第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物科學(xué)與工程系發(fā)酵工程第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.1發(fā)酵工業(yè)的無菌處理滅菌

sterilization

用物理或化學(xué)方法殺死物料或設(shè)備中所有生命物質(zhì)的過程。適用于培養(yǎng)基等物料的無菌處理消毒

disinfection

用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以及容器和器具表面的微生物。一般只能殺死營養(yǎng)細(xì)胞，而不能殺死芽孢和孢子，適用于發(fā)酵車間的環(huán)境和發(fā)酵設(shè)備、器具的無菌處理除菌

degerming

用過濾方法除去空氣或液體中的微生物及其孢子。防腐

antisepsis

用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的生長和繁殖。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.2發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略

4.2.1污染的危害所謂“雜菌”，

是指在發(fā)酵培養(yǎng)中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)，都有可能遭受雜菌的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或產(chǎn)品質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)①發(fā)酵培養(yǎng)基因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降。②雜菌合成一些新的代謝產(chǎn)物，或雜菌污染后改變了發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)，使發(fā)酵產(chǎn)物的提取和分離變得困難，造成產(chǎn)物收率降低或產(chǎn)品質(zhì)量下降。③雜菌代謝會(huì)改變?cè)磻?yīng)體系的pH，使發(fā)酵發(fā)生異常變化。④雜菌分解產(chǎn)物，使生產(chǎn)失敗。⑤細(xì)菌發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解，導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵失敗等。4.2發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略

4.2.1污染的危害第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)染菌對(duì)不同菌種發(fā)酵的影響青霉素發(fā)酵：污染細(xì)短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大鏈霉素發(fā)酵：污染細(xì)短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害大四環(huán)素發(fā)酵：污染雙球菌、芽孢桿菌和夾膜桿菌的危害較大檸檬酸發(fā)酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸發(fā)酵：污染芽孢桿菌的危害最大谷氨酸發(fā)酵：最怕污染噬菌體高溫淀粉酶發(fā)酵：污染芽孢桿菌和噬菌體的危害較大第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)不同發(fā)酵時(shí)期染菌對(duì)發(fā)酵的影響①種子擴(kuò)大時(shí)期染菌

菌體濃度低、培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富。②發(fā)酵前期染菌

雜菌與生產(chǎn)菌爭(zhēng)奪營養(yǎng)成分，干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的形成。③發(fā)酵中期染菌

嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的繁殖和產(chǎn)物的生成。

④發(fā)酵后期染菌

如雜菌量不大，可繼續(xù)發(fā)酵。如污染嚴(yán)重，可采取措施提前放罐。

第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)雜菌污染對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響①對(duì)過濾的影響

發(fā)酵液的粘度加大；菌體大多自溶；由于發(fā)酵不徹底，基質(zhì)的殘留濃度加大。造成過濾時(shí)間拉長，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用，破壞生產(chǎn)平衡；大幅度降低過濾收率。②對(duì)提取的影響

（1）有機(jī)溶劑萃取工藝：染菌的發(fā)酵液含有更多的水溶性蛋白質(zhì)，易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開

（2）離子交換工藝：雜菌膠體物質(zhì)易粘附在離子交換樹脂表面或被離子交換樹脂吸附，大大降低離子交換樹脂的交換量。

③對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響

（1）對(duì)內(nèi)在質(zhì)量的影響：染菌的發(fā)酵液含有較多的蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。對(duì)產(chǎn)品的純度有較大影響。

（2）對(duì)產(chǎn)品外觀的影響：一些染菌的發(fā)酵液經(jīng)處理過濾后得到澄清的發(fā)酵液，放置后會(huì)出現(xiàn)混濁，影響產(chǎn)品的外觀。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)不同染菌途徑對(duì)發(fā)酵的影響

種子帶菌：種子帶菌可使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性

空氣帶菌：空氣帶菌也使發(fā)酵染菌具有延續(xù)性，導(dǎo)致染菌范圍擴(kuò)大至所有發(fā)酵罐

培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底：一般為孤立事件，不具有延續(xù)性

設(shè)備滲漏：這種途徑造成染菌的危害性較大

第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)染菌對(duì)三廢處理的影響

使過濾后的廢菌體無法利用，發(fā)酵染菌的廢液，生物需氧量（BOD）增高，增加三廢治理費(fèi)用和時(shí)間。發(fā)酵染菌的危害

（1）直接經(jīng)濟(jì)損失

（2）間接經(jīng)濟(jì)損失

第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.2.2雜菌污染的防治

染菌的檢查與類型的判斷顯微鏡檢查法平板劃線培養(yǎng)檢查法肉湯培養(yǎng)檢查法發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象觀察法溶氧pH尾氣CO2發(fā)酵氣味、黏度、泡沫、顏色谷氨酸發(fā)酵時(shí)正常和異常的溶氧曲線.cn/07/wsw/kaifang06_7_2.htm

第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)污染的原因分析種子帶菌、空氣帶菌、設(shè)備滲漏、滅菌不徹底、操作失誤、技術(shù)管理不善…（1）從污染雜菌的種類進(jìn)行分析

若污染的是耐熱芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底；若污染的是球菌、無芽孢桿菌等不耐熱菌，可能是種子帶菌、空氣除菌不徹底、設(shè)備滲漏等原因造成；若污染的是淺綠色菌落的雜菌，可能是冷卻盤管滲漏引起；若污染的是霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或無菌操作問題引起；如污染的是酵母，則可能是由于糖液滅菌不徹底造成。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)污染的原因分析（2）從污染時(shí)間進(jìn)行分析

若發(fā)酵前期染菌，可能是種子帶菌、培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底、接種操作不當(dāng)或空氣帶菌等；若發(fā)酵后期染菌，可能是由于中間補(bǔ)料污染、設(shè)備滲漏或操作問題等引起。（3）從染菌的程度進(jìn)行分析

如各個(gè)發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌，而且污染的是同一雜菌，一般是空氣系統(tǒng)存在問題。如果個(gè)別罐連續(xù)染菌，一般是某個(gè)設(shè)備的問題。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)染菌原因染菌率（%）染菌原因染菌率（%）種子帶菌接種時(shí)罐壓跌零培養(yǎng)基滅菌不透空氣系統(tǒng)帶菌泡沫冒頂夾套穿孔盤管穿孔9.640.190.7919.960.4812.365.89接種管穿孔閥門滲漏攪拌軸密封滲漏發(fā)酵罐蓋漏其他設(shè)備滲漏操作問題原因不明0.391.452.091.5410.1310.1524.91染菌原因染菌率（%）染菌原因染菌率（%）外界帶入雜菌（取樣、補(bǔ)料等操作帶入）設(shè)備穿孔空氣系統(tǒng)帶菌停電罐壓跌零接種8.207.6026.001.6011.00蒸汽壓力不夠管理問題操作違反規(guī)程種子帶菌原因不明0.607.091.600.6035.00表4.1某研究所對(duì)抗生素發(fā)酵染菌的原因分析表4.2某制藥廠鏈霉素發(fā)酵染菌原因分析第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)雜菌污染的途徑及其預(yù)防（1）種子帶菌及其防治①培養(yǎng)基及器具徹底滅菌②避免菌種在移接過程中受污染③避免菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受雜菌污染（2）過濾空氣帶菌及其防治①正確選擇采氣口，提高采氣口，加裝前置粗過濾器…②更加發(fā)酵工廠所在地區(qū)的氣候條件，設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理流程，防止空氣冷卻器滲漏，勿使冷卻水進(jìn)入空氣處理系統(tǒng)…③設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)雜菌污染的途徑及其預(yù)防（3）設(shè)備的滲漏或“死角”造成的染菌及其防治①發(fā)酵罐的“死角”②管道安裝不當(dāng)或配置不合理形成的“死角”第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)雜菌污染的途徑及其預(yù)防（4）培養(yǎng)基滅菌不徹底導(dǎo)致染菌及其防治①原料性狀的影響②滅菌時(shí)溫度與壓力不對(duì)應(yīng)造成染菌③滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌④連續(xù)滅菌維持時(shí)間不夠或壓力波動(dòng)大而造成染菌⑤滅菌后期的罐壓驟變?cè)斐扇揪?）操作不當(dāng)造成染菌接種時(shí)，罐壓跌零；泡沫頂蓋。。。（6）噬菌體染菌及其防治第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.3發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)

干熱滅菌法濕熱滅菌法（蒸汽的強(qiáng)穿透能力，及冷凝時(shí)釋放大量潛熱）121℃，30min射線滅菌法化學(xué)藥劑滅菌法過濾除菌法火焰滅菌法（僅適用于金屬或玻璃小用具，接種時(shí)常用火圈）第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌

4.4.1濕熱滅菌原理

致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需時(shí)間。微生物的熱阻：微生物對(duì)熱的抵抗力，即微生物在某一特定條件下（主要是溫度）的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻：某一微生物在某一條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間之比。微生物名稱大腸桿菌細(xì)菌芽孢霉菌孢子病毒相對(duì)熱阻13×1062~101~5表4.3某些微生物對(duì)濕熱的相對(duì)熱阻第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)濕熱滅菌的對(duì)數(shù)殘留定律一定溫度下，微生物受熱致死遵循分子反應(yīng)速率理論，微生物受熱死亡的速率式中N—?dú)埩艋罹鷶?shù)，個(gè)

t—受熱時(shí)間，mink—比死亡速率常數(shù)，min-1，也稱滅菌速率常數(shù)，與微生物的種類及滅菌溫度有關(guān)（4-1）第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)

若開始滅菌（t=0）時(shí)，培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0，將式（4-1）積分后可得到式中N0—開始滅菌時(shí)原有的活菌數(shù)，個(gè)；

Nt—經(jīng)過t時(shí)間滅菌后的殘留菌數(shù)，個(gè)。（4-2）（4-3）第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)

實(shí)驗(yàn)還證明，細(xì)菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)與營養(yǎng)細(xì)胞的有所不同。它表現(xiàn)為非對(duì)數(shù)的死亡動(dòng)力學(xué)。這可能與孢子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。但當(dāng)溫度超過120℃時(shí)，熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱殺滅動(dòng)力學(xué)也接近對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)即符合一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。TimeNt/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌熱死亡曲線第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素污染菌的種類、數(shù)量、滅菌溫度和時(shí)間…培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基pH培養(yǎng)基的物理狀態(tài)泡沫培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4.2分批滅菌

將配制好的培養(yǎng)基放入發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行滅菌的操作過程，也稱實(shí)罐滅菌。不需專門的滅菌設(shè)備，投資少，設(shè)備簡單，滅菌效果可靠。對(duì)蒸汽的要求較低，一般在（3~4)×105Pa(表壓)就可滿足要求，分批滅菌是中小型發(fā)酵罐常用的一種滅菌方法。包括升溫、保溫、降溫三個(gè)過程第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4.3連續(xù)滅菌

將配制好的培養(yǎng)基向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫和冷卻等滅菌操作過程。可在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并能很快被冷卻，可在比分批滅菌更高的溫度下滅菌，而保溫時(shí)間則很短，有利于減少營養(yǎng)物質(zhì)的破壞，提高發(fā)酵產(chǎn)率。在連續(xù)滅菌時(shí)，發(fā)酵罐應(yīng)在連續(xù)滅菌前先進(jìn)行空罐滅菌，以容納經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基。加熱器、維持罐和冷卻器也應(yīng)先進(jìn)行滅菌。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)冷卻塔第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)連續(xù)滅菌設(shè)備的結(jié)構(gòu)

是培養(yǎng)液高溫短時(shí)間連續(xù)滅菌設(shè)備，它與維持罐組成連續(xù)滅菌系統(tǒng)，分套管式和汽液混合式兩類。套管式連消塔汽液混合式連消塔第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)噴射加熱器可使料液和蒸汽迅速接觸，充分混合，加熱是在瞬時(shí)內(nèi)完成的。生料加熱料蒸汽第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)維持罐滅菌系統(tǒng)中的維持設(shè)備，主要是使加熱后的培養(yǎng)基在維持設(shè)備中保溫一段時(shí)間，以達(dá)到滅菌的目的，也稱保溫設(shè)備。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)薄板換熱器第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌技術(shù)①種子罐、發(fā)酵罐、計(jì)量罐、補(bǔ)料罐等的空罐滅菌及管道滅菌從有關(guān)管道通入蒸汽，使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa，維持45min，滅菌過程中，從所有液位以上的閥門、邊閥排出空氣，并使蒸汽通過這些閥門以防出現(xiàn)死角。滅菌完畢后關(guān)閉蒸汽，待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時(shí)，通入無菌空氣以保壓0.098MPa。②空氣總過濾器和分過濾器滅菌

排出過濾器中的空氣，從過濾器上部通入蒸汽，并從上下口排蒸汽，維持壓力0.147MPa滅菌2h。滅菌完畢后，通入壓縮空氣吹干。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌技術(shù)③種子培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層通入蒸汽間接加熱至80℃，再從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、接種管等液面以下的閥門通入蒸汽，進(jìn)行直接加熱。同時(shí)關(guān)閉夾層蒸汽進(jìn)口閥門、升溫至121℃，維持30min。④發(fā)酵培養(yǎng)基實(shí)罐滅菌從夾層或盤管式換熱器進(jìn)入蒸汽，間接加熱至90℃，關(guān)閉夾層及盤管蒸汽，從取樣管、進(jìn)風(fēng)管、放料管等液面以下的閥門通入蒸汽，直接加熱至121℃，維持30min。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.4.4發(fā)酵培養(yǎng)基及設(shè)備管道滅菌技術(shù)⑤發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌

一般培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌采用滅菌溫度130℃，維持5min。⑥補(bǔ)料實(shí)罐滅菌根據(jù)料液不同而異，淀粉料液為121℃，維持5~10min。尿素溶液滅菌為105℃，維持5min。第4章發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)4.5空氣除菌提高除菌效率的主要措施：①減少進(jìn)口空氣的含菌數(shù)量②設(shè)計(jì)和安裝合理的空氣過濾器，選用除菌效率高的過濾介質(zhì)③針對(duì)不同地區(qū)，設(shè)計(jì)合理的空氣預(yù)處理