第第頁谷胱甘肽S—轉移酶（glutathioneS—transferase，GST）試劑盒說明書谷胱甘肽S轉移酶（glutathioneStransferase，GST）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預期差別大的樣本做猜測定。測定意義：GST是一種具有多種生理功能的蛋白質家族，重要存在于細胞質內(nèi)。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的緊要構成部分，重要催化各種化學物質及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價結合，使親電化合物變?yōu)橛H水物質，易于從膽汁或尿液中排泄，實現(xiàn)將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質降解并排出體外的目的。因此，GST在保護細胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮側緊要的生物學功能。另外，由于GST具有GSHPx活性，亦稱為nonSeGSHPx，具有修復氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能。注意，GST催化的反應減少GSH含量，但是不加添GSSG含量。測定原理：GST催化GSH與CDNB結合，其結合產(chǎn)物的光汲取峰波長為340nm；通過測定340nm波優(yōu)點吸光度上升速率，即可計算出GST活性。自備儀器和用品：低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)整移液器、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。試劑構成和配置：試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保管。試劑二：液體22mL×1瓶，4℃保管。試劑三：粉劑×1瓶，4℃保管。臨用前加2mL蒸餾水溶解。粗酶液提取：1.組織：依照組織質量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。2.細菌、真菌：依照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。3.血清等液體：直接測定。測定：1.分光光度計/酶標儀預熱30min，調(diào)整波長到340nm，用蒸餾水調(diào)零。2.試劑三放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫。3.測定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20μL上清液，180μL試劑二和20μL試劑三，快速混勻后于340nm測定吸光度變動，記錄10s和310s吸光度為A1和A2、GST活性計算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）.按蛋白濃度計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/mgprot）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=230×（A2A1）÷Cpr（2）.按樣本質量計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/g鮮重）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=230×（A2A1）÷W（3）按細胞數(shù)量計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個細胞每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/104cell）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=230×（A2A1）÷細胞數(shù)量（4）按液體體積計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/mL）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T=230×（A2A1）ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；106：1mol=1×106μmol；V反總：反應體系總體積，220μL=2.2×104L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質濃度測定試劑盒；W：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間（min），5min。b.使用96孔板測定的計算公式如下（1）.按蛋白濃度計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/mgprot）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（Cpr×V樣）÷T=460×（A2A1）÷Cpr（2）.按樣本質量計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每克樣品每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/g鮮重）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T=460×（A2A1）÷W（3）按細胞數(shù)量計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每104個細胞每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/104cell）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=460×（A2A1）÷細胞數(shù)量（4）按液體體積計算活性單位定義：在25℃或者37℃中，每毫升液體每分鐘催化1nmol/LCDNB與GSH結合為1個酶活單位。GST（nmol/min/mL）=（A2A1）÷ε÷d×109×V反總÷V樣÷T=460×（A2A1）ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù)，9.6×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；106：1mol=1×106μmol；V反總：反應體系總體積，220μL=2.2×104L；Cpr：上清液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質濃度測定試劑盒；W：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應時間（min），5min。注意事項：1.樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力；2.細胞中GST活性測定時，細胞數(shù)目須在300萬500萬之間，細胞中GST的提取時可加試劑一后研磨或超聲波處理