酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)主講：湯起武百年生機(jī)為時(shí)養(yǎng)器酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)虎紅平板凝集試驗(yàn)CONTENTS01酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)02虎紅平板凝集試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)Part-1酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（一）實(shí)驗(yàn)概述酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA，是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法。酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過(guò)目前所有人造催化劑。酶標(biāo)記抗原或抗體以后，既不影響抗原抗體反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。因此ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)療檢測(cè)以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（二）實(shí)驗(yàn)分類(lèi)及原理間接法雙抗夾心法雙位點(diǎn)一步法競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體、酶作用的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。一（1）間接ELISA的基本原理其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測(cè)抗體與之結(jié)合成固相抗原受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗（針對(duì)受檢抗體的抗體）與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定加底物后的顯色程度，確定待測(cè)抗體含量。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（2）雙抗夾心法的基本原理將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合?？捎媚繙y(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定加底物后的顯色程度，確定待測(cè)抗體含量。（3）雙位點(diǎn)一步法的基本原理在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（4）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法的基本原理競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)抗原為例，將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。加底物顯色，參考管顏色深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（三）操作方法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（1）實(shí)驗(yàn)器械一（2）基本實(shí)驗(yàn)步驟酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及試劑準(zhǔn)備加樣孵育洗板顯色比色結(jié)果分析一（3）基本操作方法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

洗滌液配制：用蒸餾水或去離子水將洗滌液按1:10稀釋?zhuān)浞只靹蚣礊楣ぷ鳚舛认礈煲骸?/p>

樣品稀釋及加樣：用樣品稀釋液將待檢清按1:40稀釋?zhuān)跇悠房酌靠變H加入已稀釋的待檢樣品100uL。

加對(duì)照品：陰性、陽(yáng)性對(duì)照品不用稀釋?zhuān)苯蛹訕?。陰性?duì)照2孔，每孔僅加入100uL陰性對(duì)照品；陽(yáng)性對(duì)照2孔，每孔僅加入100uL陽(yáng)性對(duì)照品。蓋好封板膜，37°C避光反應(yīng)30分鐘。一酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

洗板：甩去孔內(nèi)液體，每孔注滿(mǎn)工作濃度洗滌液洗滌3次，每次均需停留1分鐘；最后一次甩凈，拍干。

加酶反應(yīng)：每孔加酶標(biāo)結(jié)合物50uL，蓋好封板膜，37℃避光反應(yīng)30分鐘。甩去孔內(nèi)液體，如上洗板，拍干。

顯色反應(yīng)：按所需用量，臨用前取等體積底物液和顯色液充分混勻，每孔加100uL，蓋好封板膜，37℃避光反應(yīng)10分鐘。

終止反應(yīng)：加終止液50uL，用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)(630nm作為參比波長(zhǎng))讀取OD值。一（4）結(jié)果判定

Cut-of值(COV)=陰性對(duì)照平均OD值x2.1(陰性對(duì)照孔OD值0.08時(shí)，按0.08計(jì))

有效性判定:陰性對(duì)照孔OD值0.20(若大于0.20則實(shí)驗(yàn)無(wú)效);陽(yáng)性對(duì)照孔OD值>0.50(若小于0.50則實(shí)驗(yàn)無(wú)效)

檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?zhuān)簶悠稯D值>COV，判為豬瘟病毒抗體陽(yáng)性;樣品OD值<COV，判為豬瘟病毒抗體陰性以豬瘟病毒為例酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)一（5）注意事項(xiàng)ELISA的比色測(cè)定主要由酶標(biāo)儀進(jìn)行。此處強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時(shí)，必須平衡至室溫后，方可開(kāi)封啟用。

酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，室溫宜在15－30℃，使用前先預(yù)熱儀器15－30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。各種酶標(biāo)儀性能不同，使用前應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。

比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入比色架中，以免銹蝕酶標(biāo)儀比色架。

比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。

加樣時(shí)注意事項(xiàng)：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)Part-2虎紅平板凝集試驗(yàn)二（一）實(shí)驗(yàn)概述及原理

虎紅平板凝集試驗(yàn)是用來(lái)診斷布氏桿菌病。布氏桿菌病是由布氏桿菌引起的人畜共患的急、慢性傳染病。因接觸病畜或食用受染牛奶或奶制品而感染。潛伏期1-3周，臨床特點(diǎn)是緩慢起病，長(zhǎng)期發(fā)熱、多汗、虛弱、全身痛和關(guān)節(jié)痛，急性期癥狀多在3-6月內(nèi)消退。

虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)又稱(chēng)班氏孟加拉紅平板凝集實(shí)驗(yàn)，由于所有的抗原是酸性（ph3.6-3.9）帶色的抗原，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM類(lèi)抗體的凝集活性，檢查的抗體是IgG類(lèi)，因此提高了反應(yīng)的特異性。二材料準(zhǔn)備

抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說(shuō)明書(shū)使用受檢血清應(yīng)新鮮，無(wú)明顯蛋白凝塊，無(wú)溶血和腐敗氣味。

虎紅平板凝集反應(yīng)紙

吸頭，適用于滴加0.03ml

牙簽或火柴桿，供攪拌用（二）操作方法虎紅平板凝集試驗(yàn)(2)操作方法

將虎紅平板紙上加相應(yīng)血清0.03ml。

在受檢血清旁滴加抗原0.03ml。

用牙簽類(lèi)小棒攪動(dòng)血清和抗原使之混合。