基因工程載體在基因工程操作中，能攜帶外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具（DNA分子）叫載體。1.載體（Vectors）受體細(xì)胞載體2.基因工程中載體的功能（1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。（2）為外源基因提供在受體細(xì)胞中復(fù)制能力或整合能力。（3）為外源基因提供在受體細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)的必需條件。3.基因工程對(duì)載體的要求

（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制。（2）有選擇性標(biāo)記。（3）有一段多克隆位點(diǎn)。外源DNA插入其中不影響載體的復(fù)制。（4）分子量小，拷貝數(shù)多。（5）容易從宿主細(xì)胞中分離純化。

基因工程中常用的載體有6類：4.載體的種類質(zhì)粒（plasmid）單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）動(dòng)物病毒（virus）人造染色體載體一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒（plasmid）是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。多存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的，具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀雙鏈的分子結(jié)構(gòu)；質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb大腸桿菌的質(zhì)粒2.質(zhì)粒的空間構(gòu)型：①共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）③線形DNA（linear，lDNA）一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。②開環(huán)DNA（opencircular，ocDNA）3.質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL4.質(zhì)粒的基本特性質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒的不相容性攜帶特殊的遺傳標(biāo)記革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒，可分成兩大類：接合型質(zhì)粒:非接合型質(zhì)粒能自我轉(zhuǎn)移不能自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性除了帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外，還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。如：F質(zhì)粒（性質(zhì)粒、或F因子）：F質(zhì)粒不但能夠通過(guò)接合作用實(shí)現(xiàn)自我轉(zhuǎn)移，甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。又叫自我轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒。（1）接合型質(zhì)粒：不符合基因工程的安全要求。大腸桿菌接合（conjunction）（2）非接合型質(zhì)粒：雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。R質(zhì)粒（抗性質(zhì)粒）：帶有一種或數(shù)種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀（resistance）。符合基因工程的安全要求。B.質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)，進(jìn)行自主復(fù)制；質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系，往往具有宿主專一性。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：

嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒

松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒

嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplasmid）拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。

松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid）拷貝數(shù)多，有10—60份拷貝。（接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型）。（非接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬松弛型）。一種質(zhì)粒究竟是屬于嚴(yán)緊型還是松弛型并不是絕對(duì)的，與宿主的狀況有關(guān)。同一質(zhì)粒在不同的宿主細(xì)胞中可能具有不同的復(fù)制型，這說(shuō)明質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，同時(shí)還受到宿主的控制。一個(gè)有用的克隆載體需要有大量的拷貝存在于細(xì)胞中，這樣才能夠獲得大量的重組DNA。質(zhì)粒大小和拷貝數(shù)對(duì)于基因克隆尤為重要。C.質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)（親緣關(guān)系密切）不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容質(zhì)粒的不相容性的分子機(jī)制：兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物等。這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義。D.攜帶特殊的遺傳標(biāo)記5、質(zhì)粒載體的命名pBR322plasmid作者或?qū)嶒?yàn)室名稱F.Bolivar,R.L.Rodriguez質(zhì)粒的編號(hào)（1）分子量大，拷貝數(shù)低6、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.天然質(zhì)粒的局限性第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子大小9.1kb。有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。（2）篩選標(biāo)志不理想可以通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。（1）具有復(fù)制起點(diǎn)（ORI）2.質(zhì)粒載體必須具備的基本條件（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）：是篩選的標(biāo)志。理想的載體應(yīng)該有兩種以上抗菌素抗性基因。用來(lái)插入外源DNA片斷，且插入后不影響復(fù)制功能。（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。3.構(gòu)建質(zhì)粒載體的指導(dǎo)思想(1)刪除不必要的DNA區(qū)域。(2)減少限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。(3)加入易于檢出的選擇性標(biāo)記，便于檢測(cè)含有重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞。(4)關(guān)于質(zhì)粒安全性能的改造。(5)改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）4.質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及原理①抗菌素抗性絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記：（1）選擇標(biāo)記②遺傳標(biāo)記使受體菌發(fā)生遺傳性狀的改變的基因。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。（2）抗菌素選擇原理活死抗性基因抗菌素5.人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體的類型高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體復(fù)制失控的質(zhì)粒載體插入失活型質(zhì)粒載體正選擇的質(zhì)粒載體表達(dá)型質(zhì)粒載體（1）高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。而且在沒(méi)有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復(fù)制，達(dá)到每個(gè)細(xì)胞的拷貝數(shù)1000—3000個(gè)！適合大量增殖克隆基因、或需要表達(dá)大量的基因產(chǎn)物。（2）低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體

但有特殊用途:由pSC101派生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小，拷貝數(shù)低。當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重地影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pLG338、pLG339、pHSG415等不適合大量擴(kuò)增DNA用。（3）復(fù)制失控的質(zhì)粒載體這是一類溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒。溫度低（低于37oC），拷貝數(shù)很少；溫度增加（>40oC）時(shí)，拷貝數(shù)會(huì)很快增加到1000個(gè)以上。如pBEU1、pBEU2。runawayplasmidvectors1979年B.E.Uhlin等構(gòu)建。（4）插入失活型質(zhì)粒載體載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。如pDF41、pDF42、pBR329?？咕乜剐酝庠碊NA無(wú)抗菌素抗性（5）正選擇的質(zhì)粒載體如pUR2、pTR262等。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。直接選擇轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞。目前通用的絕大部分質(zhì)粒載體都是正選擇載體。Directselectionvectors（6）表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點(diǎn)ORI、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因I操縱基因O啟動(dòng)基因P核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件①表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)7、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1.pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度9.09kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)：EcoRI、XhoI、PvuI、HindIII、BamHI、SalI主要使用EcoRI。（其中HindIII、BamHI、SalI3個(gè)位于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）（4）克隆位點(diǎn)2.ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度6.3kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1和對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞1000-3000拷貝之多?、賑olicinE1基因的結(jié)構(gòu)ceaimmkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因②殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea+kil基因產(chǎn)物③不被其他細(xì)菌的colicinE1所殺死的原因imm基因EcoRI位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+）。EcoRI（4）克隆位點(diǎn)ColicinE1外源DNA無(wú)ColicinpSP2124質(zhì)粒的Ampr基因3.pBR322：（1）元件來(lái)源F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構(gòu)建載體。①?gòu)?fù)制起點(diǎn)oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)②

Ampr基因③Tetr基因pSC101的Tetr基因。（2）長(zhǎng)度4363bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ、SalI）；3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn)①雙抗菌素抗性選擇標(biāo)記插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因

BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因

PstITet中存活但在Amp中死亡加氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copy④安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。③高拷貝數(shù)②分子小，克隆能力大載體越小越好。>10kb的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。4.pUC系列UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19①?gòu)?fù)制起點(diǎn)pBR322的ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。②

Ampr基因（1）元件來(lái)源③lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌④lacZ’基因大腸桿菌lacZ的

-肽鏈序列，是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因（2）長(zhǎng)度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19Ampicillin抗性和lacZ的

肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。（4）選擇標(biāo)記藍(lán)白斑選擇原理：①X-gal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-

-D-galactoside）（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）√√√√

-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物X-gal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)

-半乳糖苷酶②

-半乳糖苷酶X-gal顯色反應(yīng)：③lacZ的

肽互補(bǔ)1）

-肽（lacZ’

）：

-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。

-半乳糖苷酶只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體2）受體菌lacZ突變（lacZ?M15）受體菌基因組的

-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失

肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解X-gal受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質(zhì)粒載體上的lacZ’

編碼

肽與這個(gè)缺失突變的

-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體，可以分解X-gal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’受體菌lacZ?3）載體lacZ’與

互補(bǔ)4）肽互補(bǔ)的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止肽的合成。

lacZ’5’3’

肽移碼突變lacZ’5’3’

肽不互補(bǔ)互補(bǔ)MCS外源DNA④IPTG的誘導(dǎo)作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’

肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。IPTGIPTG,異丙基--D-硫代半乳糖苷通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無(wú)插入時(shí)，MCS有插入時(shí)，IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：?無(wú)質(zhì)粒的受體菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無(wú)抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌斑生長(zhǎng)無(wú)外源DNA插入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌

-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物肽互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長(zhǎng)有外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)

-半乳糖苷酶的缺失，不能分解Xgal。但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長(zhǎng)（5）pUC系列載體的優(yōu)點(diǎn)①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便X-gal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測(cè)序方便5、其它質(zhì)粒載體（1）pGEM-3Z由pUC派生而來(lái)。與pUC的主要區(qū)別是在MCS的兩側(cè)分別加了一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子T7和SP6。T7啟動(dòng)子SP6啟動(dòng)子MCSlacZ’Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識(shí)別轉(zhuǎn)錄。①如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉(zhuǎn)錄mRNA②外源基因正接反接都可以轉(zhuǎn)錄。③MCS與pUC18的完全一樣。（2）pGEM-4Z：與pGEM-3Z相同，只是T7啟動(dòng)子和SP6啟動(dòng)子的位置互換。pGEM-3Z的特點(diǎn)：（3）穿梭質(zhì)粒載體1）穿梭質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。（shuttleplasmidvectors）Yeast復(fù)制起點(diǎn)E.coli復(fù)制起點(diǎn)E.coli選擇標(biāo)記Yeast選擇標(biāo)記MCS大腸桿菌

枯草桿菌穿梭載體大腸桿菌

釀酒酵母穿梭載體大腸桿菌

動(dòng)物細(xì)胞穿梭載體

2）常用的穿梭質(zhì)粒載體3）穿梭載體的優(yōu)點(diǎn)②也能利用其它細(xì)胞系統(tǒng)（酵母、枯草桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等）進(jìn)行基因表達(dá)。③可以自如地在兩種不同寄主細(xì)胞之間來(lái)回轉(zhuǎn)移基因?？寺　?gòu)建表達(dá)E.coliAnimalcell①利用大腸桿菌進(jìn)行基因克隆、表達(dá)8、質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性A.質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳必須的兩個(gè)條件：（1）每個(gè)世代、每個(gè)質(zhì)粒至少要復(fù)制一次（2）在細(xì)胞分裂時(shí)，復(fù)制過(guò)的質(zhì)粒必須分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。有主動(dòng)分配和隨機(jī)分配兩種假說(shuō)。（1）主動(dòng)分配天然質(zhì)粒。B.質(zhì)粒分配方式具有一個(gè)控制質(zhì)?？截惙峙涞墓δ軈^(qū)（Par），能以主動(dòng)分配的方式確保質(zhì)粒能正確分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體缺失了par區(qū)，只能以隨機(jī)分配方式分到子細(xì)胞中。人工質(zhì)粒（一般情況下也能保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳）（2）隨機(jī)分配但在一定條件下會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的現(xiàn)象。在寄主菌細(xì)胞分裂的過(guò)程中，有一個(gè)細(xì)胞沒(méi)有獲得質(zhì)?？截悾⒆罱K繁殖成無(wú)質(zhì)粒的優(yōu)勢(shì)群體。C.分離的不穩(wěn)定性（1）新陳代謝負(fù)荷：5.影響質(zhì)粒載體穩(wěn)定性的主要因素使寄主細(xì)胞生長(zhǎng)減緩：質(zhì)粒載體使寄主的世代時(shí)間延長(zhǎng)約15%。①?gòu)?fù)制負(fù)荷減緩的程度與質(zhì)粒的分子量成正比。②轉(zhuǎn)錄和翻譯負(fù)荷丟失質(zhì)粒的細(xì)胞反而會(huì)成為優(yōu)勢(shì)群體！每個(gè)菌體中所擁有的質(zhì)?？截悢?shù)不完全相同，稱差度。（2）質(zhì)粒載體的拷貝數(shù)低拷貝數(shù)的質(zhì)粒的差度小，遺傳穩(wěn)定。差度（variance）：是產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的重要原因。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體差度大，擁有少量拷貝數(shù)的菌體多，發(fā)生丟失的可能性大。噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增二、噬菌體載體噬菌體是一類細(xì)菌病毒（Bacteriophage）。1、噬菌體的一般特性結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。T4噬菌體分為兩種：（1）

溶菌周期：2、噬菌體的生活周期感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。烈性噬菌體（virulentphage)（2）

溶源周期：感染細(xì)菌后，將自己的DNA整合到細(xì)菌的染色體DNA中，成為它的一個(gè)組成部分。形成這一過(guò)程稱為溶源化。整合到細(xì)菌染色體的噬菌體DNA稱為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。溫和噬菌體（temperatephage)原噬菌體（prophage)：三、單鏈?zhǔn)删w載體M13、f1、fd噬菌體單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13噬菌體（2）復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀DNA。（1）

單鏈DNA噬菌體的特點(diǎn)（3）RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑。（5）可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片斷的單鏈分子，便于作探針或測(cè)序。（1）+DNA。（ssDNA）（4）不存在包裝限制。（2）M13噬菌體RFdsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。成熟的噬菌體里只包裝有+DNA，也容易提取。M13噬菌體只感染雄性大腸桿菌。但M13DNA可以轉(zhuǎn)染雌性大腸桿菌。6407bp。2）DNA長(zhǎng)度3）DNA提純1）寄主（3）M13載體的構(gòu)建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區(qū)。（1）克隆區(qū)域的選定①基因間隔區(qū)（intergenicregion,IG區(qū)）IG區(qū)內(nèi)只有一個(gè)BsuI切點(diǎn)。其余9個(gè)BsuI限制性位點(diǎn)分布在其它部位。②酶切位點(diǎn)在IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的LacZ’（

-肽序列)。利用

-肽序列中的三個(gè)單一酶切位點(diǎn)（BglII、AvaII和PvuI）。

2）加入酶切位點(diǎn)①在IG區(qū)內(nèi)加入單一內(nèi)切酶位點(diǎn)第一個(gè)M13載體：M13mp1：M13RFBsuI不完全消化各種長(zhǎng)度的線性片斷（其中應(yīng)有只在IG上切開的線性全長(zhǎng)M13）E.coli

lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區(qū)插入lacZ’才能存活并在Xgal上出現(xiàn)互補(bǔ)的藍(lán)噬菌斑在M13mp1的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位點(diǎn)（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19對(duì)應(yīng)有相同MCS的pUC系列載體：pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

M13mp系列載體：（4）M13系列載體的優(yōu)點(diǎn)

1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段

2）X-gal顯色反應(yīng)，可供直接選擇

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