2006-09-04發(fā)布中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4要求 4.1種公羊 14.2新鮮精液 24.3凍精外觀 24.4凍精解凍后的要求 25抽樣 5.1抽樣檢驗(yàn)方案 25.2抽取樣本 26試驗(yàn)方法 26.1外觀 6.2解凍后凍精 26.3檢驗(yàn)分類 26.4檢驗(yàn)項(xiàng)目 37判定規(guī)則 37.1常規(guī)檢驗(yàn) 7.2型式檢驗(yàn) 37.3抽樣檢驗(yàn)對群體質(zhì)量水平的判定 3 38.1標(biāo)志 38.2包裝 8.3運(yùn)輸 8.4貯存 附錄A(規(guī)范性附錄)山羊冷凍精液質(zhì)量檢驗(yàn)方法 4 A.2凍精解凍 4 A.2.2方法 A.3精子活力檢查 4A.3.2方法 A.3.3計(jì)算 A.4前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的檢查 4 A.4.2方法 5A.4.3計(jì)算 5A.5精子畸形率的檢查 5ⅡA.5.1器材、溶液 5 A.6細(xì)菌數(shù)的檢查 6A.6.2培養(yǎng)基 6A.6.3操作步驟 6A.6.4菌落計(jì)數(shù)方法 7A.6.5平板菌落數(shù)的計(jì)算 附錄B(規(guī)范性附錄)山羊冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)程序 8B.1導(dǎo)言 8B.2質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)程序 8B.2.1監(jiān)督總體 8B.2.2確定質(zhì)量特性 8B.2.3監(jiān)督質(zhì)量水平 8B.2.4監(jiān)督檢驗(yàn)等級 8B.2.5檢索監(jiān)督抽樣方案 8B.2.6抽取樣本 8B.2.7檢驗(yàn)樣本 8B.2.8判斷監(jiān)督總體是否通過 8B.2.9應(yīng)用實(shí)例 8附錄C(資料性附錄)山羊冷凍精液制作程序和使用 C.1采精 9C.2稀釋液配制 9C.2.1所有器具應(yīng)潔凈并消毒滅菌 C.2.2化學(xué)試劑 9C.2.3稀釋液 9C.3精液稀釋與分裝 9C.3.1一次稀釋法 9C.3.2二次稀釋法 9C.3.3細(xì)管精液的分裝 9 9 C.5精液冷凍 C.5.1冷凍用具 C.5.2細(xì)管凍精 C.5.3顆粒凍精 C.5.4液氮 C.6精液解凍 C.7輸精 C.7.1開腔器輸精法 C.7.2注意事項(xiàng) Ⅲ本標(biāo)準(zhǔn)的第4章是強(qiáng)制性的，其余是推薦性的。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B是規(guī)范性附錄，附錄C是資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京)、農(nóng)業(yè)部全國畜牧獸醫(yī)總站。本標(biāo)準(zhǔn)委托農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南京)負(fù)責(zé)解釋。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了山羊冷凍精液的命名、種公羊和新鮮精液與冷凍精液技術(shù)要求、抽樣、試驗(yàn)方法、判定本標(biāo)準(zhǔn)適用于山羊冷凍精液(以下簡稱“凍精”)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版，均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T2828.1—2003計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序第1部分：按接受質(zhì)量限(AQL)檢索的逐批檢驗(yàn)抽樣GB/T4789.2—2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定GB/T5458液氮生物容器GB/T15239—1994孤立批計(jì)數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序及抽樣表GB/T15482—1995產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督小總體計(jì)數(shù)一次抽樣檢驗(yàn)程序及抽樣表3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)progressivemotility每劑量精液中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)。精子活力spermmotility在37℃環(huán)境下前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分率。精子畸形率abnormalspermpercentage畸形精子占總精子數(shù)的百分率。細(xì)菌數(shù)bacteriacount每劑量精液經(jīng)培養(yǎng)后觀察到的細(xì)菌菌落數(shù)。冷凍精液frozensemen經(jīng)特殊方法處理的精液超低溫冷凍后在液氮中(一196℃)長期保存。應(yīng)具有種用價(jià)值，體質(zhì)健康，無遺傳病，不允許有已發(fā)布的動(dòng)物防疫法中所明確的二類疫病中的任何一種疾病。24.2新鮮精液色澤乳白色或淡黃色。精子活力≥65%,精子密度≥6×10?個(gè)/mL,精子畸形率≤15%。4.3凍精外觀4.3.1細(xì)管細(xì)管無裂痕，兩端封口嚴(yán)密，印制的標(biāo)志清晰。4.3.2顆粒4.4凍精解凍后的要求4.4.1活力活力≥30%。4.4.2前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥3×107個(gè)。4.4.3精子畸形率精子畸形率≤20%。4.4.4細(xì)菌數(shù)細(xì)菌數(shù)≤800個(gè)。5.1抽樣檢驗(yàn)方案5.1.1生產(chǎn)方抽樣檢驗(yàn)生產(chǎn)方和使用方為質(zhì)量保證概率把關(guān)，按照GB/T15239—1994中的第5章，采用LQ=8,模式A抽樣方案檢索一次抽樣方案確定抽檢公羊(凍精)的樣本量。5.1.2質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)按照GB/T15482—1995中的第5章，該群體公羊(凍精)為一監(jiān)督總體，采用D?=10,用第二檢驗(yàn)等級抽樣方案確定抽檢公羊(凍精)的樣本量，其抽樣檢驗(yàn)程序見附錄B。5.1.3復(fù)檢和仲裁檢驗(yàn)復(fù)檢根據(jù)原抽樣方案確定，仲裁需抽樣按照5.1.2規(guī)定方案和7.3.2的判定規(guī)則。5.2抽取樣本抽取樣本見附錄B.2.6。6試驗(yàn)方法6.1外觀用目測法，其結(jié)果應(yīng)符合4.3的規(guī)定。6.2解凍后凍精解凍方法及精子活力、前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、精子畸形率、細(xì)菌數(shù)的檢驗(yàn)按附錄A規(guī)定的方法，其結(jié)果應(yīng)分別符合4.4中的規(guī)定。6.3檢驗(yàn)分類6.3.1常規(guī)檢驗(yàn)凍精產(chǎn)品的單項(xiàng)檢驗(yàn)，是型式檢驗(yàn)中的一部分，主要是在每生產(chǎn)批入庫前和銷售出站前的檢驗(yàn)。6.3.2型式檢驗(yàn)凍精產(chǎn)品全項(xiàng)目檢驗(yàn)，是評定產(chǎn)品質(zhì)量是否符合標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)方抽樣檢驗(yàn)、質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)和復(fù)檢、仲裁檢驗(yàn)時(shí)所選定的檢驗(yàn)。36.4檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目和檢驗(yàn)周期見表1。檢驗(yàn)類型檢驗(yàn)項(xiàng)目要求中章、條試驗(yàn)方法中章、條檢驗(yàn)周期常規(guī)檢驗(yàn)外觀、解凍后活力4.3、4.4.16.1、6.2每生產(chǎn)批入庫、出站。型式檢驗(yàn)外觀、解凍后活力、呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、畸形率、細(xì)菌數(shù)4.4.1～4.4.4生產(chǎn)方為質(zhì)量保證每兩個(gè)月為一抽檢周期，在周期內(nèi)進(jìn)行一次抽檢該群公羊(凍精)質(zhì)量水平。質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)可為不定期。7判定規(guī)則7.1常規(guī)檢驗(yàn)樣品所檢驗(yàn)項(xiàng)目中任何一項(xiàng)不合格，則判為不合格。7.2型式檢驗(yàn)樣品所檢驗(yàn)項(xiàng)目中任何一項(xiàng)不合格，則判為不合格。7.3抽樣檢驗(yàn)對群體質(zhì)量水平的判定7.3.1生產(chǎn)抽樣檢驗(yàn)的判定引用GB/T2828.1—2003第3章中Ac——接受數(shù)，Re--拒收數(shù)，d--不合格通過對抽取樣本檢驗(yàn)按GB/T15239—1994中5.11的規(guī)定，當(dāng)d≤Ac,則判可接收，當(dāng)d≥Re則判不可接收。7.3.2質(zhì)量監(jiān)督抽樣的判定通過對抽取樣本檢驗(yàn)按GB/T15482—1995中5.9的規(guī)定，當(dāng)d<r(不通過判定數(shù)),則判為可通過，當(dāng)d≥r,則判為不可通過，見附錄B.2.8。8.1標(biāo)志種公羊的品種可用代號。代號為該品種第一、第二個(gè)漢字的漢語拼音大寫字母。示例：波爾羊的品種代號“BE”。細(xì)管凍精應(yīng)在管壁(或包裝袋)上印制以下內(nèi)容并且印制標(biāo)志要清楚。a)生產(chǎn)站名；b)公羊品種；c)公羊號；d)生產(chǎn)日期。8.2包裝細(xì)管凍精用專用的塑料管25支包裝，顆粒凍精用滅菌紗布袋，每一包裝量顆粒不得超過100粒。8.3運(yùn)輸凍精運(yùn)輸過程中應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，貯存容器不得橫倒及碰撞和強(qiáng)烈振動(dòng)，保證凍精始終浸在液氮中。8.4貯存貯存凍精的低溫容器應(yīng)符合GB/T5458規(guī)定；專人負(fù)責(zé)及時(shí)補(bǔ)充液氮，凍精應(yīng)浸在液氮中；每只公羊的凍精單獨(dú)貯存；貯存凍精的容器每年清洗、消毒應(yīng)不少于一次并更換新鮮液氮；取放凍精時(shí)，凍精離開液氮的時(shí)間不得超過10s。4GB20557—2006(規(guī)范性附錄)山羊冷凍精液質(zhì)量檢驗(yàn)方法本附錄規(guī)定了通用的山羊冷凍精液質(zhì)量檢驗(yàn)方法，其中引用了GB/T4789.2。A.2凍精解凍恒溫水浴箱、5.0mL試管、1.0mL吸管、鑷子、2.9%檸檬酸鈉溶液。A.2.2方法A.2.2.1細(xì)管直接置于37℃水浴中解凍。A.2.2.2顆粒凍精置預(yù)先預(yù)熱至38℃的內(nèi)有1.0mL2.9%檸檬酸鈉溶液的試管中，水浴解凍，適當(dāng)搖動(dòng)，使凍精溶化。A.3精子活力檢查顯微鏡或顯微電視裝置、載玻片或精液性狀板、蓋玻片(18mm×18mm)、顯微鏡保溫箱或恒溫裝A.3.2方法下觀察活力，環(huán)境溫度或載物臺溫度保持38℃;也可通過顯微電視裝置在熒光屏上觀察活力。每樣品觀察3個(gè)視野，注意不同液層內(nèi)的精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行全面評定。A.3.3計(jì)算精子活力按式(A.1)計(jì)算：式中：M——精子活力；n第一視野活力；n?——第二視野活力；n?——第三視野活力。A.4前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)的檢查…………(A.1)血球計(jì)數(shù)板、血色素管、2mL吸管、小試管、計(jì)數(shù)器、顯微鏡或顯微電視裝置、滴管、3.0%氯化鈉溶液。5A.4.2方法A.4.2.1稀釋精液制備用血色素管準(zhǔn)確吸取10μL解凍精液，注入盛有1.99mL的3.0%氯化鈉溶液的試管內(nèi)，混勻，使之成為200倍稀釋的稀釋精液。A.4.2.1.2細(xì)管用血色素管準(zhǔn)確吸取10μL干解凍精液，注入盛有0.99mL的3.0%氯化鈉溶液的試管內(nèi)，混勻，使之成為100倍稀釋的稀釋精液。將血球計(jì)數(shù)板用血蓋片將計(jì)數(shù)室蓋好，用小吸管吸取一滴稀釋精液于血蓋片邊緣，使精液自行流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿不能有氣泡或厚度過大，然后在顯微鏡下或電視熒光屏上觀察計(jì)數(shù)。每樣品觀察上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室，取平均值，如兩個(gè)計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)結(jié)果誤差超過5%,則應(yīng)重檢。a)每劑量中精子數(shù)=5個(gè)中方格中的精子數(shù)×5(即計(jì)數(shù)室25個(gè)中方格的總精子數(shù))×10(1mm3內(nèi)的精子數(shù))×1000(每毫升精液的精子數(shù))×200(顆粒稀釋倍數(shù))或100(細(xì)管稀釋倍數(shù))×劑量值。上式可簡化為：每劑量中精子數(shù)=5個(gè)中方格精子數(shù)×1000萬(顆粒)或500萬(細(xì)管)×劑量值b)每劑量中呈前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)按式(A.2)計(jì)算：式中：c——每劑量中前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)，單位為個(gè)；s——每劑量中精子數(shù)，單位為個(gè)；M——活力，%。A.5精子畸形率的檢查醇、甘油。所用試劑為分析純。A.5.2方法A.5.2.1溶液配制A.5.2.1.1磷酸鹽緩沖液磷酸二氫鈉(NaH?PO?·2H?O)磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)雙蒸餾水定容至100mLA.5.2.1.2中性福爾馬林固定液40%甲醛HCHO(使用前每100mL甲醛用10.0g碳酸鎂飽和后過濾)磷酸二氫鈉(NaH?PO?·2H?O)磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)用0.89%氯化鈉約50.0mL溶解后加入8.0mL中和后的甲醛，再加0.89%氯化鈉溶液定容至A.5.2.1.3姬姆薩原液姬姆薩染料1.0g6GB20557—2006甘油[C?H?(OH)?]66.0mL姬姆薩染料放入研缽中加少量甘油充分研磨至無顆粒為止，然后將甘油全部倒入并放入恒溫箱中保溫繼續(xù)溶解4h,再加甲醇充分溶解混勻，過濾后貯于棕色瓶中待用，貯存時(shí)間越久染色效果越好。A.5.2.1.4姬姆薩染液姬姆薩原液2.0mL磷酸鹽緩沖液3.0mL蒸餾水5.0mL現(xiàn)配現(xiàn)用。A.5.2.2制片染色A.5.2.2.1抹片取解凍后精液一滴滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈35°夾角，將樣品均勻地拖布于載玻片上，自然風(fēng)干(約5min)。A.5.2.2.2固定在已風(fēng)干的抹片上滴上1.0mL～2.0mL中性福爾馬林固定液，固定15min后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然風(fēng)干。每樣品制作兩個(gè)抹片。A.5.2.2.3染色將固定好后的抹片反扣在帶有平槽的有機(jī)玻璃面上，把姬姆薩染液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢。A.5.2.3鏡檢將制備好的抹片在顯微鏡(1000倍油鏡)下觀察。每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子(分左、右兩個(gè)區(qū)),取兩片的平均值，兩片的變異系數(shù)不得大于20%,若超過應(yīng)重新制片。A.5.2.4計(jì)算精子畸形率按式(A.3)計(jì)算：式中：A——精子畸形率，%;A?——畸形精子數(shù)，單位為個(gè)； A.6細(xì)菌數(shù)的檢查養(yǎng)基。A.6.2培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：按GB/T4789.2—2003中5.1規(guī)定。A.6.3操作步驟A.6.3.1樣品的制備及培養(yǎng)A.6.3.1.1顆粒以無菌操作，將所檢樣品一粒直接放于滅菌平皿內(nèi)，自然解凍后待用。同一樣品制兩個(gè)平皿。7GB20557—2006A.6.3.1.2細(xì)管平皿內(nèi)。同一樣品制兩個(gè)平皿。A.6.3.1.3平皿樣品移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(可放置于46℃±1℃水浴保溫)注入平皿約15mL,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿與精液樣品混合均勻，同時(shí)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入另一滅菌平皿內(nèi)作空白對照。A.6.3.1.4培養(yǎng)待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。A.6.4菌落計(jì)數(shù)方法同一樣品兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)。A.6.5平板菌落數(shù)的計(jì)算所檢樣品的細(xì)菌菌落數(shù)按式(A.4)計(jì)算：式中：n?——第二平皿菌落數(shù)，單位為個(gè)。8(規(guī)范性附錄)山羊冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)程序本附錄給出了通用的山羊冷凍精液質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)程序，對這樣的特定對象產(chǎn)品，通過質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)對在群山羊(凍精)產(chǎn)品質(zhì)量水平評價(jià)。B.2質(zhì)量監(jiān)督抽樣檢驗(yàn)程序B.2.1監(jiān)督總體已投產(chǎn)的一群山羊(凍精);每只山羊一生產(chǎn)批的凍精為每一單位產(chǎn)品。B.2.2確定質(zhì)量特性每只山羊(凍精)質(zhì)量要求應(yīng)符合本標(biāo)準(zhǔn)中4.3～4.4的規(guī)定。B.2.3監(jiān)督質(zhì)量水平規(guī)定監(jiān)督質(zhì)量水平D?=10。B.2.4監(jiān)督檢驗(yàn)等級給出第二檢驗(yàn)等級。B.2.5檢索監(jiān)督抽樣方案在GB/T15482—1995表2中，由監(jiān)督總體量所在的列和規(guī)定的監(jiān)督質(zhì)量水平所在的行的相交處，讀出監(jiān)督抽樣方案。若相交處是箭頭，則沿著箭頭方向，讀出箭頭所指的第一個(gè)抽樣方案。監(jiān)督總體量介于兩數(shù)值之間時(shí)，應(yīng)使用其中數(shù)值較大者確定的方案。B.2.6抽取樣本樣本應(yīng)在監(jiān)督總體(一群投產(chǎn)山羊)中隨機(jī)抽取，按照檢索監(jiān)督抽樣方案已知抽檢山羊的樣本(只)數(shù)，并在群體中山羊按號順序排列，隨機(jī)確定樣品山羊，并分別在各樣品山羊凍精貯存罐中取出一生產(chǎn)批中凍精。B.2.7檢驗(yàn)樣本按照規(guī)定的檢驗(yàn)項(xiàng)目，對樣本中每只山羊凍精樣品檢驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)所檢樣本中的不合格品數(shù)。B.2.8判斷監(jiān)督總體是否通過根據(jù)監(jiān)督質(zhì)量水平和監(jiān)督檢驗(yàn)等級確定監(jiān)督抽樣方案，按GB/T15482—1995中5.9的規(guī)定檢驗(yàn)結(jié)果在樣本中不合格品數(shù)d≥r,則判該群山羊(凍精)為不通過；樣本中不合格品數(shù)d<r,則判該群山羊(凍精)通過。B.2.9應(yīng)用實(shí)例質(zhì)量監(jiān)督抽查需要評價(jià)某種羊場一群投產(chǎn)(生產(chǎn)凍精)的50只山羊凍精質(zhì)量，監(jiān)督質(zhì)量水平D?=10,用第二監(jiān)督檢驗(yàn)等級，由GB/T15482—1995表2查得監(jiān)督抽樣方案為n=2,r=2,該群種山羊中應(yīng)抽檢樣本是2只山羊(凍精),按樣本數(shù)在群體中隨機(jī)確定2只樣品山羊并在其凍精貯存罐中取出一生產(chǎn)批中凍精，按規(guī)定的項(xiàng)目檢驗(yàn)，若樣本中不合格品數(shù)d不小于不通過判定數(shù)r,即d≥r,則判該群山羊(凍精)不通過；如果樣本中不合格品數(shù)d小于不通過判定數(shù)r,即d<r,則判該群山羊(凍精)通過。(資料性附錄)山羊冷凍精液制作程序和使用采精前洗凈公羊下腹部，并用滅菌生理鹽水沖洗包皮內(nèi)腔，進(jìn)入采精場地對公羊給予充分的性準(zhǔn)備時(shí)間并空爬1次～2次，采精頻率每星期4次～5次，成年公羊每次可連采兩回，但間隔時(shí)間要在0.5hC