選修生物技術(shù)實踐平陽中學(xué)生物組高翔實驗1

大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天基本要求1．進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2．進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)。發(fā)展要求說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。教學(xué)要求第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌1、革蘭氏陰性2、異養(yǎng)兼性厭氧腸道桿菌4、基因工程中被廣泛應(yīng)用①大腸桿菌質(zhì)?！d體②大腸桿菌——受體細(xì)胞3、繁殖方式：二分裂第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)：LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)分離：LB固體平面培養(yǎng)基劃線分離第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天一、實驗材料1、大腸桿菌菌種斜面：提供實驗用的大腸桿菌。2、LB液體培養(yǎng)基(溶菌肉湯培養(yǎng)基)（1）蛋白胨：（2）酵母提取液：（3）Nacl：（4）水：（瓊脂：凝固）生長因子：微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物提供碳源、氮源、生長因子等。提供生長因子（維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等）維持滲透壓良好的溶劑，維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二、實驗步驟1、液體培養(yǎng)基滅菌①滅菌對象：②滅菌方法：高壓蒸汽滅菌（1Kg/cm2壓力、121℃、15—30分鐘）（500g/cm2壓力、90℃以上、30分鐘）若有機(jī)物加熱會分解第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天灼燒滅菌干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。

第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2、分裝倒平板①操作環(huán)境：超凈工作臺。②操作前進(jìn)行消毒：用酒精棉球擦拭桌面和手。③操作:使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法（低溫消毒法）:如牛奶的消毒c.化學(xué)藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等d.紫外線消毒方法第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天倒平板技術(shù)第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染?？諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。5.如何判斷培養(yǎng)基是無菌的？將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天滅菌和消毒的比較滅菌消毒概念強(qiáng)烈的理化因素較為溫和的理化因素方法灼燒滅菌

干熱滅菌高壓蒸汽滅菌煮沸消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑消毒紫外線消毒程度殺死芽孢和孢子不殺死芽孢和孢子第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天芽孢：有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌。第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3、接種擴(kuò)大培養(yǎng)接種環(huán)滅菌：灼燒滅菌第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4、劃線分離倒置

通過接種環(huán)在培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天單菌落4、劃線分離

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法

第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細(xì)胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天問題討論1.為什么在操作的第一步灼燒接種環(huán)？1.操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？2.以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？3.劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4.第一次劃線后，每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)嗎？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4、劃線分離①接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次②劃線后培養(yǎng)皿倒置③培養(yǎng)基培養(yǎng)后：在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已分離。第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天涂布分離法第一步：系列稀釋操作

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第二步：涂布平板操作劃線分離：方法簡單涂布分離：單菌落更易分開，但操作復(fù)雜。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天5、單菌落接種培養(yǎng)單菌落接種環(huán)劃線接種第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗討論

實驗完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？實驗完成后，所有接觸過細(xì)菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天擴(kuò)展：可以用培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行分離(1)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的改變可達(dá)到分離微生物的目的。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可以分離固氮微生物。又如加高濃度的食鹽,抑制多種細(xì)菌生長,分離到金黃色葡萄球菌。(2)當(dāng)培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離出能消除石油污染的微生物的目的。(3)改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達(dá)到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，只能得到耐高溫的微生物。第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天分析下面培養(yǎng)基的配方：葡萄糖、尿素、瓊脂、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O。請回答：(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是________和________。(2)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進(jìn)行選擇的？葡萄糖尿素有選擇作用。因為此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(3)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是(

)①化學(xué)消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線滅菌⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法A．⑤③②①④⑥B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤A第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離設(shè)備及用品：滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm×120mm）5支實驗材料：(1)50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面

第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟(1)滅菌：將配制好的50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB液體培養(yǎng)基分別裝入兩個250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進(jìn)行滅菌。(2)制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養(yǎng)基分別倒在4個培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接種擴(kuò)大培養(yǎng)：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。(4)劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h的菌液在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，然后將蓋好的培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。(5)單菌落接種培養(yǎng)：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37℃下培養(yǎng)24h,4℃冰箱保存。第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天單菌落第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗討論

實驗完成后，接觸過細(xì)菌的器皿應(yīng)如何處理？實驗完成后，所有接觸過細(xì)菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期