2.2動(dòng)物細(xì)胞工程一動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)第2章細(xì)胞工程首例胚胎移植成功首創(chuàng)動(dòng)物組織體外培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物精子獲能現(xiàn)象體細(xì)胞核移植成功試管家兔誕生創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)胚胎分割移植成功分離和培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞克隆羊多莉誕生獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞單細(xì)胞基因組測(cè)序進(jìn)行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生我國(guó)科學(xué)家首次培育了體細(xì)胞克隆猴1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年科技探索之路——?jiǎng)游锛?xì)胞工程的發(fā)展歷程基礎(chǔ)動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞核移植動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

在治療大面積燒傷時(shí)，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進(jìn)行自體移植。但對(duì)這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。

可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增。

思考：怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)出可供移植的皮膚？通過細(xì)胞培養(yǎng)構(gòu)建的人造皮膚

到社會(huì)中去動(dòng)物體組織單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖取出分散適宜條件

原理：細(xì)胞增殖（有絲分裂）。一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物體中取出相關(guān)組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在適宜的培養(yǎng)條件下，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。糖類、氨基酸無機(jī)鹽、維生素……+合成培養(yǎng)基血清

人們對(duì)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尚未全部研究清楚，在使用合成培養(yǎng)基時(shí)，通常需要加入血清等一些天然成分。

一般使用液體培養(yǎng)基，也稱培養(yǎng)液。二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件1.

為什么探究動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要在培養(yǎng)基中加入血清等天然成分？

血清中含有多種維持細(xì)胞正常代謝和生長(zhǎng)的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、未知的促生長(zhǎng)因子等；人們對(duì)細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)尚未全部研究清楚。因此細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為保證細(xì)胞能順利生長(zhǎng)和繁殖，一般需添加血清等天然成分。探討點(diǎn)一：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1.如何維持無菌、無毒的環(huán)境？2.適宜的溫度、pH和滲透壓分別是多少？3.適宜的氣體環(huán)境如何保持？該氣體分別有什么作用？無菌環(huán)境；培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具滅菌；定期更換培養(yǎng)液；抗生素等。溫度：（36.5±0.5）℃；pH：7.2-7.4；適宜的滲透壓。O2是細(xì)胞代謝所必需的，CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH。糖類、氨基酸無機(jī)鹽、維生素……無菌、無毒的環(huán)境適宜的溫度、pH

和滲透壓適宜的氣體環(huán)境二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶；CO2培養(yǎng)箱（含95%空氣和5%CO2的混合氣體）。2.

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)為什么需要無菌、無毒的環(huán)境？如何維持無菌、無毒的環(huán)境？

細(xì)菌、真菌和病毒等均可造成細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的污染，而離體培養(yǎng)的細(xì)胞已失去了對(duì)微生物和有毒物質(zhì)的防御能力，一旦受到污染或自身代謝物質(zhì)積累等，培養(yǎng)的細(xì)胞就會(huì)死亡。可以通過以下操作維持無菌無毒環(huán)境：①對(duì)培養(yǎng)液、培養(yǎng)用具進(jìn)行滅菌處理，并在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作。②定期更換培養(yǎng)液（目的：清除代謝物，防止細(xì)胞代謝物積累對(duì)細(xì)胞自身造成危害）；③培養(yǎng)基中添加抗生素（目的：防止培養(yǎng)過程雜菌污染）。探討點(diǎn)一：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1.選擇怎樣的動(dòng)物組織培養(yǎng)成功率會(huì)更高？為什么？2.為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞呢？可用什么方法？3.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有哪些類型？4.什么是細(xì)胞貼壁？什么是接觸抑制？5.為什么要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)？6.什么是原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)？7.進(jìn)行傳代培養(yǎng)(分瓶培養(yǎng))時(shí)，如何處理？三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)1.選擇怎樣的動(dòng)物組織培養(yǎng)成功率會(huì)更高？為什么？幼齡動(dòng)物的細(xì)胞、分化程度越低的細(xì)胞。原因：分裂能力強(qiáng)，易于培養(yǎng)。三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程用機(jī)械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)2.為何動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程將組織分散成單個(gè)細(xì)胞呢？可用什么方法？

成塊的組織中細(xì)胞與細(xì)胞靠在一起，彼此限制了細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。取動(dòng)物組織

①蛋白質(zhì)。

②不行，多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2~7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性。

常用胰蛋白酶分散細(xì)胞，①這說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？②用胃蛋白酶行嗎？③Y用胰蛋白酶不會(huì)把細(xì)胞消化掉嗎？三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程③胰蛋白酶適宜用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的消化，但處理時(shí)間不宜太長(zhǎng)。取動(dòng)物組織用機(jī)械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)加培養(yǎng)液3.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞有哪些類型？

第1類：懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞細(xì)胞能夠懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)增殖。

第2類：貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞（多數(shù)）細(xì)胞需要貼附于某些基質(zhì)(如培養(yǎng)瓶壁)表面才能增殖。三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程圓球形細(xì)胞剛開始鋪展貼壁生長(zhǎng)（100×）培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并進(jìn)行有絲分裂（100×）細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)鋪滿瓶壁后出現(xiàn)接觸抑制（100×）細(xì)胞貼壁

懸液中大多數(shù)分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上生長(zhǎng)增殖的現(xiàn)象。接觸抑制

當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖的現(xiàn)象。4.細(xì)胞貼壁與接觸抑制三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程

思考：根據(jù)癌細(xì)胞的特點(diǎn)，想想培養(yǎng)的癌細(xì)胞有無接觸抑制現(xiàn)象？癌細(xì)胞細(xì)胞膜上的糖蛋白減少，細(xì)胞的黏著性降低，在適宜的條件下可以無限增殖，因此培養(yǎng)的癌細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，在培養(yǎng)瓶中能夠生成多層。正常細(xì)胞形成單層細(xì)胞腫瘤細(xì)胞可形成多層細(xì)胞三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動(dòng)物組織用機(jī)械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分散成單個(gè)細(xì)胞解決懸浮生長(zhǎng)貼壁生長(zhǎng)(大多數(shù)）細(xì)胞密度過大、有害代謝物積累、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等接觸抑制傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液細(xì)胞分裂受阻5.為什么要進(jìn)行分瓶培養(yǎng)？三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程取動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)

將分瓶之前的細(xì)胞培養(yǎng)，即動(dòng)物組織經(jīng)過處理后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)

將分瓶后的細(xì)胞培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。用機(jī)械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程

注意：傳代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代以內(nèi)，以保持細(xì)胞正常的二倍體核型。取動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)7.進(jìn)行傳代培養(yǎng)(分瓶培養(yǎng))時(shí)，應(yīng)如何處理？懸浮生長(zhǎng)貼壁生長(zhǎng)胰蛋白酶處理離心法收集制成細(xì)胞懸液分瓶培養(yǎng)用機(jī)械法或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理分瓶培養(yǎng)加培養(yǎng)液三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程課堂小結(jié)培養(yǎng)條件培養(yǎng)過程營(yíng)養(yǎng)：合成培養(yǎng)基+血清其他無菌無毒溫度，pH和滲透壓氣體環(huán)境動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)取動(dòng)物組織分散成單個(gè)細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理取材培養(yǎng)基性質(zhì)特有成分結(jié)果是否體現(xiàn)細(xì)胞的全能性過程比較：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么相同和不同之處？植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理取材培養(yǎng)基性質(zhì)特有成分結(jié)果是否體現(xiàn)細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖（有絲分裂）離體植物器官、組織、細(xì)胞動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官蔗糖，植物激素葡萄糖，血清固體液體(培養(yǎng)液)一般獲得新的植株獲得大量細(xì)胞是否比較：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)有什么相同和不同之處？植物組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程相同點(diǎn)①培養(yǎng)過程中細(xì)胞都進(jìn)行有絲分裂，不涉及減數(shù)分裂。②均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件。2024/4/21取動(dòng)物組織細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)分瓶傳代培養(yǎng)分散成單個(gè)細(xì)胞胰蛋白酶外植體脫分化愈傷組織再分化根、芽試管苗完整植株移栽成活學(xué)習(xí)內(nèi)容干細(xì)胞培養(yǎng)及其應(yīng)用

動(dòng)物和人體內(nèi)仍保留著少數(shù)具有分裂和分化能力的細(xì)胞。1、干細(xì)胞概念：2、存在部位：、和等多種器官和組織中。

臍帶血骨髓早期胚胎3、種類：①胚胎干細(xì)胞②成體干細(xì)胞干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用（1）胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）①分布：存在于早期胚胎中。②特點(diǎn)：

具有分化為成年動(dòng)物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能。③實(shí)例：ES細(xì)胞在體外分化成心肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和造血干細(xì)胞等。干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用

神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)干細(xì)胞、睪丸中的精原干細(xì)胞、骨髓中的造血干細(xì)胞等。（2）成體干細(xì)胞①分布：存在于成體組織或器官內(nèi)中。③舉例：②特點(diǎn)：④發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的、應(yīng)用最成熟的實(shí)例：造血干細(xì)胞。主要存在于成體的骨髓、外周血和臍帶血中。

一般認(rèn)為，成體干細(xì)胞具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力。T淋巴細(xì)胞造血干細(xì)胞巨噬細(xì)胞紅細(xì)胞

B淋巴細(xì)胞血小板肥大粒細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用

有著自我更新能力及分化潛能的干細(xì)胞，與組織、器官的發(fā)育、再生和修復(fù)等密切相關(guān)。4.干細(xì)胞的應(yīng)用（1）應(yīng)用原理：干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用（2）應(yīng)用實(shí)例：

①2018年，論文“人類胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的心臟中恢復(fù)功能”發(fā)表在《自然—生物技術(shù)》雜志上。研究表明，隨著時(shí)間的推移，猴子的新心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)育，血管化并導(dǎo)致心臟功能改善。（3）應(yīng)用前景閱讀資料，展望應(yīng)用前景干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用

前景展望———如果臨床實(shí)驗(yàn)?zāi)茏C實(shí)，胚胎干細(xì)胞將有望修復(fù)人因心肌梗塞、心臟病等疾病受損的心臟。

②《細(xì)胞發(fā)育》雜志刊登德國(guó)研究人員從雄性老鼠胚胎中提取胚胎干細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)室中加以培育，并用視黃酸等物質(zhì)促使胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫蛹?xì)胞的文章。干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用

前景展望———解決人類不育難題。（3）應(yīng)用前景閱讀資料，展望應(yīng)用前景

③生物資訊網(wǎng)2005年11月17日訊：近日，英國(guó)倫敦帝國(guó)學(xué)院的科學(xué)家成功地利用人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)出了軟骨細(xì)胞。干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用

前景展望———用新的軟骨修復(fù)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的損傷。

前景展望———培育出人造組織器官，用于器官移植，治療人類的某些頑癥。

④目前，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，用ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的某些組織細(xì)胞已成功地治愈人類的糖尿病、肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。（3）應(yīng)用前景閱讀資料，展望應(yīng)用前景5.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）（1）胚胎干細(xì)胞的局限性：

胚胎干細(xì)胞必須從_____中獲取，涉及__________，因而限制了在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。胚胎倫理問題（2）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞概念：

通過體外誘導(dǎo)已經(jīng)分化的體細(xì)胞（例如小鼠的成纖維細(xì)胞等）獲得了類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，簡(jiǎn)稱iPS細(xì)胞。干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用2006年，科學(xué)家通過體外誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞，獲得了類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞，將它成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（簡(jiǎn)稱iPS細(xì)胞），之后用iPS細(xì)胞治療了小鼠的鐮狀細(xì)胞貧血。2007年，科學(xué)家通過類似的方法成功誘導(dǎo)出人類的iPS細(xì)胞。成纖維細(xì)胞T細(xì)胞和B細(xì)胞iPS細(xì)胞導(dǎo)入特定基因?qū)胩囟ǖ鞍仔》肿踊衔镎T導(dǎo)治療心血管疾病治療阿爾茨海默病…

…（3）誘導(dǎo)方法：（4）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：

①誘導(dǎo)過程無須破壞胚胎。②iPS細(xì)胞可以來源于病人自身的體細(xì)胞，將它移植回病人體內(nèi)后，理論上可以避免免疫排斥反應(yīng)。干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）多種體細(xì)胞iPS細(xì)胞用于治療人類疾病示意圖定向誘導(dǎo)分化體外誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用移植到病人體內(nèi)6.干細(xì)胞應(yīng)用展望與面臨問題干細(xì)胞將在再生醫(yī)學(xué)、藥物安全性與有效性檢測(cè)等領(lǐng)域發(fā)揮大作用。（1）面臨的問題：存在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。（2）應(yīng)用展望：干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用干細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用干細(xì)胞的分布誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）干細(xì)胞的種類干細(xì)胞應(yīng)用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）成體干細(xì)胞應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)課堂小結(jié)干細(xì)胞類別

來源或存在特點(diǎn)胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)成體干細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)早期胚胎具有分化成為成年動(dòng)物體內(nèi)的任何一種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織和器官甚至個(gè)體的潛能。成體組織或器官具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織，不具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力。誘導(dǎo)高度分化的組織細(xì)胞形成類似胚胎干細(xì)胞；誘導(dǎo)無需破壞細(xì)胞，避免免疫排斥反應(yīng)，應(yīng)用前景更廣泛。探討點(diǎn)一：三種胚胎干細(xì)胞的比較2.2動(dòng)物細(xì)胞工程二動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體第2章細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（基礎(chǔ)）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)和單克隆抗體動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程3.干細(xì)胞培養(yǎng)及應(yīng)用1.動(dòng)物細(xì)胞融合2.單克隆抗體及其應(yīng)用舊知復(fù)習(xí)植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型。

思考:有沒有技術(shù)讓不同種動(dòng)物的體細(xì)胞雜交，培育出集不同細(xì)胞優(yōu)勢(shì)于一身的動(dòng)物細(xì)胞呢？1970年熒光標(biāo)記的人-鼠細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D實(shí)例：

如果讓動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行融合，與植物有哪些不同之處？思考：無需去除細(xì)胞壁全能性受限制，不能培育成新的動(dòng)物個(gè)體動(dòng)物細(xì)胞融合時(shí)間成果19世紀(jì)30年代觀察到肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中有多核細(xì)胞1858年觀察到正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。1876年在無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1962年日本學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1965年英國(guó)科學(xué)家證實(shí)了滅活的病毒可誘發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌穩(wěn)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代發(fā)展出了電融合技術(shù)(1985年酵母原生質(zhì)體電融合)補(bǔ)充資料：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展歷史

將兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞融合成一個(gè)雜交細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞膜的流動(dòng)性原理發(fā)展出雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體應(yīng)用誘導(dǎo)因素

PEG融合法電融合法滅活的病毒誘導(dǎo)法(動(dòng)物細(xì)胞融合特有)形成雜交細(xì)胞。即融合后形成的原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。結(jié)果動(dòng)物細(xì)胞融合意義①突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。②成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。③利用細(xì)胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。

動(dòng)物細(xì)胞融合問題：誘導(dǎo)融合后的細(xì)胞一定具有雙方的遺傳信息嗎？

為什么？不一定，誘導(dǎo)A、B兩種細(xì)胞融合，融合后可能有A、B未融合細(xì)胞及AA、AB、BB等多種細(xì)胞，因此細(xì)胞融合后需要進(jìn)行篩選。病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。滅活：用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但是并不破壞這些病毒的抗原結(jié)構(gòu)。細(xì)胞融合的過程兩種細(xì)胞→物理、化學(xué)或生物誘導(dǎo)→融合(膜融合→質(zhì)融合→核融合)動(dòng)物細(xì)胞融合利用細(xì)胞融合進(jìn)行基因定位已知人的體細(xì)胞和小鼠的體細(xì)胞(2N=40)雜交(融合)后，雜種細(xì)胞在有絲分裂過程中，人的染色體逐漸地丟失，最后僅保留少數(shù)幾條。由于人染色體的丟失是隨機(jī)的，因此不同的雜種細(xì)胞會(huì)保留不同的人染色體。

結(jié)論：人胸苷激酶基因位于17號(hào)染色體上。動(dòng)物細(xì)胞融合應(yīng)用植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合的比較比較項(xiàng)目植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理融合前處理誘導(dǎo)融合的方法意義和用途克服遠(yuǎn)源雜交的障礙，獲得雜種植株細(xì)胞膜的流動(dòng)性細(xì)胞膜的流動(dòng)性植物細(xì)胞的全能性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（PEG）物理、化學(xué)方法（PEG）

滅活的病毒制備單克隆抗體動(dòng)物細(xì)胞融合討論

1.血清抗體有什么缺點(diǎn)？2003年爆發(fā)SARS期間及2020年爆發(fā)的COVID-19期間，醫(yī)生通過臨床輸注康復(fù)者或恢復(fù)期的患者血漿制成的免疫球蛋白預(yù)防病毒的入侵?？乖患兛贵w不純?nèi)毕荩?/p>

產(chǎn)量低、純度低，

且抗體的特異性差、靈敏度低。不能無限增殖產(chǎn)生大量抗體動(dòng)物體內(nèi)抗原

刺激漿細(xì)胞抗體篩選單一B細(xì)胞增殖分化過渡:傳統(tǒng)抗體的缺陷單克隆抗體的故事

１）體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類多達(dá)百萬種以上２）每個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性的抗體1、科學(xué)家發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)慰寺】贵w

一個(gè)B淋巴細(xì)胞抗體

細(xì)胞群克隆如何獲得大量、單一的抗體？體外培養(yǎng)時(shí)，一個(gè)B淋巴細(xì)胞不能無限增殖2、需解決問題：3、遺憾：如何解決這一難題？癌細(xì)胞１.我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無限增殖的２.有什么方法能使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和無限增殖能力同時(shí)具備思考：動(dòng)物細(xì)胞融合一個(gè)極富創(chuàng)造力的方案：動(dòng)物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體1975年，米爾斯坦和柯勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)單克隆抗體的故事

由單一B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的特異性強(qiáng)的抗體。特異性強(qiáng)，靈敏度高，可大量制備特點(diǎn)運(yùn)載藥物“生物導(dǎo)彈”=單克隆抗體+藥物應(yīng)用作為診斷試劑治療疾病單克隆抗體①概念②應(yīng)用注射特定蛋白免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞多種融合細(xì)胞融合融合單克隆抗體③制備過程單克隆抗體③制備過程多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)基篩選克隆化培養(yǎng)專一抗體檢測(cè)篩選能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體單克隆抗體體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)大量制備單克隆抗體③制備過程注射特定蛋白免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞多種細(xì)胞↓↓多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞↓融合↓選擇培養(yǎng)基篩選克隆化培養(yǎng)專一抗體檢測(cè)體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體單克隆抗體③制備過程單克隆抗體③制備過程

補(bǔ)充資料：第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細(xì)胞方法？B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（A）合成DNAD途徑S途徑D途徑氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3選擇性培養(yǎng)基：

在該培養(yǎng)基上，_______________細(xì)胞和____________________的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜種細(xì)胞才能生長(zhǎng)。未融合的親本融合的具有同種核單克隆抗體③制備過程陽性孔在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時(shí)間后，檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔多孔細(xì)胞培養(yǎng)板抗體檢測(cè)板分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞抗體檢測(cè)的方法——抗原-抗體雜交法兩次篩選第一次篩選第二次篩選目的：方法：目的：方法：篩選出融合的雜種細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞

)這種雜種細(xì)胞既能無限增殖，又能產(chǎn)生專一性抗體。特定的選擇性培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜種細(xì)胞才能生長(zhǎng)。篩選出分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)，經(jīng)多次篩選。單克隆抗體③制備過程選擇培養(yǎng)基篩選單克隆抗體誘導(dǎo)融合注射特定蛋白免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（A）多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)基篩選專一抗體檢測(cè)注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)注射特定蛋白免疫小鼠培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（A）多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)專一抗體檢測(cè)注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)課堂檢測(cè)單克隆抗體④應(yīng)用利用放射性同位索標(biāo)記的單克隆杭體，在特定的組織中成像的枝術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。作為診斷試劑用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，靈敏度很高，在妊娠的第８天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了10天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率在90％以上。實(shí)例1：早早孕檢測(cè)試紙(條)具有準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速特點(diǎn).診斷優(yōu)點(diǎn)：原理：抗原-抗體雜交法

在受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞就會(huì)分泌人絨毛膜促性腺激素(HCG)，一種糖蛋白類激素，在孕婦的尿液中大量存在。而在非妊娠婦女尿液中幾乎不含有。單克隆抗體④應(yīng)用病毒蛋白的檢測(cè)依賴抗體。只要找到了親和力足夠高，特異性足夠好的抗體，就可以省去提取病毒RNA的繁瑣步驟，直接用發(fā)病期患者的血清或痰液進(jìn)行蛋白免疫分析，在短時(shí)間內(nèi)就可得到結(jié)果。用抗原免疫動(dòng)物(兔、鼠等)，對(duì)動(dòng)物的免疫細(xì)胞進(jìn)行篩查，找到能用來生產(chǎn)高特異性抗體的淋巴細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，得到可用的單克隆抗體。相比基于RNA的PCR試劑盒(核酸檢測(cè))，蛋白檢測(cè)試劑盒所需的開發(fā)時(shí)間要更長(zhǎng)，生產(chǎn)成本要更高。而且具有滯后性，不能及時(shí)檢測(cè)出是否感染病毒。準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速實(shí)例2：2019-nCoV檢測(cè)：抗原-抗體檢測(cè)單克隆抗體④應(yīng)用抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體乙肝測(cè)定試劑艾滋病檢測(cè)試劑單克隆抗體④應(yīng)用用于治療疾病和運(yùn)載藥物單克隆抗體主要用于癌癥治療，也有少量用干其他疾病的治療。單抗藥物劑型種類繁多，有單獨(dú)使用的，也有與同位素、毒素、藥物結(jié)合使用的。

②用于疾病檢測(cè)

甲胎蛋白（AFP）是一種特異性較強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，用甲胎蛋白作為______免疫小鼠，制備__________________，并與含有放射性同位素的標(biāo)記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標(biāo)記物通過血液可到達(dá)全身幾乎所有組織。由于腫瘤細(xì)胞表面的______會(huì)和單克隆抗體特異性的結(jié)合，所以放射性同位素標(biāo)記物就不斷積累在______上。通過一定的顯影技術(shù)就可以發(fā)現(xiàn)腫瘤所在?？乖笰FP單克隆抗體AFP腫瘤資料：使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。ADC示意圖問題：細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害。解決方法：抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC)，將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷?？贵w藥物接頭(主要用于癌癥治療)如：?jiǎn)慰寺】贵w+藥物=“生物導(dǎo)彈”優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小(“生物導(dǎo)彈”—單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)單克隆抗體④應(yīng)用ADC的作用機(jī)制示意圖①ADC②③④溶酶體裂解釋放藥物⑤細(xì)胞凋亡(主要用于癌癥治療)如：?jiǎn)慰寺】贵w+藥物=“生物導(dǎo)彈”優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用小(“生物導(dǎo)彈”—單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)單克隆抗體④應(yīng)用小結(jié):單克隆抗體

某生物興趣小組對(duì)一種抗癌新藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，以動(dòng)物肝癌細(xì)胞為材料，測(cè)定抗癌藥物對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響。請(qǐng)回答下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問題：(1)在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需量嚴(yán)格配制而成的培養(yǎng)基稱為_______培養(yǎng)基。通常在培養(yǎng)基中還需要加入適量

等一些天然成分。培養(yǎng)所需的氣體環(huán)境一般是

;其中CO2的作用是________________。另外，還應(yīng)該保證被培養(yǎng)的細(xì)胞處于_____、_____的環(huán)境。課堂評(píng)價(jià)合成血清維持培養(yǎng)液的pH無菌無毒95%的空氣和5%的CO2(2)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需首先利用

處理肝組織塊，使其分散成單個(gè)細(xì)胞，然后制成細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。用于實(shí)驗(yàn)的肝組織塊一般從幼齡小鼠獲取，原因是

。胰蛋白酶（或膠原蛋白酶）幼齡小鼠肝細(xì)胞分裂能力強(qiáng)(3)在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)到一定程度時(shí)，其生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，這種現(xiàn)象稱為____________。接觸抑制(4)請(qǐng)你幫助興趣小組的同學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的自變量是_________________，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組除了自變量不同外，其他處理均應(yīng)該相同，這是為了遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的_____________原則。是否加入抗癌藥物單一變量課堂評(píng)價(jià)

(5)已知肝細(xì)胞中X基因的過量表達(dá)與肝腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，若要檢測(cè)某種抗癌藥物的療效，應(yīng)該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?請(qǐng)寫出實(shí)驗(yàn)的主要思路。

將肝癌細(xì)胞分為A、B兩組，A組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含該藥物的無菌生理鹽水，B組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入等量的不含該藥物無菌生理鹽水，經(jīng)培養(yǎng)后從A、B兩組收集等量細(xì)胞，通過分別檢測(cè)X基因在A、B兩組細(xì)胞中的mRNA或蛋白質(zhì)合成水平的差異確定該藥物的藥效。

下圖為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程示意圖，請(qǐng)回答下列問題：

(1)容器A中放入的一般是健康幼齡動(dòng)物的器官或組織，原因是其細(xì)胞____________、易于培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)要用胰蛋白酶分散細(xì)胞，胰蛋白酶的處理時(shí)間不能過長(zhǎng)，原因是______________________________。(2)將B瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入C瓶進(jìn)行的初次培養(yǎng)稱為__________。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需要提供O2和CO2等氣體環(huán)境，CO2的作用主要是___________________。分裂能力強(qiáng)胰蛋白酶會(huì)分解細(xì)胞的其他蛋白質(zhì)原代培養(yǎng)維持培養(yǎng)液的pH綜合應(yīng)用

(3)下圖表示血清對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞培養(yǎng)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

①據(jù)圖可知，有無添加血清對(duì)培養(yǎng)______細(xì)胞的影響較大。

②在探究物質(zhì)X對(duì)正常細(xì)胞增殖的影響時(shí)，必須采用有血清培養(yǎng)，據(jù)圖分析原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。正常

人們對(duì)細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還沒完全研究清楚，正常細(xì)胞培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基通常都需要加入血清等一些天然成分。無血清培養(yǎng)的正常細(xì)胞增殖受抑制，不能判斷物質(zhì)X對(duì)細(xì)胞增殖的