關(guān)于功能基因組學(xué)20世紀(jì)人類科技史上的三大創(chuàng)舉40年代第一顆原子彈爆炸60年代人類首次登上月球90年代人類基因組計(jì)劃第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因組(genome)泛指一個(gè)有生命體、病毒或細(xì)胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

一、基因組學(xué)概念及范疇基因組學(xué)(genomics)是指發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功能。第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因組學(xué)包括3個(gè)不同的亞領(lǐng)域結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)功能基因組學(xué)(functionalgenomics)比較基因組學(xué)(comparativegenomics)基因組學(xué)概念第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)是通過人類基因組計(jì)劃HGP的實(shí)施來完成的。HGP的內(nèi)容就是制作高分辨率的人類遺傳圖和物理圖，最終完成人類和其它重要模式生物全部基因組DNA序列測(cè)定，因此HGP屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)范疇。第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天人類基因組計(jì)劃（HGP）的研究內(nèi)容遺傳圖的分析（Geneticmap）

確定基因或DNA標(biāo)記在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

物理圖的分析（Physicalmap）

以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點(diǎn)）為路標(biāo)，以堿基對(duì)作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。將各種標(biāo)記直接定位在基因庫中的某個(gè)位點(diǎn)上。第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄圖的分析（Transcriptionalmap）

分離純化mRNA或cDNA比較分析蛋白質(zhì)的編碼能力，使人們有可能系統(tǒng)、全面地從mRNA水平了解特定細(xì)胞、組織或器官的基因表達(dá)模式，并解釋其生理屬性，深入認(rèn)識(shí)細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、衰老和疾病發(fā)生的機(jī)制。第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天序列圖分析（sequencemap）測(cè)定由30億個(gè)核苷酸組成的全部序列。人類基因組的核苷酸序列圖其實(shí)是分子水平上最高層次，最詳盡的物理圖。第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、后基因組學(xué)的研究（Postgenomeera）人類基因組計(jì)劃完成之后，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分?？茖W(xué)研究已開始進(jìn)入“后基因組時(shí)代”。主要是開展功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。有科學(xué)家形象地說道：即使基因測(cè)序全部完成，也只好像是一本沒有姓名，只有號(hào)碼的電話簿。“后基因組時(shí)代”的最終目標(biāo)，是要把深?yuàn)W的DNA語言變成一本大基因百科全書。第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)，后基因組學(xué)(Postgenomics)：利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息和產(chǎn)物通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能生物學(xué)研究從對(duì)單一基因或蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向?qū)Χ鄠€(gè)基因或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)行系統(tǒng)的研究。功能基因組學(xué)的目的基因功能發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)分析及突變檢測(cè)從基因組整體水平上對(duì)基因的活動(dòng)規(guī)律進(jìn)行闡述。第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1、功能基因組學(xué)的研究內(nèi)容基因功能的研究基因組的表達(dá)及時(shí)空調(diào)控的研究蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究基因組多樣性的研究模式生物體的基因組研究第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2、功能基因組學(xué)的研究方法單核苷酸多態(tài)性（SNPs）分析表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）分析基因表達(dá)的序列分析（SAGE）DNA芯片RNA干擾蛋白質(zhì)組學(xué)（雙向電泳—質(zhì)譜）第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天單核苷酸多態(tài)性（Singlenucleotidepolymorphism,SNP)定義單核苷酸多態(tài)性是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置發(fā)生了轉(zhuǎn)換，顛換，缺失和插入等變化而引起的序列多態(tài)性，而且任何一等位基因在群體中的頻率不小于1%。SNPs在GC序列上出現(xiàn)最為頻繁，以C-T最多見。據(jù)估計(jì)SNPs在人類基因組的平均密度為1/1000，數(shù)量巨大，因此多態(tài)性信息含量高。第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天DNA（分子）標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）簡單序列長度多態(tài)性（simplesequenecelengthpolymorphisrns,SSLPs)小衛(wèi)星序列：（MinisatelliteDNA）微衛(wèi)星序列：（MicrosatelliteDNA,MS）單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天SNPs與表型編碼區(qū)內(nèi)的SNPs可能改變氨基酸殘基的種類，這可以直接影響蛋白質(zhì)的功能；外顯子和內(nèi)含子相連部位的SNPs可能改變外顯子一內(nèi)含子的剪接，影響蛋白質(zhì)的修飾；在調(diào)控區(qū)域內(nèi)的SNPs可以改變mRNA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天以SNPs為基礎(chǔ)研究人類疾病遺傳學(xué)家尋找致病基因的基本策略是：連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析。連鎖分析是確定兩個(gè)遺傳標(biāo)記或者更多遺傳標(biāo)記之間的物理關(guān)系，以確定致病基因的位置。關(guān)聯(lián)分析是研究某種遺傳標(biāo)記與某一特定表型的之間的關(guān)系第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressedsequencetags,EST）ESTs是從已建好的cDNA文庫中隨機(jī)取出一個(gè)克隆，從5’末端或3’末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測(cè)序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用構(gòu)建遺傳學(xué)圖譜遺傳圖譜、物理圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜,是基因組計(jì)劃要獲得的3張遺傳學(xué)圖譜。構(gòu)建染色體物理圖譜需要大量的單拷貝短序列作為界標(biāo),由于大多數(shù)基因是單拷貝的,所以可以用EST序列充當(dāng)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)。而且,由于EST序列是轉(zhuǎn)錄基因的產(chǎn)物,可用來直接構(gòu)建遺傳連鎖圖,通過與基因組文庫序列比較,可以提供內(nèi)含子結(jié)構(gòu),可選擇剪切方式,轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)等信息。第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用分離和鑒定新基因

將所獲得EST用生物信息學(xué)方法與公共數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對(duì),可以迅速準(zhǔn)確的確定基因的功能。由于在構(gòu)建cDNA文庫時(shí)要盡可能的選用全長cDNA,所以一旦發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的EST,可以找到對(duì)應(yīng)的克隆,獲得的全長cDNA可以直接用于轉(zhuǎn)基因等研究。利用EST方法進(jìn)行發(fā)現(xiàn)、分離基因的研究,不僅是人類基因組研究的熱點(diǎn),而且也是模式生物基因研究的重要內(nèi)容。第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用基因差異表達(dá)的研究通過比較不同發(fā)育時(shí)期和每個(gè)發(fā)育時(shí)期不同組織器官cDNA文庫中的EST信息,可以繪出該物種在特定時(shí)間和空間的基因表達(dá)的發(fā)育順序譜。因?yàn)橐粋€(gè)基因表達(dá)的峰度越高,它被隨機(jī)調(diào)出而被測(cè)序的次數(shù)越多,而比較眾多cDNA文庫的EST數(shù)據(jù)可以推測(cè)1個(gè)基因在不同組織或器官中表達(dá)的差異。第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用基因的定位克隆

以EST為重要來源的染色體物理圖譜進(jìn)一步方便了對(duì)抗病基因的連續(xù)分析,可將抗病基因定位在染色體中的狹小區(qū)段,縮小抗病基因的篩選范圍。同時(shí),EST標(biāo)記是功能序列區(qū)的標(biāo)記,處于目標(biāo)基因的范圍內(nèi),是目標(biāo)基因的編碼區(qū),因此EST標(biāo)記是分離功能基因的有效標(biāo)簽,大大提高了克隆基因的效率。第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用比較基因組學(xué)的研究

利用EST序列中古老保守序列來研究生物中間的進(jìn)化關(guān)系,可以避免選擇家系、構(gòu)建群體、大量的統(tǒng)計(jì)分析等周期,長而繁瑣的遺傳圖譜的制作過程。此外,利用基因組較小的模式生物所獲得的已知功能基因,用復(fù)雜基因組生物,如人和動(dòng)植物的EST比較,從而推測(cè),待測(cè)EST的功能,已經(jīng)成為比較基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容。第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天EST的應(yīng)用用于制備cDNA芯片

芯片技術(shù),是目前高通量篩選EST的有效方法。隨著更多基因組計(jì)劃的開展和更多已知功能基因的積累,將來無需進(jìn)行測(cè)序,只通過DNA芯片技術(shù)就可以研究基因的功能。EST計(jì)劃的實(shí)施不僅獲得了關(guān)于表達(dá)基因的信息資源同時(shí)也獲得了大量已經(jīng)經(jīng)過功能鑒定了的cDNA克隆資源而這些資源都是功能基因組研究所不可缺少的。第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天SAGE（serialsanalysisofgeneexpression）基因表達(dá)系列分析

1995年，JohsHopkins大學(xué)的分子腫瘤學(xué)家Kinzler和Vogelstein及其同事建立了SAGE方法.第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天SAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)：來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鑒定一個(gè)轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽（tag）；通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體（concatemer），對(duì)每個(gè)克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測(cè)序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)豐度（abundance）。第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.將5μg含有oligodT（引物）的磁珠與RNA混合。2.合成雙鏈cDNA。

3.用NlaⅢ酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。

4.將樣品分成兩份，連接成含有識(shí)別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5.用MmeI切割每一個(gè)樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE步驟第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天6.延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。

7.PCR擴(kuò)增。8.用NlaⅢ酶切130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標(biāo)簽。9.連接片斷形成串聯(lián)體。

10.克隆到pZErO-1+里，并測(cè)序。

第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天SAGE實(shí)例第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天DNA芯片DNA芯片（DNAchip）也叫基因芯片（Genechip）是指在固相載體（玻璃，硅等）上有序地，高密度地（點(diǎn)間距小于500μm）排列固定了大量的靶基因或寡核苷酸（也叫探針）。這些被固定的分子探針在基質(zhì)上形成高密度的DNA微陣列，因此DNA芯片又叫DNA微矩陣（DNAMicroarray）第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天DNA芯片的基本原理基因芯片技術(shù)是建立在Southernblot基礎(chǔ)之上的，可以說它是Southernblot的改進(jìn)和發(fā)展，它的原理是：變性DNA加入探針后在一定溫度下退火，同源片段之間通過堿基互補(bǔ)形成雙鏈雜交分子。第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因芯片基本操作流程制備總RNAmRNA經(jīng)RT-PCR用Cy3（正常對(duì)照組）和Cy5（實(shí)驗(yàn)組）熒光標(biāo)記目的基因，得到cDNA探針

混合標(biāo)記探針與表達(dá)譜芯片上核苷酸片段（或基因）雜交掃描分析雜交結(jié)果

結(jié)論第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因芯片第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天基因芯片的應(yīng)用生物信息學(xué)的工具基因相關(guān)性研究基因功能藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)潛在反義試劑開發(fā)個(gè)體化醫(yī)療身份識(shí)別基因診斷其他與生物有關(guān)的領(lǐng)域特定基因檢測(cè)突變檢測(cè)多態(tài)性分析基因表達(dá)譜第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天例：腫瘤診斷國外有一臨床病人表現(xiàn)出典型的白血病癥狀，但形態(tài)學(xué)檢測(cè)不典型，根據(jù)相關(guān)檢查，診斷為AML（acutemyeloidleukaemia,急性骨髓白血?。?，治療幾個(gè)月后未見好轉(zhuǎn)。后來用DNA芯片與病人骨髓的mRNA雜交，結(jié)果顯示AML和ALL(acutelymphoblasticleukaemia急性成淋巴細(xì)胞白血病)基因都表達(dá)較低，而在數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，編碼原肌球蛋白的基因表達(dá)極高，從而確診為肺泡彈狀肌肉瘤，改變治療方案，病情出現(xiàn)緩解。第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天RNAi（RNAinterference，RNA干擾）通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，存在于從低等的線蟲到人類培養(yǎng)細(xì)胞等多種有機(jī)體。

RNAi相關(guān)技術(shù)是研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的有效工具，可用于功能基因組學(xué)研究以及基因治療等臨床用途。第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天RNAi研究史十幾年前，RichJorgensen在矮牽牛花中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因沉默七年前，researchersGuo和Kemphues注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1

基因的表達(dá)；三年后，F(xiàn)ire等注入雙鏈RNA到線蟲中發(fā)現(xiàn)比注入單鏈更有效，隨后發(fā)展了通過RNAi進(jìn)行線蟲基因敲除的策略。近年來，顯微注射，基因槍，基因工程手段誘導(dǎo)RNAi也成為果蠅研究中的反向遺傳學(xué)工具。2001年Elbashir等《Nature》上首次報(bào)道通過21個(gè)核苷酸的siRNA成功地在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天RNAi機(jī)制模式圖第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天核心技術(shù)：

siRNA（SmallinterferingRNA）的設(shè)計(jì)與合成siRNA的標(biāo)記siRNA的轉(zhuǎn)染RNAi的檢測(cè)（核酸及蛋白水平）RNA干擾技術(shù)第47頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.siRNA的一般結(jié)構(gòu)：哺乳動(dòng)物：21-23bpdsRNA

其它生物：更長的片段dTdT（UU）（UU）dTdTsiRNA的設(shè)計(jì)第48頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.設(shè)計(jì)流程（選擇siRNA靶位點(diǎn)）從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始，搜尋下游AA序列，記錄跟每個(gè)AA3’端相鄰的1