傳染性無乳癥診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國動物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。Ⅱ傳染性無乳癥(contagiousagalactia,CA)是綿羊和山羊的一種傳染性疾病，是世界動物衛(wèi)生組織(WorldOrganizationforAnimalHealth,WOAH)法定報告的羊病之一，主要表現(xiàn)為乳腺炎、關(guān)節(jié)炎和無乳支原體(Mycoplasmaagalactiae,Ma)是CA的主要病原，但絲狀支原體山羊亞種(Mycoplascapricolum,Mcc)和腐敗支原體(Mycoplasmaputrefaciens,Mpf)也是該病的病原。本文件的制定參考了WOAH《陸生動物診斷試驗和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊》(2022),并結(jié)合了我國相關(guān)技術(shù)研究新成果。1傳染性無乳癥診斷技術(shù)本文件規(guī)定了傳染性無乳癥的臨床診斷以及樣品采集、運輸和保存，描述了病原分離與鑒定、普通PCR方法、熒光PCR方法等實驗室診斷方法。本文件適用于綿羊和山羊傳染性無乳癥的診斷。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。CA:傳染性無乳癥(contagiousagalactia)EDTA·Na?:乙二胺四乙酸二鈉鹽(ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt)MTA:改良Thiaucourt's瓊脂(modifiedThiaucourt'sagar)MTB:改良Thiaucourt's肉湯(modifiedThiMa:無乳支原體(Mycoplasmaagalactiae)Mcc:山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum)Mmc:絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri)Mpf:腐敗支原體(Mycoplasmaputrefaciens)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)PPLO:類胸膜肺炎微生物(pleuropneumonialikeorganisms)5臨床診斷5.1流行特點各種年齡、性別、品種的羊均易感，山羊較綿羊易感。泌乳期的奶山羊多發(fā)。病羊和無癥狀帶菌羊是本病主要的傳染源，膿汁、乳汁、眼和鼻的分泌物、糞尿等可長期帶菌。2可經(jīng)消化道、呼吸道、眼結(jié)膜、乳腺或創(chuàng)傷傳染，還可經(jīng)墊草或擠奶工人接觸傳播。5.2臨床癥狀主要表現(xiàn)為乳房炎型、關(guān)節(jié)炎型和角膜結(jié)膜炎型3種類型，常見混合性臨床表現(xiàn)。有時伴有肺炎和敗血癥，偶見懷孕母羊發(fā)生流產(chǎn)或死胎。初見乳房局部輕微腫大，觸診疼痛，有的淋巴結(jié)腫大，乳頭基部有硬結(jié)節(jié)。隨著病程發(fā)展，泌乳量逐漸減少，乳汁變稠，含有白色絮片或凝塊，繼而流出帶有凝塊的水樣液體。后期乳腺逐漸萎縮，泌乳停止。部分病例會伴發(fā)關(guān)節(jié)炎和角膜結(jié)膜炎，偶見肺炎和母羊流產(chǎn)。病程2周～8周或更長，多見于腕關(guān)節(jié)及跗關(guān)節(jié)，其他關(guān)節(jié)較少。初期跛行，關(guān)節(jié)無明顯變化。病情加重可見關(guān)節(jié)腫脹及周圍皮下水腫。后期患病關(guān)節(jié)逐漸僵硬，不能站立。羔羊可發(fā)生肺炎和敗血瘍瘢痕化后形成角膜白斑。隨著病程發(fā)展，白斑消失，角膜逐漸透明。嚴(yán)重時角膜組織可發(fā)生崩解，甚至晶狀體脫出。5.3剖檢病變?nèi)橄贁嗝娉识嗍倚郧粻?，腔?nèi)充滿凝乳樣物質(zhì)，呈綠色或白色。乳房實質(zhì)內(nèi)有豌豆大小的結(jié)節(jié)分布，擠壓時流出干酪樣物質(zhì)?？梢婇g質(zhì)性乳房炎和卡他性輸乳管炎。腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊水腫，結(jié)締組織增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)囊壁增厚；關(guān)節(jié)腔內(nèi)纖維素性滲出，滑液中有纖維素性團塊；關(guān)節(jié)面充血、糜爛。部分病例可見肺炎、胸膜炎。5.3.3角膜結(jié)膜炎型角膜乳白色，前房液中可發(fā)現(xiàn)半透明膠塊，嚴(yán)重時角膜水腫，中央出現(xiàn)白色小病灶或逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闈?.4結(jié)果判定符合5.1中流行特點之一、5.2中臨床癥狀之一以及5.3中剖檢病變之一的發(fā)病羊，可判定為疑似傳染性無乳癥。36.1材料準(zhǔn)備6.1.3普通溫箱?；钛蚩蛇x取乳汁、關(guān)節(jié)液、鼻分泌物、鼻咽拭子和結(jié)膜拭子作為樣品。耳道拭子和急性發(fā)病期羊的抗凝血可作為備選樣品。尸體解剖時，可采集乳腺和淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)液、肺組織(在患病組織和健康組織的交界處)及胸膜/心包液的樣品。采集后的樣品應(yīng)分別放入滅菌容器保存，置于冰上冷鏈運輸，盡快送至實驗室檢測或置一70℃以下凍存。無菌采集羊頸靜脈血，室溫先傾斜30℃下靜置2h～4h,待凝血析出血清后，3500r/min~4000r/min室溫離心5min,分離血清，置于冰上冷鏈運輸，盡快送至實驗室檢測或置—20℃凍存。7病原分離與鑒定47.3樣品接種7.3.1樣品稀釋：取接種材料0.5mL加至4.5mLMTB培養(yǎng)基中，標(biāo)記為10-1管，連續(xù)做10倍系列稀釋至10-3管。7.3.2接種：從上述3個梯度稀釋樣品中各取0.5mL分別接種至4.5mLMTB中，取0.2mL分別接培養(yǎng)物置含5%CO?培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。7.4克隆純化7.4.1接種物連續(xù)觀察7d,每日檢查支原體生長情況：——若MTA培養(yǎng)基上出現(xiàn)煎蛋樣菌落，疑似支原體生長時，應(yīng)按照7.4.4進行克隆純化；——若MTB培養(yǎng)基顏色變黃、輕微渾濁，應(yīng)取0.2mL接種至MTA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)煎蛋樣菌落時，按照7.4.4進行克隆純化。7.4.2若7d后MTA和MTB培養(yǎng)基均未見疑似支原體生長：——MTA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至21d,若仍無疑似支原體生長，則棄之；——從MTB培養(yǎng)物分別取0.5mL接種至新的4.5mLMTB中進行盲傳；按照7.4.1進行觀察處理；若仍未生長，再盲傳一次按照7.4.1觀察處理。7.4.3培養(yǎng)過程中，如果MTB培養(yǎng)液出現(xiàn)細(xì)菌污染，則取培養(yǎng)液用孔徑0.45μm微孔濾膜過濾后，再取濾過液0.5mL按照7.3.1接種觀察。7.4.4若MTA培養(yǎng)基上出現(xiàn)煎蛋樣菌落，則切取單個菌落(含瓊脂塊),倒置在一個新的MTA培養(yǎng)基的瓊脂表面，輕輕移動瓊脂塊進行克隆純化；連續(xù)2次克隆純化后，對單個菌落培養(yǎng)物按照第8章進行鑒定。7.5結(jié)果判定獲得克隆純化的支原體并經(jīng)普通PCR方法檢測為4種支原體任一陽性，判為病原分離鑒定陽性。8.1材料準(zhǔn)備8.1.1儀器與器材8.1.1.4凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀。套濾芯吸頭。8.1.2.1滅菌生理鹽水(0.85%氯化鈉溶液)。8.1.2.2市售動物組織基因組DNA提取試劑盒。8.1.2.32×PCR反應(yīng)預(yù)混合液(含Taq酶)。58.1.2.6TAE電泳緩沖液，按照附錄B中B.1的方法配制。8.1.2.71%瓊脂糖電泳凝膠，按照B.2的方法配制。8.1.2.8PCR引物(濃度均配制成20μmol/L),引物信息詳見表1。病原引物名稱引物序列(5'→3')靶基因退火溫度/℃延伸時間/S產(chǎn)物大小/bpMaMAGAUVRC1-LCTCAAAAATACATCAACAAGCuvrCMAGAUVRC1-R5CTTCAACTGATGCATCATAAMmcMMMLC2-LCAATCCAGATCATAAAAAACCTLppAMMMLC2-RCTCCTCATATTCCCCTAGAAMecMCCPL1-LAGACCCAAATAAGCCATCCALppAMCCPL1-RCTTTCACCGCTTGTTGAATGMpfMputlAAATTGTTGAAAAATTAGCGCGACarcBMput2CATATCATCAACTAGATTAATAGTAGCAC8.2試驗程序8.2.1核酸提取經(jīng)6.2處理的拭子樣品、液體樣品(乳汁、關(guān)節(jié)液、胸膜/心包液)和支原體培養(yǎng)物經(jīng)13000r/min離心20min后，棄上清液，收集沉淀用于提取基因組DNA;經(jīng)6.2處理的組織樣品和血液樣品，直接用于提取基因組DNA。提取的基因組DNA,應(yīng)立即進行PCR反應(yīng)或一20℃保存。8.2.2核酸擴增擴增時均應(yīng)設(shè)立陽性、陰性對照。陽性對照分別以攜帶4種支原體靶基因質(zhì)粒作為模板，制備方法按照附錄C;陰性對照以無核酸酶水作為模板。95℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,按表1中4種支原體對應(yīng)的溫度退火30s,72℃延伸1min或30s,35個循環(huán)；72℃終延伸5min,4℃保存。8.2.3擴增產(chǎn)物電泳將5μL的6×上樣緩沖液加入PCR產(chǎn)物中(包括被檢樣品，陰、陽性對照樣品),混勻后各取5μL加入1%瓊脂糖電泳凝膠中，并設(shè)立DNAMarker對照，100V電壓下穩(wěn)壓電泳30min～40min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)或紫外檢測儀中觀察結(jié)果。68.3結(jié)果判定8.3.1試驗成立條件陽性對照有對應(yīng)的特異性擴增條帶(Ma:1624bp,Mmc:1049bp,Mcc:1356bp,Mpf:316bp),且陰性對照無任何擴增條帶。電泳圖例見附錄D中圖D.1。8.3.2結(jié)果判定方法符合8.3.1的條件，被檢樣品有任一特異性擴增條帶，判定為檢出傳染性無乳癥病原核酸。樣品無對應(yīng)擴增條帶，判定為未檢出傳染性無乳癥病原核酸。9.1材料準(zhǔn)備9.1.1儀器與器材9.1.1.2實時熒光定量PCR儀。9.1.1.3熒光PCR反應(yīng)管。套濾芯吸頭。9.1.2.1市售無核酸酶水。9.1.2.2市售動物組織基因組DNA提取試劑盒。9.1.2.3熒光PCR預(yù)混液。9.1.2.4熒光PCR正向引物、反向引物及探針，詳細(xì)信息見表2。表2熒光PCR檢測傳染性無乳癥病原的引物及探針引物名稱引物序列(5'→3')產(chǎn)物大小/bp檢測對象polC正向引物GCGCATGCTACCGCTTATGTMa反向引物CTAGCATAAAATGCCAAAGGTTCA探針VIC-ATGGCACTATGAATAGC-MGB正向引物CAAAAAGARCGTGTTGGWCGTAMme/Mec/Mpf反向引物CCAACAGCTGCAGCAATATC探針FAM-CGTACTGAAATTGAAGAAG-MGB9.2試驗程序7GB/T42364—20239.2.2核酸擴增9.2.2.1.1檢測Ma的反應(yīng)體系：按照附錄E中E.1在熒光PCR反應(yīng)管中配制。每次反應(yīng)均設(shè)置陽性對照和陰性對照。以攜帶MaPolC基因的質(zhì)粒作為陽性對照，制備方法按照附錄F,以無核酸酶水作為陰性對照。9.2.2.1.2檢測Mmc/Mcc/Mpf的反應(yīng)體系：按照E.2在熒光PCR反應(yīng)管中配制。每次反應(yīng)均設(shè)置陽性對照和陰性對照。以攜帶Mmc/Mcc/Mpf任一支原體FusA基因的質(zhì)粒作為陽性對照，制備方法按照附錄F,以無核酸酶水作為陰性對照。95℃預(yù)變性10min;95℃變性15s,60℃退火延伸60s,40個循環(huán)，在每一循環(huán)的60℃時收集熒光信號。9.3結(jié)果判定9.3.1試驗成立條件陽性對照的Ct值≤35.0且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照應(yīng)沒有Ct值或Ct值>35.0且無特異性擴增曲線，試驗成立；否則應(yīng)重新進行試驗。9.3.2結(jié)果判定方法符合9.3.1的條件，當(dāng)用polC引物或fusA引物檢測樣品任一Ct值≤35.0,且出現(xiàn)特異性擴增曲線，判定為傳染性無乳癥病原核酸陽性；被檢樣品無Ct值或Ct值>35.0時，則判定為傳染性無乳癥病原核酸陰性。10綜合判定具有5.4且7.5、8.3、9.3中任何一項陽性者，判為傳染性無乳癥陽性。8(規(guī)范性)支原體培養(yǎng)基的配制A.1MTB培養(yǎng)基配制MTB培養(yǎng)基所需試劑如下：——21g/L的PPLO肉湯(不含結(jié)晶紫);——100mL/L的25%鮮酵母浸液；——200mL/L的滅活馬血清；——5mL/L的5%醋酸鉈溶液；——20萬IU/L的青霉素；——2g/L的葡萄糖；——2g/L的丙酮酸鈉；——5mL/L的0.4%酚紅。將21gPPLO肉湯溶于700mL去離子水中，116℃高壓滅菌30min,其余成分混合溶解后用0.22μm濾膜過濾，無菌加入冷卻的PPLO肉湯中，用滅菌的1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.6～7.8,分裝試管或三角瓶等，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?%醋酸鉈溶液(5mL/L)可用硫酸黏菌素(37.5mg/L)代替。A.2MTA培養(yǎng)基配制MTB培養(yǎng)基所需試劑如下：——35g/L的PPLO瓊脂；——100mL/L的25%鮮酵母浸液；——200mL/L的滅活馬血清；——5mL/L的5%醋酸鉈溶液；——20萬IU/L的青霉素；——2g/L的葡萄糖；——2g/L的丙酮酸鈉；——5mL/L的0.4%酚紅。將PPLO瓊脂35g溶于700mL去離子水，116℃高壓滅菌30min,其余成分用0.22μm濾膜過濾；滅菌后的PPLO瓊脂冷卻至50℃左右時加入預(yù)熱至50℃左右的濾膜過濾部分，用滅菌的1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.6～7.8,傾倒平皿或斜面等，2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?%醋酸鉈溶液(5mL/L)可用硫酸黏菌素(37.5mg/L)代替。9(規(guī)范性)PCR反應(yīng)溶液的配制B.1TAE電泳緩沖液(pH8.0)配制50×TAE電泳緩沖液(pH8.0)所需試劑如下：——37.2g的EDTA·Na?;——57.1mL的冰乙酸。使用前用去離子水進行50倍稀釋，為1×TAE電泳緩沖液。B.21%瓊脂糖電泳凝膠制備1%瓊脂糖電泳凝膠所需試劑如下：——1g的瓊脂糖；將瓊脂糖1g放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃左右時加入適宜的核酸染料，均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。配制PCR反應(yīng)體系所需試劑如下：——12.5μL的2×PCR預(yù)混合液(含Taq酶);——0.5μL的下游引物；——8.5μL的無核酸酶水；——3μL的DNA模板。PCR陽性對照的制備C.1儀器4對引物，濃度均為20pmol/μL,包括Ma引物(MAGAUVRC1-L/MAGAUVRC1-R)、Mmc引物(MMMLC2-L/MMMLC2-R)、Mcc引物(MCCPL1-L/MCCPL1-R)和Mpf引物(Mputl/Mput2),市售膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD-19T質(zhì)粒、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、10mg/mL氨芐青霉素和LB培養(yǎng)基。C.3.1Ma引物序列C.3.2Mmc引物序列C.3.3Mcc引物序列C.4陽性質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定C.4.1PCR擴增和產(chǎn)物回收C.4.1.1MaPCR擴增和產(chǎn)物回收以MAGAUVRC1-L和MAGAUVRC1-R為引物，以提取到的無乳支原體DNA為模板，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min,35個循環(huán)(94℃變性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，以確定擴增得到大小為1624bp的目的基因片段。以MMMLC2-L和MMMLC2-R為引物，以提取到的絲狀支原體山羊亞種DNA為模板，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min,35個循環(huán)(94℃變性30s,49℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，以確定擴增得到大小為1049bp的目的基因片段。C.4.1.3MccPCR擴增和產(chǎn)物回收以MCCPL1-L和MCCPL1-R為引物，以提取到的山羊支原體山羊亞種DNA為模板，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min,35個循環(huán)(94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸1min),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，以確定擴增得到大小為1356bp的目的基因片段。以Mput1和Mput2為引物，以提取到的腐敗支原體DNA為模板，擴增條件為：95℃預(yù)變性5min,35個循環(huán)(94℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s),最后72℃延伸5min,4℃保存。取5μLPCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，以確定擴增得到大小為316bp的目的基因片段。C.4.2質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定用商品化膠回收試劑盒分別回收純化C.4.1獲得的PCR產(chǎn)物，將純化DNA片段分別與pMD-19T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h～16h。挑取單一的白色菌落至含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至ODs值(波長600nm處的光密度值)1.0～1.2,取菌液2mL～5mL,利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，測序。將序列測定正確的質(zhì)粒分別命名為pMD-19T-1624、pMD-19T-1049、pMD-19T-1356和pMD-19T-316,作為4種支原體PCR陽性對照。質(zhì)粒和含有重組子的陽性菌分別保存于—20℃和-80℃。(資料性)檢測樣品電泳參照圖傳染性無乳癥(CA)4種病原PCR檢測結(jié)果陽性參照圖如圖D.1所示。1356bpM—-DNAMarker;1——Ma陽性對照；2——Ma陰性對照；7——Mpf陽性對照；8——Mpf陰性對照。圖D.1樣品檢測電泳圖(規(guī)范性)E.1檢測Ma的熒光PCR反應(yīng)體系配制檢測Ma的熒光PCR反應(yīng)體系所需試劑如下：——10μL的實時熒光定量PCR預(yù)混液；——8.5μL的無核酸酶水；——0.5μL的polC實時熒光定量PCR探針(1μmol/L);——0.5μL的polC實時熒光定量PC以上總體積為25μL。E.2檢測Mmc/Mcc/Mpf的熒光PCR反應(yīng)體系配制檢測Mmc/Mcc/Mpf的熒光PCR反應(yīng)體系所需試劑如下：——10μL的實時熒光定量PCR預(yù)混液；——8.5μL的無核酸酶水；——0.5μL的fusA實時熒光定量PCR探針(1μmol/L);——0.5μL的fusA實時熒光定量PCR反向引物(12.5μmol/L);——5μLDNA模板。以上總體積為25μL。(規(guī)范性)熒光PC