture)4.水螅培養(yǎng)(hydraattenuataculture)

致畸指數(shù)：母體LD50與胎仔最小致畸作用劑量之比，這一比值愈大，致畸作用愈強(qiáng)，一般認(rèn)為比值10以下者，不具致畸作用，10－100具致畸作用，100以上致畸作用強(qiáng)烈。第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天繁殖實(shí)驗(yàn)一、試驗(yàn)方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇健康剛斷乳（4周齡）大鼠，至少2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。每組雌鼠20只，雄鼠10只（或20只）。（二）劑量分組：設(shè)對(duì)照組、低劑量組（可按最大無作用劑量的1／30或人類可能攝入量的100倍）、高劑量組（為最大耐受量或有胚胎毒性的劑量）。（三）染毒方式：一般采用將受試物加入飼料或飲水中，親代和子代染毒方式和投予劑量應(yīng)相同。（四）實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按設(shè)計(jì)劑量先攝入受試物12周，性發(fā)育成熟可開始交配。先將親代（F0）雌鼠和雄鼠按常規(guī)方式交配，所生仔鼠為第一代（F1）。每代交配兩次，故每代仔鼠共a、b兩窩（一代