酶聯(lián)免疫反應(yīng)概述免疫分析：是以抗原抗體相互結(jié)合的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，研究免疫學技術(shù)及其在醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用。

免疫分析的分類根據(jù)分析過程中是否需要標記物可分為兩類一、標記免疫分析：根據(jù)標記物的種類可分為1、酶免疫分析2、放射免疫分析3、發(fā)光免疫分析4、熒光免疫分析5、金（銀）免疫標記分析二、非標記免疫分析：免疫沉淀實驗、免疫濁度分析技術(shù)一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大作用與特異性免疫反應(yīng)結(jié)合而建立的一種標記免疫技術(shù)。原理：用酶標記的抗原（或抗體）用于免疫反應(yīng)，并以相應(yīng)的底物被酶分解的顯色反應(yīng)對樣品中的抗體（或抗原）進行定位的分析和鑒定。

根據(jù)是否需要分離結(jié)合與游離的酶標記物可分為可分為非均相(或異相)酶免疫測定和均相酶免疫測定兩種方法。均相酶免疫分析法（homogeneousenzymeimmunoassay，HEI）是在檢測過程中抗原抗體反應(yīng)后，無需分離結(jié)合和游離酶標記物，直接根據(jù)反應(yīng)前后酶活性的改變進行待測物質(zhì)的測定的分析方法。

均相酶免疫分析主要有酶擴大免疫測定技術(shù)和克隆酶供體免疫測定兩種方法。均相酶免測定的對象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測定?？梢灾苯佑糜谌詣由治鰞x測定。非均相酶免疫分析法（heterogeneousenzymeimmunoassay）常用的酶免疫分析法多為非均相法，又可分為液相酶免疫法和固相酶免疫法兩種，以后者最常用，稱為酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。ELISA是臨床上最常用的免疫分析方法。需經(jīng)過結(jié)合的標記物和游離的標記物的分離才能測定.分離的方法主要通過固相載體吸附后清洗未結(jié)合的游離標記物。

ELISA既可以測定抗原，也可以測定抗體。根據(jù)測定對象不同，可采用不同的模式，主要有雙抗夾心法、間接法和競爭法等。一、ELISA簡介二、ELISA原理三、ELISA分類四、ELISA相關(guān)試劑五、ELISA影響因素六、ELISA應(yīng)用一、ELISA簡介1971年瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。自上世紀70年代初問世以來，ELISA發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領(lǐng)域。二、ELISA原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）加樣本微量反應(yīng)孔包被好的抗體振蕩、洗板待測項目（抗原）加入酶標記得抗原VV酶標記物輕鏈螯合劑辣根過氧化物酶重鏈振蕩、洗板V加入底物顯色液HHHHHHHHHHHHHH免疫標記技術(shù)放射物標記技術(shù)酶標技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法三、ELISA分類雙抗體夾心法競爭法間接法ELISA基本實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標本和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色實驗中對照的設(shè)置陽性對照陰性對照空白對照臨界標準品ELISA試劑（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；（5）結(jié)合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。固相抗原或抗體1、固相載體的性狀固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應(yīng)。ELISA載體的形狀主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龍膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小試管，以微量滴定板（96孔板）最為常用。良好的ELISA用96孔板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。3、包被條件酶標記的抗原或抗體（結(jié)合物）1、酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：（1）純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴；（2）制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力；（3）在受檢標本中不存在相同的酶；（4）相應(yīng)底物易于制備和保存，價格低廉；（5）有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。常用的酶為辣根過氧化物（horseradishperoxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosohatase，AP）。酶的底物1、HRP的底物HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，常用的供氫體有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，無致癌性等優(yōu)點。酶反應(yīng)用HCl或H2SO4

終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，2、AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯（p‐NPP）作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。NBT/BCIP，紫色反應(yīng)，水沖洗終止反應(yīng)。

試劑因素標本因素實驗原理或操作方法環(huán)境因素五、ELISA影響因素●抗原抗體的純度●標準品定值的準確性●抗體的親和力、滴度和特異性●標記物的比活性或免疫活性

試劑因素

內(nèi)源性物質(zhì)常見的有:類風濕因子（RF）、嗜異性抗體（Id）、補體、人抗動物抗體（HAAA）、藥物及其導致的代謝產(chǎn)物和交叉反應(yīng)物質(zhì)等。外源性物質(zhì)主要為：標本溶血、標本細菌污染、標本儲存時間過長、標本凝集不全和采血管中含有添加劑等。自身免疫產(chǎn)品：膽紅素濃度小于0.05mg/mL的黃疸，血紅蛋白濃度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯濃度小于25.0mg/mL的脂血對檢測結(jié)果沒有影響。

標本因素鉤狀效應(yīng)（HOOK效應(yīng)）及交叉反應(yīng)現(xiàn)象顏色終止條件

ELISA實驗終止劑選用引起的持續(xù)發(fā)展的顏色加深影響了陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結(jié)果,特別在大批樣品需較長時間進行讀數(shù)時,這種潛在的顏色逐漸加深現(xiàn)象成為結(jié)果影響的重要因素。ELISA的洗板過程

洗液沖力過大會造成酶結(jié)合物丟失,本底偏淺,吸光度值偏低,且洗板后殘留液規(guī)定一般不超過2ul。實驗原理或操作方法通風、采光與防塵?？刂茰囟燃皾穸?環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異應(yīng)使用系統(tǒng)空調(diào)進行控溫,并要求控制空氣濕度為40%～70%之間消除噪音與電磁干擾。穩(wěn)定水電,實驗過程中應(yīng)采用蒸餾水(純水)或經(jīng)軟化處理的自來水。環(huán)境因素六、ELISA應(yīng)用

飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor

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