藥物分析實驗武漢大學(xué)藥學(xué)院第一章藥物分析實驗須知 2第一節(jié)藥物分析實驗的性質(zhì)和基本要求 2第二節(jié)實驗室安全知識 第三節(jié)原始記錄與實驗報告 第四節(jié)實驗考核方式 5第二章藥物的鑒別試驗 6實驗一典型藥物的鑒別試驗 6第三章藥物的雜質(zhì)檢查 實驗二藥物的一般雜質(zhì)檢查 五種無機(jī)雜質(zhì)的檢查………13實驗三藥物的一般雜質(zhì)檢查 殘留溶劑的檢查……………18實驗四藥物的特殊雜質(zhì)檢查 色譜分析法檢查藥物中的有關(guān)物質(zhì)…………22第四章藥物制劑的常規(guī)檢查 實驗五藥物制劑的含量均勻度和溶出度檢查 第五章藥物的含量測定 實驗六雙相滴定法測定水溶性有機(jī)酸鹽類藥物的含量 實驗七亞硝酸鈉滴定法測定含芳伯氨基藥物的含量 實驗八非水溶液滴定法測定化學(xué)原料藥含量 實驗九旋光法、折光法和剩余滴定法測定葡萄糖注射液含量 實驗十紫外分光光度法測定復(fù)方磺胺嘧啶片含量 實驗十一高效液相色譜法測定復(fù)方磺胺甲噁唑片含量 實驗十二氣相色譜法測定維生素E膠丸含量 第六章綜合性實驗 實驗十三化學(xué)原料藥及其制劑的全質(zhì)量檢驗 實驗十四中藥制劑的全質(zhì)量檢驗 第七章設(shè)計性實驗 實驗十五藥物制劑的HPLC含量測定方法建立與驗證 實驗十六藥物制劑的毛細(xì)管電泳含量測定方法建立與驗證 實驗十七藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂 實驗十八血漿或尿液中藥物色譜分析方法的建立與驗證 參考文獻(xiàn) 2第一章藥物分析實驗須知第一節(jié)藥物分析實驗的性質(zhì)和基本要求1.藥物分析實驗的性質(zhì)方法和基本操作技能，熟練使用各種分析儀器，全面了解藥品檢驗工作的基本程責(zé)任意識、質(zhì)量意識和安全意識，培養(yǎng)嚴(yán)肅認(rèn)真、實事求是的科學(xué)態(tài)度和工作作風(fēng)。(1)進(jìn)入實驗室應(yīng)穿白色工作服，保持實驗室安靜及室內(nèi)衛(wèi)生和整潔，不得將與實驗(2)實驗室禁止吃東西、吸煙。(3)實驗課前做好預(yù)習(xí)，明確每次實驗的目的要求，熟悉原理和操作要點，預(yù)先安排(4)認(rèn)真掌握操作技術(shù)，細(xì)心觀察實驗現(xiàn)象。在嚴(yán)格按實驗規(guī)程操作、虛心接受教師(5)為防止試劑、藥品污染，取用時應(yīng)仔細(xì)觀察標(biāo)簽和取用工具上的標(biāo)志，杜絕錯蓋瓶蓋或不隨手加蓋的現(xiàn)象發(fā)生。當(dāng)不慎發(fā)生試劑污染時，應(yīng)及時報告任課藥品應(yīng)在指定位置取用。取出的試劑、藥品不能再倒回原瓶。未經(jīng)允許不(6)愛護(hù)儀器和公物，節(jié)約試劑、藥品和水電；破損儀器應(yīng)及時登記報損、補(bǔ)發(fā)。使(7)可回收利用的廢溶劑應(yīng)回收至指定的容器中；有毒、腐蝕性等物質(zhì)，按教師要求存放，不可任意丟棄；濾紙、火柴棒、碎玻璃等應(yīng)投入廢物簍，切勿丟入水池內(nèi)。(8)實驗完畢應(yīng)認(rèn)真清理實驗臺，儀器洗凈后放回原處，擦凈臺面，晾好抹布、毛刷、放齊凳子、鎖好柜子，經(jīng)教師同意后，方可離開。值日生還應(yīng)負(fù)責(zé)(9)認(rèn)真處理數(shù)據(jù)、總結(jié)實驗結(jié)果，按要求撰寫實驗報告，并在規(guī)定時間內(nèi)上交。3(10)各組及同學(xué)之間應(yīng)相互協(xié)作，合理安排實驗時間、實驗內(nèi)容和后續(xù)工作。在藥物分析實驗中常接觸到有腐蝕性、毒性、易燃燒或易爆炸的化學(xué)試劑和藥品，以及各種電器設(shè)備，如使用不慎易發(fā)生危險。劑的性質(zhì)、儀器的性能和正確操作方法有充分的了解驗室的各種安全操作守則。要時刻注意防火、防自動手處理。下面介紹一般實驗室中可能發(fā)生的危險及預(yù)防處理措施。實驗室中失火原因通常是使用或蒸餾易燃液體不謹(jǐn)慎或電器電線有故障。下面是預(yù)防(1)易燃燒物質(zhì)不宜大量存放于實驗室中，應(yīng)貯存在密閉容器內(nèi)并放于陰涼處。(2)加熱低沸點或中等沸點等易燃液體，例如乙醚、二硫化碳、丙酮、苯、酒精等最好是用水蒸氣加熱，至少用水浴加熱，并時時察看檢查，不得離開操作崗位。切不能用直火(3)在實驗中使用或傾倒易燃物質(zhì)時，注意要遠(yuǎn)離火源。(4)身上或手上沾有易燃物質(zhì)時，應(yīng)立即清洗干凈，不得靠近火源。(5)易燃液體的廢液應(yīng)倒入專用貯存器，不得倒入下水道，以免引起燃燒、爆炸等事(6)磷與空氣接觸，易自發(fā)著火，宜貯存在水中；金屬鈉暴露于空氣中能自發(fā)著火，(1)乙醚在室溫時的蒸氣壓很高，乙醚和空氣或氧氣混合時能產(chǎn)生爆炸性極強(qiáng)的過氧(2)無水過氯酸與還原劑接觸能引起爆炸，無水過氯酸也能自發(fā)爆炸，常用的60%~70%濃度的過氯酸的水溶液，則沒有危險。(3)下列物質(zhì)混合，都可能發(fā)生爆炸。4⑦磷與硝酸、硝酸鹽、氯酸鹽。(4)易發(fā)生爆炸的操作不得對著人進(jìn)行。(5)使用可燃性氣體如氫氣、乙炔等作為儀器的氣源時，氣瓶及儀器管道的接頭處不能漏氣，以免漏氣后與空氣混合發(fā)生爆炸。3.有腐蝕性、毒性的試劑和藥品(1)硫酸、鹽酸、硝酸、冰醋酸、氫氟酸等酸類物質(zhì)腐蝕性很強(qiáng)，能燙傷皮膚產(chǎn)生劇烈的疼痛，甚至發(fā)炎腐爛，酸也能損壞衣物。應(yīng)特別注意勿使酸濺入眼中，嚴(yán)重的能使眼睛失明。鹽酸、硝酸、氫氟酸的蒸氣對呼吸道粘膜及眼睛有強(qiáng)烈的刺激作用，因此在傾倒上述酸類時應(yīng)在毒氣櫥中進(jìn)行，或戴上經(jīng)水或蘇打溶液浸濕的口罩及防護(hù)眼鏡。稀釋硫酸時，應(yīng)謹(jǐn)慎地將濃硫酸漸漸傾注水中，切不可把水傾注濃硫酸中。被酸燙傷時可用大量水沖洗，然后用20%蘇打溶液洗拭。被氫氟酸燙傷時，先用大量冷水沖洗，后用5%蘇打溶液洗拭，再以甘油與氧化鎂糊(2:1)的濕紗布包扎或到醫(yī)院處理。(2)氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿類物質(zhì)，均能腐蝕皮膚及衣服，濃氨水的蒸氣能嚴(yán)重刺激粘膜及傷害眼睛，使流淚并可能引發(fā)各種眼疾。被堿類燙傷時，應(yīng)立即用大量水沖洗，然后再用2%硼酸或醋酸溶液沖洗。(3)濃過氧化氫能引起燙傷，可用熱水或硫代硫酸鈉溶液敷治。苯酚有腐蝕性，使皮膚呈白色燙傷，應(yīng)立即將其除去，否則引起局部糜爛，治愈極慢。(4)溴能刺激呼吸道、眼睛及燒傷皮膚。燒傷處用25%氨溶液-松節(jié)油-95%乙醇(1:1:10)的混合液涂敷處理。(5)氰化鉀、三氧化二砷、升汞、黃磷或白磷皆有劇毒，應(yīng)嚴(yán)格按毒劇物有關(guān)規(guī)定保存、取用，切勿誤入口中，使用后應(yīng)及時洗手。4.用電安全實驗室中由于電線、電氣設(shè)備損壞，或線路安裝不妥，或使用不慎，或?qū)嶒炄藛T缺少用電常識，易發(fā)生觸電事故或火災(zāi)。實驗室用電一般應(yīng)注意：(1)定期檢查電線、電器設(shè)備有無損壞，絕緣是否良好，電線和接頭有無損壞。(2)使用電器時，先應(yīng)認(rèn)真閱讀使用說明書，明確使用方法，不可盲目地接入電源。(3)使用烘箱和高溫爐時，必須確認(rèn)自動控制溫度裝置的可靠性，同時還需人工定時監(jiān)測溫度。(4)不要將電器放在潮濕處，禁止?jié)袷只蛘从惺雏}溶液和無機(jī)酸的手接觸電器，也不5宜站在潮濕的地方使用電器。(5)正確操作閘刀開關(guān)，使閘刀處于完全合上或完全拉斷的位置，不能若即若離，以防接觸不良造成漏電。禁止將電線頭直接插入插座內(nèi)使用。5.玻璃儀器洗滌玻璃器皿，應(yīng)注意安全，以防劃傷；破損的玻璃器皿和碎片應(yīng)放入安全的地方，切第三節(jié)原始記錄與實驗報告進(jìn)入實驗室要隨身攜帶一本預(yù)先編好頁碼的實驗記錄本，用于及時、完整、確切地記錄于實驗記錄本上，絕不允許記于紙條上、手上或其他地方再譽(yù)寫，也不允許暫記在腦子里等下一個數(shù)據(jù)一起記錄。原始記錄是實驗報告的一部分，尊重原始記錄是必要的科學(xué)作風(fēng)。記錄本不準(zhǔn)撕頁，如記錄有誤，只能將寫錯處用雙線劃去(但要求仍能看清原來寫錯的數(shù)值),在其旁寫上正確數(shù)據(jù)，千萬不得涂改，涂改的原始記錄無效。記錄內(nèi)容一般包括供試藥品名稱、來源、批號、數(shù)量、規(guī)格、外觀性狀、包裝情況、實驗中觀察到的現(xiàn)象、檢驗數(shù)據(jù)等。記錄實驗數(shù)據(jù)時，保留幾位有效數(shù)字應(yīng)和所用儀器的準(zhǔn)確程度相適應(yīng)。學(xué)生結(jié)束實驗時，應(yīng)向教師出示有關(guān)實驗結(jié)果和原始記錄，教師在原始記錄本上簽字認(rèn)可后，實驗才能真正完畢。應(yīng)根據(jù)原始記錄，寫出實驗報告。實驗報告應(yīng)包括實驗名稱、實驗日期、實驗?zāi)康摹嶒炘?、操作步驟、實驗數(shù)據(jù)的處理及結(jié)果、問題及討論、結(jié)論等。第四節(jié)實驗考核方式《藥物分析實驗》課程主要考核學(xué)生是否具有：(1)良好的實驗習(xí)慣，嚴(yán)謹(jǐn)求實的科學(xué)態(tài)度和工作作風(fēng)，大膽創(chuàng)新和積極發(fā)現(xiàn)問題、提出問題、分析問題和解決問題的精神和能力；(2)團(tuán)結(jié)協(xié)作精神；(3)良好的實驗動手能力；(4)數(shù)據(jù)處理與文字表達(dá)能力。平時成績占70%,期末考試成績占30%。平時成績根據(jù)多元素給定，包括實驗素養(yǎng)、實驗預(yù)習(xí)、實驗前回答問題、原始記錄、實驗操作能力、設(shè)計性實驗的設(shè)計方案、實驗報告等；期末考試包括筆試、口試、實際操作，采取學(xué)生隨機(jī)抽取實驗內(nèi)容，當(dāng)堂完成實驗并寫出實驗報告，當(dāng)堂公布評分標(biāo)準(zhǔn)和實驗成績的方式。具體實施細(xì)則可參考《武漢大學(xué)藥學(xué)院實驗課考核規(guī)定》。6第二章藥物的鑒別試驗藥物的鑒別試驗是根據(jù)藥物的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)，采用化學(xué)、物理化學(xué)或生物學(xué)方法來判斷藥物的真?zhèn)?。它是藥品質(zhì)量檢驗工作的首要任務(wù)，只有在藥物鑒別無誤的前提下，藥物的雜質(zhì)檢查和含量測定才有意義。中國藥典和世界各國藥典所收載的各藥品項下的鑒別方法，均是用于證實貯藏在有標(biāo)簽容器中的藥物是否為標(biāo)簽所標(biāo)示的藥物，而不是對未知藥物進(jìn)行定性分析。類別藥物的共同化學(xué)結(jié)構(gòu)為依據(jù)。根據(jù)其相同的物理化學(xué)性質(zhì)來進(jìn)行藥物真?zhèn)蔚蔫b別，以區(qū)別不同類別的藥物。而專屬鑒別試驗，則是在一般鑒別試驗的基礎(chǔ)上，利用各種藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)差異，來鑒別藥物，以區(qū)別同類藥物或具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)部分的各個藥物單體，達(dá)到最終確認(rèn)藥物真?zhèn)蔚哪康?。藥物的鑒別方法可以分為化學(xué)法、光譜法、色譜法和生物學(xué)法。前兩者最為常用，化學(xué)法主要包括呈色反應(yīng)、沉淀生成反應(yīng)、熒光反應(yīng)、氣體生成反應(yīng)等鑒別方法，而光譜法常用的是紫外光譜鑒別法和紅外光譜鑒別法。常常采用化學(xué)法與光譜法相結(jié)合來同時鑒別藥物。每種藥品一般選用2~4種方法進(jìn)行鑒別，相互取長補(bǔ)短。實驗一典型藥物的鑒別試驗一、實驗?zāi)康?.了解藥物鑒別試驗的目的和特點。2.掌握藥物的常用化學(xué)鑒別方法及其影響因素。3.掌握紫外光譜鑒別法和紅外光譜鑒別法。4.判斷有標(biāo)簽容器中的苯巴比妥、對氨基水楊酸鈉、維生素B?片和注射用硫酸鏈霉素二、基本原理(一)苯巴比妥的化學(xué)鑒別1.銀鹽反應(yīng)：巴比妥類藥物在適當(dāng)?shù)膲A性溶液中，遇過量硝酸銀試液，即產(chǎn)生白色的7橙黃色，其反應(yīng)原理，可能是苯環(huán)上的亞硝基化反應(yīng)。(二)對氨基水楊酸鈉的化學(xué)鑒別對氨基水楊酸鈉水溶液加稀鹽酸酸化后，在中性或弱酸性(pH4～6)條件下能與三氯8(三)維生素B1的化學(xué)鑒別(四)硫酸鏈霉素的化學(xué)鑒別1.坂口反應(yīng)：系鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍的特征反應(yīng)。硫酸鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍；鏈霉胍、8-羥基喹啉分別與次溴酸鈉的反應(yīng)產(chǎn)物縮合生成橙紅色化合麥芽酚與三價鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。反應(yīng)式如下：9鏈霉素麥芽酚紫紅色配位化合物(五)影響化學(xué)鑒別的因素影響化學(xué)鑒別反應(yīng)的因素主要有溶液的濃度、試劑的用量、溶液的溫度、溶液的酸堿度、反應(yīng)時間等，溶液的濃度主要是指被鑒別藥物的濃度。溶液的濃度和各種試劑的用量一般是過量的。溶液的酸堿度應(yīng)使各反應(yīng)物有足夠的濃度處于反應(yīng)活化狀態(tài)，使反應(yīng)生成物處于穩(wěn)定和易于觀測的狀態(tài)。一般，溫度升高，化學(xué)反應(yīng)速度會增加，但也可使生成物分解，導(dǎo)致實驗現(xiàn)象變得不明顯，甚至觀察不到陽性結(jié)果。有機(jī)反應(yīng)的反應(yīng)速度一般較慢，因此為使鑒別反應(yīng)完成，需要一定時間。(六)紫外光譜鑒別法不同的有機(jī)藥物由于含有能吸收不同紫外光的基團(tuán)而顯示特征紫外吸收光譜，可作為鑒別的依據(jù)。UV鑒別法簡便，但UV光譜的波長范圍較窄、光譜簡單、平坦，曲線形狀變化不大，尤其是有機(jī)分子的吸收波長和強(qiáng)度主要取決于分子中的發(fā)色團(tuán)、助色團(tuán)及其共軛情況，與精細(xì)結(jié)構(gòu)無關(guān)。因此，結(jié)構(gòu)完全相同的化合物應(yīng)有完全相同的吸收光譜，而吸收光譜完全相同的化合物卻不一定是同一個化合物。UV鑒別法的專屬性遠(yuǎn)不如IR鑒別法，不能單獨使用，應(yīng)與其他方法配合，才能對藥物的真?zhèn)巫龀鲨b別。常用的UV鑒別方法有：2.規(guī)定一定濃度供試液在λmx處的吸收度3.規(guī)定吸收波長和吸收系數(shù)法4.規(guī)定吸收波長和吸收度比值法5.經(jīng)化學(xué)處理后，測定產(chǎn)物的UV特性(七)紅外光譜鑒別法不同的有機(jī)藥物由于含有能吸收不同紅外光的基團(tuán)而顯示特征紅外吸收光譜，可作為鑒別的依據(jù)。IR光譜特征性強(qiáng)，專屬性高，凡化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、組分單一的有機(jī)原料藥物都可用IR鑒別，尤其是適合于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、且結(jié)構(gòu)非常相似的藥物的區(qū)別。中國藥典和英國藥典采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照法，美國藥典采用對照品法。在實際操作中，可根據(jù)實際條件選用其中任(一)苯巴比妥的鑒別1.取供試品約50mg,加碳酸鈉試液0.5ml與水5ml,振搖2min,濾過(如不渾濁可不必濾過),濾液中逐滴加入硝酸銀試液，即發(fā)生白色沉淀，振搖，沉淀即溶解，繼續(xù)滴加過2.取供試品約50mg,加吡啶溶液(1→10)5ml,溶解后，加銅吡啶試液1ml,即顯紫3.取本品約10mg,加硫酸2滴與亞硝酸鈉約5mg,混合，即顯橙黃色，隨即轉(zhuǎn)橙紅4.取本品約50mg,置試管中，加甲醛試液1ml,加熱煮沸，冷卻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml,使成兩液層，置水浴中加熱，接界面顯玫瑰紅色。5.本品的紅外吸收光譜應(yīng)與對照圖譜一致。(二)對氨基水楊酸鈉的鑒別1.取本品約10mg,加水10ml溶解后，加稀鹽酸2滴使成酸性，加三氯化鐵試液1滴，2.本品250mg,加1mol/L氫氧化鈉溶液3ml溶解后，用水稀釋至500ml,混勻。精密吸取該液5ml置于內(nèi)含12.5ml磷酸鹽緩沖液(pH7)的250ml量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。以相同的緩沖液為空白溶液，測定UV,分別在265nm和299nm波長處有最大吸收，3.本品的紅外吸收光譜應(yīng)與對照圖譜一致。(三)維生素B1片的鑒別1.取相當(dāng)于5mg維生素B?的本品細(xì)粉適量，加水?dāng)嚢?，濾過，濾液蒸干后，加氫氧化鈉試液2.5ml溶解，再加鐵氰化鉀試液0.5ml與正丁醇5ml,強(qiáng)力振搖2min,放置使分層，2.取相當(dāng)于5mg維生素B?的本品細(xì)粉適量，加水?dāng)嚢?，濾過，濾液蒸干后，先加氨試液使成堿性，將析出的沉淀濾過除去。取濾液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸銀試液，即生成白色凝乳狀沉淀；分離，沉淀加氨試液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀復(fù)生成。(四)注射用硫酸鏈霉素的鑒別1.取本品約0.5mg,加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1m1,放冷至約15℃,加次溴酸鈉試液3滴，即呈橙紅色。2.取本品約20mg,加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml,置水浴上加熱5min,加硫酸鐵銨溶液(取硫酸鐵銨0.1g,加0.5mol/L硫酸溶液5m1使溶解)0.5ml,即呈紫紅色。3.本品的紅外吸收光譜應(yīng)與對照圖譜一致。4.本品的水溶液顯硫酸鹽的鑒別反應(yīng)。(1)取本品水溶液，滴加氯化鋇試液，即生成BaSO?白色沉淀；分離，沉淀在鹽酸或硝酸中均不溶解。(2)取供試品溶液，滴加醋酸鉛試液，即生成PbSO?白色沉淀；分離，沉淀在醋酸銨試液或氫氧化鈉試液中溶解。1.苯巴比妥的銅鹽反應(yīng)中，樣品量要足夠50mg。亞硝酸鈉-硫酸反應(yīng)中，應(yīng)采用干燥試管或白色點滴板。甲醛-硫酸反應(yīng)中，操作須細(xì)心，滴加硫酸時要慢，并且沿管壁加入，方能成兩液層；然后放入剛煮沸過的水浴中，靜置加熱，時間應(yīng)足夠(約1～2min),則可(1)由于常需采用規(guī)定波長、吸收度、吸收系數(shù)等的比對，故測定時應(yīng)注意儀器的波(2)對于吸收帶很窄的藥物，應(yīng)考慮儀器狹縫對測定結(jié)果的影響。(3)根據(jù)藥物的溶解性，選擇合適的溶劑，不溶于水的藥物常采用甲醇、乙醇或水-醇混合溶劑；當(dāng)采用有機(jī)溶劑時，要注意溶劑的吸收波長是否對該鑒別波長產(chǎn)生干擾。(4)為了增加藥物的溶解度或穩(wěn)定性，或需要其在一定pH條件下產(chǎn)生相應(yīng)的特征吸收，常常在溶劑中加入一定濃度的酸、堿或緩沖液。(1)樣品的純度應(yīng)大于98%,應(yīng)不含水分。(2)空白片光譜圖的基線應(yīng)大于75%透光率；除在3440cm-1及1630cm-1附近因殘留或附著水而呈現(xiàn)一定吸收峰外，其他區(qū)域不應(yīng)出現(xiàn)大于基線3%透光率的吸收譜帶。(3)有機(jī)堿鹽酸鹽采用溴化鉀壓片時，可能發(fā)生復(fù)分解反應(yīng)(B·HCl+KBr→B·HBr+KCl),此時可采用氯化鉀壓片，并比較氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法的光譜，若二者沒有區(qū)(4)供試品研磨應(yīng)適度，以粒度2～5μm為宜。過度研磨可能導(dǎo)致晶格結(jié)構(gòu)被破壞或晶型轉(zhuǎn)化。粒度不夠細(xì)則易引起光散射能量損失，整個光譜基線傾斜，甚至嚴(yán)重變形。(5)壓片法制成的片厚宜在0.5mm以下，否則可觀察到干涉條紋，干擾供試品光譜。(6)樣品掃描速度應(yīng)與波長校正的條件一致，因為快速掃描將使波長滯后。制成圖譜的最強(qiáng)吸收峰透光率應(yīng)在10%以下。(7)藥物制劑采用IR法鑒別時，應(yīng)對供試品進(jìn)行前處理，以除去輔料的干擾。五、思考題1.藥物鑒別試驗的目的和特點分別是什么?2.影響化學(xué)鑒別反應(yīng)的因素主要有哪些?3.紫外光譜鑒別法、紅外光譜鑒別法各有什么特點?第三章藥物的雜質(zhì)檢查藥物的檢查包括四大方面，分別是有效性、均一性、安全性和純度要求。藥物的純度是指藥物的純凈程度，藥物中的雜質(zhì)是影響藥物純度的主要因素。因此，藥物的純度檢查即是指藥物的雜質(zhì)檢查。根據(jù)藥物中雜質(zhì)存在的廣泛程度可分為一般雜質(zhì)檢查及特殊雜質(zhì)檢查。一般雜質(zhì)是在大多數(shù)藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中都容易引入的雜質(zhì)，如氯化物、硫酸鹽、鐵鹽、重金屬、砷鹽、熾灼殘渣、殘留溶劑等，而特殊雜質(zhì)是各個藥物中可能存在的原料、中間體、降解物、異構(gòu)體、副反應(yīng)產(chǎn)物等，是該藥在生產(chǎn)和貯藏過程中有可能引入的僅屬該藥特有的對于藥物中所存在的雜質(zhì)，在不影響療效、不產(chǎn)生毒性和保證藥物質(zhì)量的前提下，允許藥物中含有一定量的雜質(zhì)。雜質(zhì)的限量一般根據(jù)雜質(zhì)的安全性、生產(chǎn)的可行性、產(chǎn)品的穩(wěn)定性等綜合考慮而定。藥物中雜質(zhì)限量的控制方法一般分兩種：一種為限量檢查法(limittest),另一種是對雜質(zhì)進(jìn)行含量測定。限量檢查法通常不要求測定其準(zhǔn)確含量，只需檢查雜質(zhì)是否超過限量。進(jìn)行限量檢查時，多數(shù)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液對照法，此外，還可采用靈敏度法和比較法。標(biāo)準(zhǔn)溶液對照法系指取一定量的被檢雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定量供試品溶液，在相同的條件下試驗，比較結(jié)果，以確定雜質(zhì)含量是否超過限量。由于供試品(S)中所含雜質(zhì)的最大允許量可以通過雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(C)和體積(V)的乘積表達(dá)，所以，雜質(zhì)限量(L)的計算公式為：采用對照法須注意平行操作原則，即供試溶液和對照溶液應(yīng)在完全相同的條件下反應(yīng)，如加入的試劑、反應(yīng)的溫度、放置的時間等均應(yīng)相同，這樣檢查結(jié)果才有可比性。出現(xiàn)，從而判斷供試品中所含雜質(zhì)是否符合限量規(guī)定乳酸(lacticacid)中枸櫞酸、草酸、磷酸或酒石酸的檢查：取本品0.5g加水適量使成5ml,混勻，用氨試液調(diào)至微堿性，加氯化鈣試液1ml,至水浴中加熱5min,不得產(chǎn)生渾濁。比較法系指取供試品一定量依法檢查，測定特定待檢雜質(zhì)的特征參數(shù)(如：吸光度等)與規(guī)定的限量比較，不得更大。如利巴韋林(ribovirin)中吸光度的檢查：取本品1.0g,加水25ml溶解后，在430nm波長處測定吸光度，不得大于0.02。又如維生素B?中檢查感光黃素，利用維生素B?幾乎不溶于氯仿，而感光黃素溶于氯仿的性質(zhì)，用無醇氯仿提取供試品中的感光黃素，在440nm波長處測定氯仿液的吸光度，不得超過0.016。實驗二藥物的一般雜質(zhì)檢查--—-五種無機(jī)雜質(zhì)的檢查一、實驗?zāi)康?.掌握氯化物、硫酸鹽、鐵鹽、重金屬和砷鹽限量檢查的基本原理和方法。二、基本原理無機(jī)雜質(zhì)可能來源于生產(chǎn)過程，如生產(chǎn)過程中使用的儀器、原料、干器，反應(yīng)試劑、催化劑、助濾劑、活性炭等，它們一般是已知的和確定的。由存在狀況對評價藥品的生產(chǎn)工藝、保證藥品安全、穩(wěn)定具有重要意義。1.氯化物檢查渾濁，與一定量標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液(10μgCI/ml)與硝酸銀在同樣條件下生成的氯化銀渾濁程度相比較，判定供試品中氯化物是否符合限量規(guī)定。2.硫酸鹽檢查藥物中微量的硫酸鹽在稀鹽酸酸性溶液中與氯化鋇反應(yīng)，生成的硫酸鋇微粒顯白色渾濁，與一定量標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液(100μgSO?2/ml)在相同條件下產(chǎn)生的硫酸鋇渾濁程度比較，3.鐵鹽檢查中國藥典和美國藥典均采用硫氰酸鹽法。鐵鹽在鹽酸酸性溶液中與硫氰酸鹽作用生成紅色可溶性的硫氰酸鐵配離子，與一定量標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(硫酸鐵銨，F(xiàn)eNH?(SO?)z·12H?O)用Fe3++nSCN'→[Fe(SCN)nJ"-3(n=1～6)在酸性條件下反應(yīng)，可防止Fe3+的水解。加入氧化劑過硫酸銨既可氧化供試品中Fe2+成Fe3+,同時可防止由于光線使硫氰酸鐵還原或分解褪色。某些藥物(如葡萄糖、糊精、硫酸鎂等)在檢查過程中需加硝酸處理，硝酸也可將Fe2+氧化成Fe3+,因此這些藥物的鐵鹽檢查可在硝酸酸性溶液中進(jìn)行。因硝酸中可能含亞硝酸，HNO?+SCN-+H+→NO·SCN+H?O4.重金屬檢查重金屬系指在實驗條件下能與硫代乙酰胺或硫代鈉作用而顯色的金屬雜質(zhì)，如銀、鉛、易積蓄中毒，故作為重金屬的代表，以鉛的限量表示重金屬限度。中國藥典(2005)收載了四種重金屬檢查方法。其中，硫代乙酰胺法的原理如下：硫代乙酰胺在弱酸性條件下(pH3.0～3.5)水解，產(chǎn)生硫化氫，與重金屬離子生成黃色CH?CSNH?+H?O→CH?CONH?+H?SPb2?+H?S→PbS↓中國藥典(2005)收載的古蔡氏(Gutzeit)法檢查砷鹽的原理是：金屬鋅與酸作用產(chǎn)生新生態(tài)的氫，與藥物中微量砷鹽反應(yīng)生成具揮發(fā)性的AsO3-+3Zn+9H+→3Zn2++3H?O+AsH?個AsH?+3HgBr?→3HBr+As(HgBr)?(黃色)在反應(yīng)液中加入碘化鉀及氯化亞錫將五價砷化亞錫還原為碘離子，后者與反應(yīng)中產(chǎn)生的鋅I?+Sn2+→2I-+Sn?+4I+Zn2+→[Znl?]2-氯化亞錫與碘化鉀還可抑制銻化氫的生成，因銻化氫也能與溴化汞試紙作用生成銻斑。錫齊，起去極化作用，從而使氫氣均勻而連續(xù)地發(fā)生。成硫化汞的色斑，干擾試驗結(jié)果，故用醋酸鉛棉花吸收硫化氫。用醋酸鉛棉花60mg,裝管高度約60mm～80mm,以控制醋酸鉛棉花填充的松緊度，使既能免除硫化氫的干擾(100μgs2存在也不干擾測定),又可使砷化氫以適宜的速度通過。取本品0.30g,加水溶解使成12.5ml(溶液如顯堿性，可滴加硝酸使成中性),再加稀硝酸5ml;溶液如不澄清，應(yīng)濾過；置25ml納氏比色管中，加水使成約20ml,搖勻，即得供試溶液。另取標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉溶液(10μgCI/ml)3.0ml,置25ml納氏比色管中，加稀硝酸5ml,加水使成約20ml,搖勻，即得對照溶液。于供試溶液與對照溶液中，分別加入硝酸銀試液0.5ml,用水稀釋使成25ml,搖勻，在暗處放置5分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察、比較、供試溶液不得比對照溶液更濃(0.010%)。取本品1.0g,加水溶解使成約20ml(溶液如顯堿性，可滴加鹽酸使成為中性);溶液如不澄清，應(yīng)濾過；置25ml納氏比色管中，加稀鹽酸1ml,搖勻，即得供試溶液。另取標(biāo)準(zhǔn)硫酸鉀溶液(100μgSO?2/ml)1.0ml,置25ml納氏比色管中，加水使成約20ml,加稀鹽酸1ml,搖勻，即得對照溶液，于供試溶液與對照溶液中，分別加入25%氯化鋇溶液2.5ml,用水稀釋使成25ml,充分搖勻，放置10分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察、比較、供試溶液不得比對照溶液更濃(0.010%)。取本品1.0g,加水10ml溶解后，加稀硝酸2滴，緩緩煮沸5分鐘，放冷，加水稀釋使成23ml,加硫氰酸銨溶液(30→100)2ml,搖勻，如顯色、與標(biāo)準(zhǔn)鐵溶液(10μgFe3*/ml)1.0ml經(jīng)相同方法制成的對照溶液比較，不得更深(0.001%)。4.重金屬取25ml納氏比色管兩支，甲管中加一定量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液(10μgPb2+/ml)與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)1ml后，加水稀釋成12.5ml。取本品2.0g,置于乙管中，加水11.5ml溶解后，加醋酸鹽緩沖液(Ph3.5)1ml;若供試液帶顏色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它各1ml,搖勻，放置2分鐘，同置白紙上，自上向下透視，乙管中顯出的顏色與甲管比較，不得更深(含重金屬不得過百萬分之五)。取本品2.0g置試砷瓶中，加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml與溴化鉀溴試液0.5ml,置水浴上加熱約20分鐘，使保持稍過量的溴存在，必要時，再補(bǔ)加溴化鉀溴試液適量，并隨時(可改為加稀鹽酸(1:1)10ml)與水適量使成28ml,加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴。在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g(鋅粒和鋅粉各1g),迅速用試砷管塞緊瓶塞(試砷管上已置裝有醋酸鉛棉花及溴化汞試紙),并在25～40℃的水浴中反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，將生成的砷斑與一定量標(biāo)準(zhǔn)砷溶液制成的標(biāo)準(zhǔn)砷斑進(jìn)行比較，顏色不得更深，應(yīng)符合規(guī)定(0.0001%)。標(biāo)準(zhǔn)砷斑的制備：精密量取標(biāo)準(zhǔn)砷溶液(1μg/ml)2ml,置試砷瓶中，加濃鹽酸5ml與蒸餾水21ml(可改為：加稀鹽酸(1:1)10ml和蒸餾水16ml),再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g(鋅粒和鋅粉各1g),迅速用試砷管塞緊瓶塞(試砷管上已置裝有醋酸鉛棉花及溴化汞試紙),并在25～40℃的水浴中反應(yīng)45分鐘，取出溴化汞試紙，觀察標(biāo)準(zhǔn)砷斑。1.納氏比色管的選擇與洗滌：比色或比濁操作，一般均在納氏比色管中進(jìn)行，因此在選用比色管時，必須注意使樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管的體積相等，玻璃色質(zhì)一致，最好不帶任何顏色，管上的刻度均勻，如有差別，不得相差2mm。比色管洗滌時避免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁劃出條痕影響比色或比濁。2.平行原則：比色、比濁、砷鹽檢查時，樣品液與標(biāo)準(zhǔn)液的實驗條件應(yīng)盡可能一致，3.嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行實驗，注意各種試劑的加入次序。如氯化物檢查時，加適量蒸餾水使成約20ml后，再加AgNO?試液。4.比色、比濁前應(yīng)使比色管內(nèi)試劑充分混勻，主要利用手腕轉(zhuǎn)動360的旋搖操作來完成；比色方法是將兩管同置于白色背景上，從側(cè)面觀察；比濁方法是將兩管同置于黑色或白色背景上，自上而下觀察。5.重金屬檢查中，應(yīng)注意：(1)根據(jù)雜質(zhì)限量計算公式，計算出標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液的取用量。(2)樣品管中“加水11.5ml溶解后，加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)1ml”,實驗時應(yīng)采用“加水適量溶解后，加醋酸鹽緩沖液”(pH3.5)1ml,再加水使成12.5ml,更便于操作。加醋酸鹽緩沖液前，注意比較樣品管與標(biāo)準(zhǔn)管的溶液顏色，若樣品管帶色，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)管中滴加少量稀焦糖溶液，使兩管的顏色一致，然后依法操作。如在標(biāo)準(zhǔn)管(甲管)中滴加稀焦糖溶液仍不能使顏色一致時，可取該藥品項下規(guī)定的二倍量的供試品和試液，加水使成15ml,將溶液分成甲乙二等分，乙管中加水稀釋成12.5ml;甲管中加入硫代乙酰胺試液1ml,搖勻，放置2分鐘，經(jīng)濾膜(孔徑3μm)濾過，然后甲管中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液，加水使成12.5ml,再分別在乙管加硫代乙酰胺試液1ml,甲管中加水1ml,依法比較，即得。(3)標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液應(yīng)在臨用前精密量取標(biāo)準(zhǔn)鉛貯備液新鮮配制，以防止鉛的水解而造成6.砷鹽檢查中，應(yīng)注意：(1)所用的標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管應(yīng)力求一致，試砷管的長短、內(nèi)徑一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影響比色。(2)預(yù)先安裝好試砷管。醋酸鉛棉花用于吸收硫化氫(鋅粒及供試品中可能含有少量硫化物，在酸性溶液中即產(chǎn)生硫化氫),從而免除了與溴化汞作用生成硫化汞色斑的干擾。(3)鋅粒的大小以通過20目篩為宜，過細(xì)則作用太快，過粗則作用太慢，為此可采用鋅粒與鋅粉各一半加入的方式。(4)加鋅粒后，應(yīng)立即將試砷管蓋上，塞緊，以免AsH?氣體逸出。1.比色、比濁操作應(yīng)遵循的原則是什么?2.試計算葡萄糖重金屬檢查中標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液的取用量。3.古蔡氏試砷法中所加各試劑的作用是什么?4.根據(jù)樣品取用量、雜質(zhì)限量及標(biāo)準(zhǔn)砷溶液的濃度，計算標(biāo)準(zhǔn)砷溶液的取用量。實驗三藥物的一般雜質(zhì)檢查--—-殘留溶劑的檢查1.掌握藥品中殘留有機(jī)溶劑的分類和檢查方法。2.熟悉殘留有機(jī)溶劑檢查的一般操作要求。二、基本原理(一)殘留溶劑及其分類藥品中的殘留溶劑是指在原料藥或輔料的生產(chǎn)中，以及在制劑的制備過程中使用，但在工藝過程中未能完全除去的有機(jī)溶劑，屬于一般雜質(zhì)。中國藥典(2005)按有機(jī)溶劑毒性的程度將殘留溶劑分為三類：一類有機(jī)溶劑毒性較大，且具有致癌并對環(huán)境有害，應(yīng)盡量避免使用；二類有機(jī)溶劑對人有一定毒性，應(yīng)限量使用；三類有機(jī)溶劑對人的健康危險性較小，因此推薦使用。除另有規(guī)定外，第一、二、三類溶劑的殘留量應(yīng)符合中國藥典的規(guī)定；對其它溶劑，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝的特點，制定相應(yīng)的限度，使其符合產(chǎn)品規(guī)范、GMP或其它基(二)殘留溶劑的檢查方法ChP(2005年版)規(guī)定殘留溶劑的檢查方法為GC法。既可采用填充柱，也可采用毛細(xì)管柱，檢測器通常使用火焰離子化檢測器(FID),對含鹵素元素的殘留溶劑如氯仿等，采用電子捕獲檢測器(ECD),可得到高的靈敏度。采用FID時需加尾吹氣，因為毛細(xì)管柱的柱內(nèi)載氣流量太低(常規(guī)柱為1～5ml/min),不能滿足檢測器的最佳操作條件，所以使用毛細(xì)管柱時要采用輔助氣(尾吹氣),在色譜柱后增加一路載氣直接進(jìn)入檢測器(圖3-1),就可保證檢測器在高靈敏度狀態(tài)下工作，尾吹氣的另一個重要作用是消除檢外效應(yīng)。一般情況下，氮氣(尾吹氣+載氣)、氫氣和空氣三者的比例接近或等于1:1:10(1)用待測物的色譜峰計算，填充柱法的理論板數(shù)一般應(yīng)大于1000/柱；毛細(xì)管色譜柱(2)色譜圖中，待測物色譜峰與其相鄰的色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5;(3)以內(nèi)標(biāo)法測定時，對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，所得待測物與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比的RSD應(yīng)不大于5%;若以外標(biāo)法測定，所得待測物峰面積的RSD應(yīng)不大于10%。(1)頂空進(jìn)樣：精密稱取供試品0.1-1g。通常以水為溶劑；對于非水溶性藥物，可采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基甲砜(DMSO)或其他適宜溶劑；根據(jù)供試品和待限度規(guī)定，配制供試品溶液，使其濃度滿足系統(tǒng)定量測定的需要。(2)溶液直接進(jìn)樣：精密稱取供試品適量，用水或合適的有機(jī)溶劑使溶解；根據(jù)品種正文中殘留溶劑的限度規(guī)定，配制供試品溶液，使其濃度滿足系統(tǒng)定量測定的需要。3.對照品溶液的制備精密稱取各品種項下規(guī)定檢查的有機(jī)溶劑適量，采用與制備供試品溶液相同的方法和溶劑制備對照品溶液。若為限度測定時，根據(jù)殘留溶劑的限度規(guī)定來確定對照品溶液的濃度；若為定量測定，應(yīng)根據(jù)供試品中殘留溶劑的實際殘留量確定對照品溶液的濃度溶液的色譜峰面積與供試品溶液中對應(yīng)的殘留溶劑的色譜峰面積以不超過2倍為宜。必要時頂空進(jìn)樣法測定的殘留溶劑有甲酰胺、2一甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基咯烷酮(在酸性環(huán)境中)。(1)第一法毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣等溫法本法適用于被檢查的有機(jī)溶劑數(shù)量不多，并頂空瓶平衡溫度為70～85℃,頂空瓶平衡時間30～60min;進(jìn)樣口溫度為200℃;如采用FID測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣不少于2次，測定待測峰的峰面積。(2)第二法毛細(xì)管柱頂空進(jìn)樣程序升溫法本法適用于所需要檢查的有機(jī)溶劑數(shù)量色譜條件：如為非極性色譜系統(tǒng)，柱溫先在30℃維持7min,再以8℃/min的速度升至120℃,維持15min;如為極性色譜系統(tǒng)，柱溫先在60℃維持6min,再以8℃/min的速度升溫速率升至100℃,維持20min;以氮氣為載氣，流速為2.0ml/min;以水為溶劑時，頂空瓶平衡溫度70～85℃,頂空瓶平衡時間30～60min;進(jìn)樣口溫度為200℃;如采用FID檢測器，溫具體到單個藥品的殘留溶劑檢查時，可根據(jù)該品種項下的殘留溶劑種類調(diào)整程序升溫程測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣不少于2次，測定待測峰的峰面積。(3)第三法溶液直接進(jìn)樣法可采用填充柱，亦可采用適宜極性的毛細(xì)管柱。測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣2-3次，每次2μl,測定待測峰的峰面限度檢查：以內(nèi)標(biāo)法測定時，供試品溶液所得被測溶劑峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的平均值不得大于對照品溶液的相應(yīng)峰面積的平均值。定量測定：按內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法計算各殘留溶劑的量。除按正丙醇計算的理論板數(shù)應(yīng)大于700外，其他系統(tǒng)適用性試驗應(yīng)滿足規(guī)定要求。取本品約0.16g,精密稱定，置10ml量瓶中，精密加0.1%(ml/ml)正丙醇(內(nèi)標(biāo)物質(zhì))溶液2ml,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密量取甲醇10μl(相當(dāng)于7.9mg)與丙酮100μl(相當(dāng)于79mg),置10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml,置10ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2ml,加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液，照第三法，用直徑為0.25mm～0.18mm的二乙烯苯一乙基乙烯苯型高分子多孔小球色譜柱(填充柱)在柱溫150℃測定。含丙酮不得過0.5%(g/g),甲醇不得過0.3%(g/g)。供試品中的未知雜質(zhì)或其揮發(fā)性熱降解物易對殘留溶劑的測定產(chǎn)生干擾。干擾作用包括在測定的色譜系統(tǒng)中未知雜質(zhì)或其揮發(fā)性熱降解物與待測物的保留值相同(共出峰);或熱降解產(chǎn)物與待測物的結(jié)構(gòu)相同(如甲氧基熱裂解產(chǎn)生甲醇)。當(dāng)測定的有機(jī)溶劑殘留量超出限度，但未能確定供試品中是否有未知雜質(zhì)或其揮發(fā)性熱降解物對測定有干擾作用時，應(yīng)通過試驗排除干擾作用的存在。對第一類干擾作用，通常采用在另一種極性相反的色譜系統(tǒng)中對相同樣品再進(jìn)行測定，比較不同色譜系統(tǒng)中測定結(jié)果的方法。如二者結(jié)果一致，則可以排除測定中有共出峰的干擾；如二者結(jié)果不一致，則表明測定中有共出峰的干擾。對第二類干擾作用，通常要通過測定已知不含該溶劑的對照樣品來加以判斷。若殘留溶劑為含氮堿性化合物，由于普通氣相色譜儀的不銹鋼管路、進(jìn)樣器的襯管等對含氮堿性化合物具有較強(qiáng)的吸附作用，致使其檢出靈敏度降低。因此，當(dāng)采用頂空進(jìn)樣法測定此類化合物時，應(yīng)采用惰性的硅鋼材料或鎳鋼材料管路；或采用溶液直接進(jìn)樣法測定；供試品溶液應(yīng)不呈酸性，以免含氮堿性化合物與酸反應(yīng)后不易氣化。通常采用弱極性的色譜柱或經(jīng)堿處理過的色譜柱分析含氮堿性化合物，如果采用胺分析專用柱進(jìn)行分析，效果更好。對不宜采用氣相色譜法測定的含氮堿性化合物，可采用其它方法如離子色譜法等測定。五、思考題1.中國藥典規(guī)定檢查殘留溶劑時色譜系統(tǒng)適用性試驗應(yīng)符合哪些要求?2.檢查殘留溶劑時可采用哪幾種進(jìn)樣方法?測定時應(yīng)注意哪些問題?實驗四藥物的特殊雜質(zhì)檢查---色譜分析法檢查藥物中的有關(guān)物質(zhì)一、實驗?zāi)康?.掌握薄層色譜法(TLC)檢查藥物中特殊雜質(zhì)的常用方法和基本操作。2.掌握高效液相色譜法(HPLC)檢查藥物中特殊雜質(zhì)的常用方法及基本操作。二、基本原理(一)薄層色譜雜質(zhì)檢查法TLC法常用于藥物中雜質(zhì)的檢查，具有設(shè)備簡單、操作方便、分離速度快，靈敏度和分辨率較高等優(yōu)點，并且可以同時采用多種檢視斑點的方法來獲得更多的雜質(zhì)信息。常用的1.供試品溶液自身稀釋對照法適用于雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)不能確定，或無雜質(zhì)對照品的情況。僅限于雜質(zhì)斑點的顏色與主成分斑點顏色相同或相近的情況下使用。方法為配制一定濃度的供試品溶液，然后將供試品溶液按限量要求稀釋至一定濃度作為對照溶液，將供試品溶液和對照溶液分別點樣于同一薄層板上，展開、斑點定位。結(jié)果判斷：供試品溶液所顯雜質(zhì)斑點與自身稀釋對照溶液或系列自身稀釋對照溶液所顯主斑點比較，不得更深。2.雜質(zhì)對照品法適用于已知雜質(zhì)并能獲得雜質(zhì)對照品的情況。根據(jù)雜質(zhì)限量，取供試品溶液和一定濃度的雜質(zhì)對照品溶液，分別點樣于同一薄層板上，展開、斑點定位，將供試品溶液中相應(yīng)于雜質(zhì)對照品的斑點與雜質(zhì)對照品溶液或系列濃度的雜質(zhì)對照品溶液的主斑點進(jìn)行比較，判斷藥物中雜質(zhì)限量是否合格。3.雜質(zhì)對照品法與供試品溶液自身稀釋對照法并用當(dāng)藥物中存在多個雜質(zhì)時，其中已知雜質(zhì)有對照品時，采用雜質(zhì)對照品法檢查；共存的未知雜質(zhì)或沒有對照品的雜質(zhì)，可采用供試品溶液自身稀釋對照法檢查。4.母體藥物對照法當(dāng)無合適的雜質(zhì)對照品，或者是供試品顯示的雜質(zhì)斑點顏色與主成分斑點顏色有差異，難以判斷限量時，可用母體藥物作為對照品，此母體藥物中所含待檢雜質(zhì)需符合限量要求，且穩(wěn)定性好。(二)高效液相色譜雜質(zhì)檢查法高效液相色譜法(HPLC)因其分離選擇性好、專屬性強(qiáng)和靈敏度高，可以準(zhǔn)確地測定各組分的峰面積，在雜質(zhì)檢查中的應(yīng)用日益增多。對于使用HPLC法測定含量的藥物，可采用同一色譜條件進(jìn)行雜質(zhì)檢查。采用HPLC法檢查雜質(zhì)，中國藥典規(guī)定應(yīng)按各品種項下要求，進(jìn)行色譜系統(tǒng)適用性試驗。HPLC檢查雜質(zhì)有五種方法：1.不加校正因子的主成分自身對照法適用于缺少雜質(zhì)對照品的情況。該法以供試品規(guī)定外，供試品溶液的分析時間應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍。供試品溶液中各雜質(zhì)的峰面積與對照溶液主成分的峰面積比較，來控制雜質(zhì)的限量。下，如雜質(zhì)與主成分的分子結(jié)構(gòu)相似，其響2.加校正因子的主成分自身對照法適用于測定時不用雜質(zhì)對照品的情況。但在建立方法時，需要利用雜質(zhì)對照品和藥物對照品，按內(nèi)標(biāo)法求出雜質(zhì)相對于藥物的校正因子。Cg為雜質(zhì)對照品的濃度。此校正因子可直接載入各品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，在常規(guī)檢驗時用以校節(jié)檢測靈敏度，使對照溶液中主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～25%。然后，分別進(jìn)樣供試品溶液和對照品溶液，除另有規(guī)定外，供試品溶液的留時間的2倍。供試品溶液中各雜質(zhì)的峰面積分別乘以相應(yīng)的校正因子后，與對照品溶液中用相對保留時間，所以在建立方法時需記載雜質(zhì)相對于藥物的相對保留時間。3.內(nèi)標(biāo)校正因子法適用于有雜質(zhì)對照品，能夠測定雜質(zhì)校正因子的情況。先以雜質(zhì)為供試品溶液中雜質(zhì)的濃度。4.外標(biāo)法適用于有雜質(zhì)對照品，而且進(jìn)樣量能夠精確控制(以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣)的情況。雜質(zhì)含量計算如下：濃度；Cx為供試品溶液中雜質(zhì)的濃度。5.峰面積歸一化法適用于粗略測定供試品中雜質(zhì)的含量。取供試品溶液進(jìn)樣分析，計算各雜質(zhì)峰面積總和雜總峰面積的百分率，應(yīng)不得超過限量。該法簡便快捷，但在雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與主成分結(jié)構(gòu)相差較大時可能會有較大的定量誤差，因此中國藥典(2005)特別強(qiáng)調(diào)“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定(三)有關(guān)物質(zhì)特殊雜質(zhì)是指在特定藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中引入的雜質(zhì)，這類雜質(zhì)隨藥物的不同而改變。有關(guān)物質(zhì)通常是在某藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中，有可能引入的特殊雜質(zhì)，包括起始物、中間體、異構(gòu)體、聚合體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等，而這些特殊雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)往往與主藥相似，但結(jié)構(gòu)不甚明確或雖結(jié)構(gòu)明確，卻難以獲得對照品。色譜分析法是檢查有關(guān)物質(zhì)的首選方法，其中TLC法和HPLC法應(yīng)用最廣。采用TLC法時，多以供試品溶液自身稀釋對照法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的限量檢查；而采用HPLC法時，常以不加校正因子的主成分自身對照法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的限量檢查。三、實驗方法(一)TLC法檢查醋酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)取本品，加氯仿-甲醇(9:1)制成每1ml中含3.0mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加氯仿-甲醇(9:1)稀釋成每1ml中含60μg的溶液，作為對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版二部附錄VB)試驗，吸取上述兩種溶液各10μl,分別點于同一硅膠G薄層板上，以1,2-二氯乙烷-甲醇-水(95:5:0.3)為展開劑，展開后，晾干，在105℃干燥10min,放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點其顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深。(二)HPLC法檢查醋酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(38:62)為流動相，檢測波長為254nm。取醋酸氫化可的松與醋酸可的松對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并制成每1ml中含3.5μg的混合溶液，進(jìn)行測試。理論板數(shù)按醋酸氫化可的松峰計算一般為6000,醋酸氫化可的松峰與醋酸可的松峰的分離度應(yīng)大于5.5。取本品約17mg,精密稱定，置50ml量瓶中，加乙腈20ml,超聲處理使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取1ml,置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使醋酸氫化可的松色譜峰的峰高約為滿量程的40%。再精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，最大單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積，其他單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2倍，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2倍。四、實驗指導(dǎo)(一)TLC法檢查醋酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)1.限量檢查方法甾體激素藥物多由其它甾體化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)改造而來，其中的有關(guān)物質(zhì)主要包括起始物、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等。這些雜質(zhì)一般具有甾體的母核，與藥物的結(jié)構(gòu)相似，但多數(shù)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)是未知的。因此，TLC法是檢查甾體激素藥物中有關(guān)物質(zhì)的常用方法之一，并且各國藥典多采用供試品溶液自身稀釋對照法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的限量控制。2.顯色原理醋酸氫化可的松的化學(xué)結(jié)構(gòu)中，C17位的α--醇酮基(-CO-CH2OH)具有還原性，在強(qiáng)堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲膦(formazan),生成的顏色隨所用試劑和條件的不同而不同，多為紅色或藍(lán)色。本實驗以堿性四氮唑藍(lán)(BT)試液顯色。若BT試液過量，只能還原為紅色單甲膜；若BT試劑不過量，則醋酸氫化可的松可將BT還原為雙甲膜，得藍(lán)色斑點。3.薄層板的制備取層析用硅膠G2～2.5g,按1:3(W:V)比例加0.5%羧甲基纖維素鈉上清液，研磨均勻，鋪于一塊8cm×20cm玻璃板上，于室溫下，置水平臺上晾干，在110℃烘半小時，即置于有干燥劑的干燥箱中備用(可供1～2日內(nèi)使用，層析效果均良好)。一定量的吸附劑糊，這樣可得厚度一致的薄層(1)吸附劑糊可在燒杯中用玻棒充分?jǐn)嚭途鶆?，也可置于研缽中研勻制得。均勻而粘稠度適宜的吸附劑糊有利于薄層的光滑均勻。(2)0.5%羧甲基纖維素鈉應(yīng)取上清液，以保證制成的板光滑均勻。(3)薄層板所用的玻璃必須仔細(xì)清洗，不得附著油污，否則易引起薄層的剝落。(1)點樣溶液濃度不準(zhǔn)，則檢查結(jié)果不可靠。若供試品溶液及對照溶液的瓶塞不嚴(yán)密或多次取用后溶劑揮發(fā)，致使?jié)舛雀淖?，則應(yīng)重新配制點樣液。(2)在距薄層板底邊2.0~2.5cm處劃點樣基線，在基線上分別點出供試品溶液及對照溶液原點位置。兩點間一般距離1.5~2.0cm,距邊緣一側(cè)1.5~2.5cm。(3)可用10μl微量注射器或色譜用10μl微量吸管手動或采用自動點樣儀少量多次點將溶劑揮干后再滴上第二滴，以免原點過于擴(kuò)散。(4)點樣完畢，風(fēng)干放冷。(5)每天實驗結(jié)束后，點樣用微量注射器或微量吸管需用溶劑洗干凈。底邊1.0cm左右(切勿將樣點浸入展開劑中),加蓋，密封，等展開至規(guī)定距離(一般為為節(jié)約展開劑的用量，可用50～60ml展開劑，展開缸下面墊以楔形木板使缸底傾斜，仍能達(dá)到浸入1cm高度的要求。展開過程中，層析缸應(yīng)密封良好，否則展開劑不斷揮發(fā)，使R;值增大，甚至使斑點到6.顯色(1)堿性四氮唑藍(lán)試液應(yīng)在噴霧前臨時配制(取0.2%四氮唑藍(lán)的甲醇溶液10ml與12%氫氧化鈉的甲醇溶液30ml,臨用時混合，即得),以免影響顯色靈敏度。新鮮配制者應(yīng)呈(2)噴顯色劑時，宜在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，以避免試劑對人體的刺激。(3)顯色后，立即檢視斑點，并用針頭或鉛筆定位，以便記錄薄層圖譜。(二)HPLC法檢查醋酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)1.醋酸氫化可的松中可能含有少量醋酸可的松，二者結(jié)構(gòu)非常相似，如果能夠?qū)⒍吖氏到y(tǒng)適用性試驗中考察了醋酸氫化可的松和醋酸可的松之間的分離度。2.檢測器的選擇：醋酸氫化可的松峰及其結(jié)構(gòu)類似的有關(guān)物質(zhì)在紫外光區(qū)均有吸收，故選用UV檢測器。3.檢測波長的選擇：應(yīng)選用對各雜質(zhì)均有較強(qiáng)吸收的波長作為檢測波長，當(dāng)一個測定五、思考題1.TLC法檢查藥物中特殊雜質(zhì)的三種方法(雜質(zhì)對照品法、供試品溶液自身稀釋對照法、母體藥物對照法)各有何特點?2.按TLC法，醋酸氫化可的松中有關(guān)物質(zhì)的限量為多少?3.甾體激素結(jié)構(gòu)中的何種基團(tuán)可與四氮唑藍(lán)產(chǎn)生反應(yīng)?4.HPLC法檢查藥物中特殊雜質(zhì)有哪幾種方法?各有何特點?5.按HPLC法，醋酸氫化可的松中最大單個雜質(zhì)、其他單個雜質(zhì)及總雜質(zhì)的限量分別藥物制劑除需檢查雜質(zhì)外，還需進(jìn)行劑型方面的常規(guī)檢查，以確保藥物制劑的安全性、實驗五藥物制劑的含量均勻度和溶出度檢查一、實驗?zāi)康?.掌握含量均勻度、溶出度檢查的目的和判斷標(biāo)準(zhǔn)。2.熟悉含量均勻度、溶出度檢查的一般操作要求。(一)含量均勻度檢查含量均勻度(contentuniformity)系指小劑量或單劑量的固體制劑、半固體制劑和非均相液體制劑的每片(個)含量符合標(biāo)示量的程度。在制劑的實際生產(chǎn)中，由于采用混合法不可能制造出含量完全相同的單個制劑，特別是當(dāng)制程度更難以控制，此時僅靠重(裝)量差異的檢查并不能完全反映藥物含量的均勻程度。為含量均勻度檢查結(jié)果的判定方法分為計數(shù)型和計量型。計數(shù)型是基于規(guī)定數(shù)量各樣本的含量測定值與參考值(標(biāo)示量或平均含量)的一定限度比較，根據(jù)超出限度的樣本個數(shù)進(jìn)行判定；計量型是根據(jù)各樣本含量測定值的均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)進(jìn)行判定。在判定的可ChP(2005)采用計量型判定法。取供試品10片(個),照各品種項下規(guī)定的方法，分別測定每片(個)以標(biāo)示量為100的相對含量X,求其均值X和標(biāo)準(zhǔn)差S以及標(biāo)示量與均值之差的絕對值A(chǔ)(A=|100—X|):如A+1.80S≤15.0,則供試品的含量均勻度符合規(guī)定；若A+S>15.0,則不符合規(guī)定；若A+1.80S>15.0,且A+S≤15.0,則應(yīng)另取20片(個)復(fù)試。根據(jù)初、復(fù)試結(jié)果，計算30片(個)的均值X、標(biāo)準(zhǔn)差S和標(biāo)示量與均值之差的絕對值A(chǔ):如A+1.45S≤15.0,則供試品的含量均勻度符合規(guī)定；若A+1.45S>15.0,則不符合規(guī)定。如該品種項下規(guī)定含量均勻度的限度為±20%或其它數(shù)值時，應(yīng)將上述各判斷式中的15.0改為20.0或其它相應(yīng)的數(shù)值，但各判斷式中的系數(shù)不變。ChP(2005)對含量均勻度應(yīng)用的指導(dǎo)原則是：①片劑、膠囊劑或注射用無菌粉末每片 (個)標(biāo)示量不大于10mg或主藥含量小于每片(個)重量5%者，其它制劑每個標(biāo)示量小于2mg或主藥含量小于每個重量2%者，以及透皮貼劑，均應(yīng)檢查。②對于治療量與中毒量比較接近的品種或混勻工藝較困難的品種，每片(個)標(biāo)示量不大于25mg者，應(yīng)檢查。③急救藥品、毒劇藥品應(yīng)檢查。④復(fù)方制劑僅檢查符合上述條件的組分。⑤主要適用于口服固體藥物制劑。⑥凡檢查含量均勻度的制劑，一般不再檢查重(裝)量差異。(二)溶出度檢查1.溶出度和釋放度溶出度(dissolution)系指藥物從片劑、膠囊劑或顆粒劑等固體制劑在規(guī)定條件下溶出的速率和程度。釋放度(drugrelease)系指藥物從緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等在規(guī)定條件下釋放的速率和程度。兩者本質(zhì)上是相同的，均表達(dá)藥物從固體制劑進(jìn)入介質(zhì)中的速率和程度。測定固體藥物制劑溶出度或釋放度的過程稱溶出度試驗(dissolutiontest),它是一種模擬口服固體制劑在胃腸道中崩解和溶出的體外試驗方法。目前，溶出度試驗已成為評價口服固體制劑處方和生產(chǎn)工藝的極其重要的體外方法，溶出度數(shù)據(jù)不僅是口服固體制劑質(zhì)量控制的重要衡量指標(biāo)，而且可以在一定程度上反映口服固體制劑的體內(nèi)生物利用度。2.藥物溶出理論固體制劑中的藥物在溶出介質(zhì)中的溶出速率可用Noyes-Whiteney方dW/dt=KS(Csar—Csol)3.影響固體制劑中藥物溶出的因素主要有固體藥物表面積、藥物的理化性質(zhì)、制劑處方和工藝等。一般顆粒越細(xì)，與溶出介質(zhì)接觸的固體藥物表面積則越大，固體制劑的藥物溶出就越快；但對崩解型制劑而言，并非所有品種崩解的顆粒越細(xì)，溶出越快。藥物的一些理化性質(zhì)如溶解度、水合狀態(tài)、晶型等，會對藥物的溶出速率產(chǎn)生較大影響：藥物在溶出介質(zhì)中的溶解度越大，則藥物的飽和溶液濃度越大，藥物溶出加快；藥物分子的水合狀態(tài)會影響藥物的某些理化性質(zhì)，其中受影響較明顯的是藥物在水中的溶解度，一般無水藥物比水合藥物有更大的溶解度；有些藥物存在多種晶型，而不同的晶型往往有不同的溶解度，故而導(dǎo)致不同的溶出速率。制劑處方中所用輔料的種類、性質(zhì)和用量都會影響藥物的溶出。如處方中加入太多的潤滑劑(硬脂酸鎂等)會使藥物的溶出減慢；羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等包衣材料一般不影響藥物的溶出，但蟲膠則是藥物水溶性的阻滯材料；加入一高藥物的溶出度；崩解劑、粘合劑的種類和用量選用不當(dāng)，也會產(chǎn)生溶出度問題。制備如壓片時所用的壓力、制粒方法、相關(guān)制劑技術(shù)等都會影響藥物的溶出度。4.溶出度測定中國藥典(2005)采用轉(zhuǎn)籃法、槳法和小杯法測定溶出度。一般情況下，轉(zhuǎn)籃法適用于膠囊劑和易于漂浮的藥物劑型；槳法適用于片粒沉積在溶出杯底部，而使藥物的溶出可能變慢，此時轉(zhuǎn)籃法可能轉(zhuǎn)籃法調(diào)試溶出儀，使轉(zhuǎn)籃底部距溶出杯的內(nèi)底部25mm±2mm。分別量取經(jīng)脫氣處理的溶出介質(zhì)900ml,置1000ml的各溶出杯內(nèi)，加溫，待溶出介質(zhì)溫度恒定在37℃±0.5℃后，取供試品6片(粒、袋),分別投入6個干燥的轉(zhuǎn)籃內(nèi)，按各品種項下的規(guī)定調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，間，在規(guī)定的取樣位置吸取溶出液適量，立即用適當(dāng)?shù)奈⒖诪V膜(濾孔應(yīng)不大于0.8μm)濾過，自取樣至濾過應(yīng)在30s內(nèi)完成，并及時補(bǔ)充所耗的介質(zhì)。取澄清濾液，照該品種項下規(guī)定的方法測定，計算每片(粒、袋)的溶出量。槳法以攪拌槳代替轉(zhuǎn)籃。測定時，取供試品6片(粒、袋),分別投入6個溶出杯內(nèi)(如片劑或膠囊劑浮于液面，應(yīng)先裝入沉降籃內(nèi))。其余同轉(zhuǎn)籃法。小杯法調(diào)試溶出儀，使槳葉底部距溶出杯的內(nèi)底部15mm±2mm。分別量取經(jīng)脫氣處理的溶出介質(zhì)100~250ml,置250ml的各溶出杯內(nèi)(用于膠囊劑測定時，如膠囊上浮，可用一小段耐腐蝕的細(xì)金屬絲輕繞于膠囊外殼)。以下操作同槳法。結(jié)果判定符合下述條件之一者，可判為符合規(guī)定：①6片(粒、袋)中，每片(粒、袋)的溶出量按標(biāo)示量計算，均不低于規(guī)定限度(Q)。②6片(粒、袋)中，如有1~2片 (粒、袋)低于Q,但不低于Q-10%,且其平均溶出量不低于Q。③6片(粒、袋)中，有1~2片(粒、袋)低于Q,其中僅有1片(粒、袋)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均溶出量不低于Q時，應(yīng)另取6片(粒、袋)復(fù)試；初、復(fù)試的12片(粒、袋)中有1~3片(粒、袋)低于Q,其中僅有1片(粒、袋)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均溶出量不低于Q。5.釋放度測定除另有規(guī)定外，儀器裝置同溶出度測定法。樣。在規(guī)定取樣時間點，吸取溶液適量，濾過。取濾液，照各品種項算每片(個)的釋放量。三個取樣時間點分布在釋放度測定的早期(一般在開始后的0.5～2h內(nèi))、中期和晚期(累積釋放率一般應(yīng)為75%以上),三個時間點的釋放量分別用于考察藥物是否有突釋、藥物的釋放特性和制劑釋藥是否完全。結(jié)果判定符合下述條件之一者，可判為符合規(guī)定：①6片(粒)中，每片(粒)在每個時間點測得的釋放量按標(biāo)示量計算，均未超出規(guī)定范圍。②6片(粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~2片(粒)超出規(guī)定范圍，但未超出規(guī)定范圍的10%,且在每個時間點測得的平均釋放量未超出規(guī)定范圍。③6片(粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~2片(粒)超出規(guī)定范圍，其中僅有1片(粒)超出規(guī)定范圍的10%,但未超出規(guī)定范圍的20%,且其平均釋放量未超出規(guī)定范圍，應(yīng)另取6片(粒)復(fù)試；初、復(fù)試的12片 (粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~3片(粒)超出規(guī)定范圍，其中僅有1片(粒超出規(guī)定范圍的10%,但未超出規(guī)定范圍的20%,且其平均釋放量未超出規(guī)定范圍。第二法用于腸溶制劑。方法1:酸中釋放量量取0.1mol/L鹽酸溶液750ml,注入每個溶出杯，加溫使溶液溫度保持在37℃±0.5℃,調(diào)整轉(zhuǎn)速并保持穩(wěn)定，取6片(個)分別投入轉(zhuǎn)籃或溶出杯中，按各品種項下規(guī)定的方法，開動儀器運轉(zhuǎn)2h,立即在規(guī)定取樣點吸取溶液適量，濾過，濾液按各品種項下規(guī)定的方法測定，計算每片(個)的酸中釋放量。緩沖液中釋放量上述酸液中加入0.2mol/L磷酸鈉溶液250ml(必要時用2mol/L鹽酸溶液或2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8±0.05),繼續(xù)運轉(zhuǎn)45min,或按各品種項下規(guī)定的時間，在規(guī)定取樣點吸取溶液適量，濾過，濾液按各品種項下規(guī)定的方法測定，計算每片(個)的緩沖液中釋放量。方法2:酸中釋放量量取0.1mol/L鹽酸溶液900ml,注入每個溶出杯中，照方法1酸中釋放量項下進(jìn)行測定。緩沖液中釋放量棄去上述各溶出杯中酸液，立即加入磷酸鹽緩沖液(pH6.8)(取0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液，按3:1混合均勻，必要時用2mol/L鹽酸溶液或2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8±0.05)900ml,或?qū)⒚科?個)轉(zhuǎn)移入另一盛有磷酸鹽緩沖液(pH6.8)900ml的溶出杯中，照方法1緩沖液中釋放量項下進(jìn)行測定。結(jié)果判定符合下述條件之一者，可判為符合規(guī)定。酸中釋放量：①6片(粒)中，每片(粒)的釋放量均不大于標(biāo)示量的10%。②6片(粒)中，有1~2片(粒)大于10%,但其平均釋放量不大于10%。緩沖液中釋放量：①6片(粒)中，每片(粒)的釋放量按標(biāo)示量計算均不低于規(guī)定限度(Q);Q應(yīng)為標(biāo)示量的70%。②6片(粒)中僅有1~2片(粒)低于Q,但不低于Q-10%,且其平均釋放量不低于Q。③6片(粒)中如有1~2片(粒)低于Q,其中僅有1片(粒)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均釋放量不低于Q時，應(yīng)另取6片(粒)復(fù)試；初、復(fù)試的12片(粒)中有1~3片(粒)低于Q,其中僅有1片(粒)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均釋放量不低于Q。第三法用于透皮貼劑儀器裝置同溶出度測定法中的槳法，但另用網(wǎng)碟固定透皮貼劑。將釋放介質(zhì)加入溶出杯內(nèi)，預(yù)溫至32℃±0.5℃;將透皮貼劑面朝上，再將網(wǎng)碟置于燒杯下部，并使貼劑與槳底旋轉(zhuǎn)面平行，兩者相距25mm±2mm,開始攪拌并定時定位取樣，取樣方法及余下操作同第一法。結(jié)果判定同第一法。6.中國藥典溶出度試驗的指導(dǎo)原則ChP(2005)對溶出度應(yīng)用的主要指導(dǎo)原則是： (1)重點用于難溶性的藥品品種，一般指在水中微溶或不溶的。用于因制劑處方與生產(chǎn)工藝造成臨床療效不穩(wěn)定的品種以及治療量與中毒量相接近的口服固體制劑(包括易溶性藥品),對后一種情況應(yīng)控制兩個時間點的溶出量(第一點不應(yīng)溶出過多)。(2)凡檢查溶出度或釋放度的制劑，不再檢查崩解時限。(3)轉(zhuǎn)速的設(shè)定，轉(zhuǎn)籃法以100r/min為主，槳溶出量至少為標(biāo)示量的70%。(4)溶出介質(zhì)應(yīng)以水、0.1mol/L鹽酸、緩沖液(pH值3-8)為主；若介質(zhì)中加適量有機(jī)溶劑如異丙醇、乙醇等或加分散助溶劑如十二烷基硫酸鈉(0.5%以下),應(yīng)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，并盡量選用低濃度，必要時應(yīng)與生物利用度比對。(5)測定時，每個溶出杯中只允許投入供試品1片(粒、袋),不得多投。三、實驗方法含量均勻度取本品1片(10mg規(guī)格),置100ml量瓶中，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液(取磷酸二氫鉀13.6g,加適量水溶解并稀釋至1000ml,搖勻，調(diào)節(jié)pH值至4.5)40ml,振搖使溶解，用pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液定量稀釋制成每1ml中含法莫替丁10μg的溶液，在266nm波長處測定吸光度；另精密稱取法莫替丁對照品適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液溶解，并定量稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，同法測定，計算含量，共測定10片，應(yīng)符合規(guī)定。溶出度取本品6片，照溶出度測定法(第一法),以pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液900ml為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為每分鐘100轉(zhuǎn)，依法操作，經(jīng)30min時，取溶液10ml,濾過，精密量另精密稱取法莫替丁對照品適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液溶解，并定量稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，同法測定，計算出每片的溶出量。限度為標(biāo)示量的80%,應(yīng)符合規(guī)定。影響溶出度測定的因素有很多，主要包括儀器因素和試驗操作因素。采用溶出度校正片可確定溶出儀的性能狀態(tài)以及試驗操作是否規(guī)范，從而減少儀器因素和試驗操作因素的影響，測得供試品的真實溶出。(一)儀器因素溶出儀運轉(zhuǎn)時整套裝置應(yīng)保持平穩(wěn)，不能產(chǎn)生明顯的晃動或振動；試驗時，最好使用同一型號的儀器，以減小系統(tǒng)誤差。攪拌軸、槳葉、網(wǎng)籃以及溶出杯的內(nèi)壁均不應(yīng)有吸附反應(yīng)或干擾供試品有效成分的測定。攪拌軸與溶出杯的中心度和垂直度應(yīng)符合規(guī)定。各溶出杯大小一致、厚薄均勻。水浴溫度應(yīng)均勻恒定，攪拌軸轉(zhuǎn)速應(yīng)穩(wěn)定。(二)試驗操作因素主要有溶出介質(zhì)、轉(zhuǎn)速設(shè)置、過濾方法、取樣位置、轉(zhuǎn)籃干濕、儀器工作環(huán)境等。攪拌軸的轉(zhuǎn)速應(yīng)比較溫和，以盡量模擬人體胃部和小腸的蠕動，人為地增加轉(zhuǎn)速，雖能使溶出加快，但并不能反映藥物在體內(nèi)的真實溶出情況。絕大部分藥物制劑，由于不溶性輔料顆?；鞈以谌艹鼋橘|(zhì)中，必須過濾后才能測定；應(yīng)使用惰性材料制成的濾器過濾，以免吸附藥物或干擾測定；如果過濾材料與藥物不發(fā)生相互作用，可反復(fù)濾過藥物的溶出液，使吸附飽和，然后取續(xù)濾液測定，也可避免因可能的吸附而造成的測定誤差。應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)量配套取樣器，在取樣孔內(nèi)取樣，以保證取樣位置在轉(zhuǎn)籃或槳葉頂端至液面的中點，距溶出杯內(nèi)壁10mm處(小杯法為6mm處)。采用轉(zhuǎn)籃法時，藥品應(yīng)投入干燥的轉(zhuǎn)籃中。試驗時應(yīng)排除外界的振動因素，保持環(huán)境溫度和濕度的相對恒定，避免強(qiáng)光照射，對光不穩(wěn)定的藥物應(yīng)避光操作。溶出介質(zhì)對溶出度測定結(jié)果的影響如下：1.溶出介質(zhì)的種類常用溶出介質(zhì)有水、0.1mol/L鹽酸、緩沖液(pH值3～6.8,最高可達(dá)8.0)、人工胃液(pH1.2)和人工腸液(pH6.8);也可在介質(zhì)中加適量有機(jī)溶劑(如異丙醇、乙醇)、表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，一般小于0.5%)、酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)等物質(zhì)。溶出介質(zhì)的種類對溶出度試驗結(jié)果的影響較大。通常，溶出介質(zhì)首選水，因為只要制劑在水中的溶出度達(dá)到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，則該制劑的生物利用度和生物等效性一般不會有問題。USP(29)收載的700多個品種的溶出度試驗中，絕大部分以水為溶出介質(zhì)。選擇溶出介質(zhì)，還應(yīng)考慮藥物本身的理化性質(zhì)及制劑口服后在胃腸道中吸收的部位。大多數(shù)弱酸性藥物在胃中易于吸收，可選擇酸性溶液或人工胃液為溶出介質(zhì)；對水溶性較差的藥物，可選用加有適量表面活性劑或有機(jī)溶劑的溶出介質(zhì)。2.溶出介質(zhì)的體積體積應(yīng)盡可能大，以使藥物的溶出符合漏槽條件。一般一個劑量單位以900ml或1000ml溶出介質(zhì)最為普遍，制劑規(guī)格較小時可使用常用體積的1/2～3/4。小杯法體積一般為100～250ml,以方便小劑量制劑在溶出度試驗中的定量分析，減小試驗試驗過程中，溶出介質(zhì)的體積應(yīng)保持不變。所以，不僅應(yīng)對取樣時移出的介質(zhì)量據(jù)實予以補(bǔ)充，并列入計算[ChP(2005)規(guī)定：多次取樣時，所量取溶出介質(zhì)的體積之和應(yīng)在溶出介質(zhì)總體積的±1%之內(nèi)，如超過總體積的1%,應(yīng)及時補(bǔ)充溶出介質(zhì)或在計算時加以校正],而且應(yīng)注意溶出過程中的介質(zhì)蒸(揮)發(fā)量，特別是在溶出時間較長、溶出介質(zhì)體積較小時更應(yīng)注意。試驗時為溶出杯配上適宜的蓋子，可防止介質(zhì)蒸(揮)發(fā)。3.溶出介質(zhì)中的氣體介質(zhì)中溶解的氣體可產(chǎn)生化學(xué)干擾或物理干擾。(1)化學(xué)干擾主要包括改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)的pH值和藥物被氧化。在緩沖介質(zhì)中，溶解的氣體對pH值影響較小，但當(dāng)用水作介質(zhì)時，影響較大，這主要由于空氣中的CO?溶于水后，形成H和HCO?而導(dǎo)致pH值下降。若藥物的溶解度受pH影響較大，則藥物的溶出度就會因介質(zhì)中溶解的氣體而產(chǎn)生明顯差異。另外，某些輔料(特別是粘合劑)可能受pH值影響，致使制劑的崩解和解聚時間縮短或延長，影響藥物的溶出速率。因此，當(dāng)用水作為溶出介質(zhì)時，必須認(rèn)真檢查、控制pH值?？諝庵泻幸欢康难鯕猓?dāng)空氣溶入介質(zhì)后，一些易氧化的藥物往往因氧化而明顯影響溶出度試驗結(jié)果。因此，對易氧化的藥物，溶出介質(zhì)更應(yīng)嚴(yán)格脫氣，必要時可通入惰性氣體(如N?)盡可能除去氧氣后，再進(jìn)行脫氣處理。(2)物理干擾主要包括影響制劑的崩解、解聚和溶出，改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)的流型以及減小篩網(wǎng)的孔隙率。溶出介質(zhì)中溶解的氣體由于減少了制劑與介質(zhì)的接觸表面積，而使制劑的崩解和藥物的溶出受到影響；當(dāng)制劑崩解成顆粒后，小氣泡能比較容易地附著在粗糙的顆粒表面，阻礙顆粒解聚，從而影響藥物的溶出速率。當(dāng)溶出介質(zhì)的溫度升高時，氣體在介質(zhì)中的溶解度變小，此時氣體會以小氣泡形式從介質(zhì)中逸出。小氣泡從下向上逸出的過程中，會影響溶出介質(zhì)的流體動力學(xué)性質(zhì)，使介質(zhì)的流動類型發(fā)生改變而影響溶出度試驗結(jié)果(圖4-1)。另外，氣體受熱逸出時，一部分氣泡往往吸附在溶出杯壁、攪拌軸、槳葉、轉(zhuǎn)籃等固體表面。吸附在溶出杯壁上的氣泡會改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)在杯壁層的流型。吸附在攪拌軸及槳葉上的氣泡一般對溶出度測定影響較?。坏皆谵D(zhuǎn)籃上的氣泡會產(chǎn)生一層氣體屏障，阻礙藥物或小顆粒從轉(zhuǎn)籃內(nèi)擴(kuò)散出來，從總體上減少了轉(zhuǎn)籃的孔隙率，使藥物溶出減慢(圖4-2)。下下基于以上原因，ChP(2005)規(guī)定溶出介質(zhì)應(yīng)經(jīng)脫氣處理。脫氣方法為：取溶出介質(zhì)，在緩緩攪拌下加熱至約41℃,并在真空條件下不斷攪拌5min以上；或煮沸15min(約5000ml);或超聲、抽濾等其它有效脫氣方法。4.溶出介質(zhì)的溫度ChP(2005)規(guī)定溶出介質(zhì)的溫度為37℃±0.5℃,是指溶出杯內(nèi)溶出介質(zhì)的溫度，而不是指水浴的指示溫度。為使溶出介質(zhì)的溫度均勻恒定，除儀器水浴溫度必須均勻恒定外，通常要給溶出杯加蓋，以防止溶出介質(zhì)蒸(揮)發(fā)的冷卻作用。溫度對溶出速率的影響取決于藥物的溫度-溶解度曲線，有時溫度改變1℃,溶出速率的變化就可能大于5%,若每個杯內(nèi)溶出介質(zhì)的溫度均超出±0.5℃范圍，則誤差更明顯。5.溶出介質(zhì)的流型變化流型的一致性是溶出度數(shù)據(jù)重復(fù)性和可靠性的保證。影響流型的因素較多，有攪拌軸的幾何形狀、垂直度和中心度、外部振動、轉(zhuǎn)速、氣泡、溶出杯規(guī)格、取樣位置等。此外，取樣后補(bǔ)加溶出介質(zhì)亦會影響流型，這包括：加入介質(zhì)時沖擊力對流型的影響；補(bǔ)充介質(zhì)的溫度低于溶出杯內(nèi)介質(zhì)溫度時，介質(zhì)的熱交換對流型的影響。為保證溶出介質(zhì)的流型一致，應(yīng)嚴(yán)格控制溶出度試驗條件。五、思考題1.什么是溶出度?什么是釋放度?溶出度試驗有何意義?2.影響固體制劑中藥物溶出的因素主要有哪些?影響溶出度測定結(jié)果的因素主要有哪3.什么是含量均勻度?含量均勻度檢查有什么意義?第五章藥物的含量測定藥物的含量是評價藥物質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。藥