ICS67.050CCSX80DeterminationofvitaminA,D,EinfoodsforspecialmedicalpurposesbyOn-linesolidphaseextraction-two-dimensionalliquidphaseIT/SHFCA002—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4原理 5試劑與材料 6設(shè)備和儀器 37分析步驟 38分析結(jié)果表述 59精密度 510檢出限和定量限 5附錄A（資料性）維生素A、D、E標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度校正方法 6附錄B（資料性）儀器連接示意圖和維生素A、D、E標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖 7T/SHFCA002—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省疾病預(yù)防控制中心提出。本文件由江蘇省保健食品化妝品安全協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、泰州市食品檢驗(yàn)院、貴州省檢測(cè)技術(shù)研究應(yīng)用中心（貴州省分析測(cè)試研究院）、黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司、江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、武漢食品化妝品檢驗(yàn)所、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心、內(nèi)蒙古智慧質(zhì)量中心、南京威爾藥業(yè)科技有限公司、南京蘇勤邦企業(yè)管理咨詢有限公司、南京玉鶴鳴醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)科技股份有限公司、鯤魚健康藥業(yè)江蘇有限公司、鄭州瑞普生物工程有限公司、南通勵(lì)成生物工程有限公司、西安力邦臨床營(yíng)養(yǎng)股份有限公司。本文件主要起草人：韋娟、胡慧、吳新文、王象欣、薛瑾、盧躍鵬、葉穎慧、儀虹伯、吳淏迪、蔣歡、余文兵、李燕、任艷艷、施佰惠、楊宏、朱銘洪、朱峰、張昊、凌映茹、孫晨、王溪、楊潤(rùn)、曹子健、吉文亮、賈靜。本文件為首次發(fā)布。1T/SHFCA002—2024特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中維生素A、D、E的測(cè)定在線固相萃取-二維液相色譜法本文件規(guī)定了特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中維生素A、D、E的在線固相萃取-二維液相色譜測(cè)定方法。本文件適用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中維生素A、D、E的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理樣品經(jīng)皂化（含淀粉樣品需先用淀粉酶酶解）后，皂化液經(jīng)離心、過(guò)濾后進(jìn)二維液相色譜系統(tǒng)，樣品經(jīng)過(guò)一維色譜柱進(jìn)入接口中，通過(guò)濃縮、捕集、切割后進(jìn)入二維色譜中；一維液相色譜分析維生素A和維生素E4種生育酚異構(gòu)體，二維液相色譜分析維生素D，采用外標(biāo)法定量。5試劑與材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.1無(wú)水乙醇（C2H6O）：色譜純。5.1.2乙醇（C2H6O）。5.1.3乙腈（C2H3N）：色譜純。5.1.4甲醇（CH4O）：色譜純。5.1.5抗壞血酸（C6H8O6）。5.1.62，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚（C15H24O）：簡(jiǎn)稱BHT。5.1.7磷酸（H3PO4）：色譜純。5.1.8氫氧化鉀（KOH）。5.1.9甲基叔丁基醚（C5H12O）：簡(jiǎn)稱MTBE，色譜純。5.1.10淀粉酶：活力單位≥100U/mg。5.2試劑配制5.2.150%乙醇水溶液：量取500mL乙醇與500mL水，混合均勻，儲(chǔ)存于具塞錐形瓶中。5.2.2氫氧化鉀溶液（50g/100g）：稱取50g氫氧化鉀，加入50mL水溶解，冷卻后儲(chǔ)存于聚乙烯2T/SHFCA002—2024瓶中。5.2.30.1%磷酸水溶液：移取1mL磷酸，用水稀釋至1000mL。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1維生素A視黃醇（C20H30O，CAS號(hào)：68-26-8純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2維生素E5.3.2.1α-生育酚（C29H50O2，CAS號(hào)：10191-41-0純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2.2β-生育酚（C28H48O2，CAS號(hào)：148-03-8純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2.3γ-生育酚（C28H48O2，CAS號(hào)：54-28-4）：純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2.4δ-生育酚（C27H46O2，CAS號(hào)：119-13-1純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.3維生素D5.3.3.1維生素D2：鈣化醇（C28H44O，CAS號(hào)：50-14-6），純度>98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.3.2維生素D3：膽鈣化醇（C27H44O，CAS號(hào)：67-97-0純度>98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（0.500mg/mL）準(zhǔn)確稱取25.0mg維生素A標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.1)，用無(wú)水乙醇（5.1.1）溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇（5.1.1）定容至刻度，此溶液濃度為0.500mg/mL。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液轉(zhuǎn)移至棕色儲(chǔ)液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期1個(gè)月。臨用前將溶液回溫至室溫，并進(jìn)行濃度校正（校正方法見附錄A）。5.4.2維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.00mg/mL）分別準(zhǔn)確稱取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.2)50.0mg，用無(wú)水乙醇（5.1.1）溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇（5.1.1）定容至刻度，此溶液濃度為1.00mg/mL。將各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液轉(zhuǎn)移至棕色儲(chǔ)液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至室溫，并進(jìn)行濃度校正（校正方法見附錄A）。5.4.3維生素D標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100μg/mL)準(zhǔn)確稱取維生素D2標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.3)10.0mg，用無(wú)水乙醇（5.1.1）溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇（5.1.1）定容至刻度，得到維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100μg/mL）。準(zhǔn)確稱取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品(5.3.3)10.0mg，用無(wú)水乙醇（5.1.1）溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇（5.1.1）定容至刻度，得到維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100μg/mL）。將各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液轉(zhuǎn)移至棕色儲(chǔ)液瓶中，在-18°C下避光保存，有效期3個(gè)月。臨用前將溶液回溫至室溫，并進(jìn)行濃度校正（校正方法見附錄A）。5.4.4維生素A、D、E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別準(zhǔn)確移取維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.2mL、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0mL、β-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0mL、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0mL、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0mL、維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1mL、維生素D3標(biāo)準(zhǔn) 儲(chǔ)備液0.1mL于100mL容量瓶中，用50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，得到維生素A、D、E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（維生素A：1μg/mL，維生素E：20μg/mL，維生素D：0.1μg/mL）。臨用現(xiàn)配。3T/SHFCA002—20245.4.5維生素A、D、E混合工作液分別移取適量維生素A、D、E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50%乙醇水溶液（5.2.1）稀釋成以下濃度：維生素5.0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL）4.0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL）。6設(shè)備和儀器6.1在線固相萃取-二維液相色譜系統(tǒng)：含有三個(gè)獨(dú)立輸液泵、一個(gè)自動(dòng)進(jìn)樣器、一個(gè)柱溫箱、兩個(gè)紫外檢測(cè)器（或者二極管陣列檢測(cè)器）。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.4微孔濾膜：有機(jī)系，孔徑0.22μm。6.5渦旋混合器。6.6紫外分光光度計(jì)。6.7恒溫振蕩器。7分析步驟7.1試樣制備將一定數(shù)量的樣品按要求經(jīng)過(guò)縮分、粉碎、均質(zhì)后，儲(chǔ)存于樣品瓶中，避光冷藏，當(dāng)天測(cè)定。7.2試樣處理警示：使用的所有器皿不得含有氧化性物質(zhì)；處理過(guò)程應(yīng)避免紫外光照,盡可能避光操作；提取過(guò)程應(yīng)在通風(fēng)柜中操作。7.2.1不含淀粉樣品稱取2g~5g（精確至0.01g）經(jīng)均質(zhì)處理的固體試樣或10g~50g（精確至0.01g）液體試樣于250mL具塞錐形瓶中，固體試樣另需加入約20mL溫水（40℃~45℃),混勻，再加入1.0g抗壞血酸（5.1.5）和0.1gBHT（5.1.6），混勻，加入30mL乙醇（5.1.2），加入10mL~20mL氫氧化鉀溶液（5.2.2），邊加邊搖勻，混勻后于80℃±2℃恒溫振蕩皂化30min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫，皂化液轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，加50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，混勻，移取10mL皂化液于15mL離心管中，10000r/min離心5min，上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜后供液相色譜測(cè)定。7.2.2含淀粉樣品稱取2g~5g（精確至0.01g）經(jīng)均質(zhì)處理的固體試樣或10g~50g（精確至0.01g）液體試樣于250mL具塞錐形瓶中，固體試樣另需加入約20mL溫水（40℃~45℃),混勻，加入0.5g~1g淀粉酶（5.1.10于60℃±2℃恒溫避光振蕩30min后，再向酶解液中加入1.0g抗壞血酸（5.1.5）和0.1gBHT（5.1.6），恒溫振蕩皂化30min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫，皂化液轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中，加50%乙醇水溶液（5.2.1）定容至刻度，混勻，移取10mL皂化液于15mL離心管中，10000r/min離心5min，上清液過(guò)0.22μm微孔濾膜后供液相色譜測(cè)定。7.3儀器參考條件7.3.1流路連接（見附錄B圖1）7.3.2色譜參考條件4T/SHFCA002—20247.3.2.1在線固相萃取柱（SPE）：PLRP-S，4.6×12.5mm，15-20μm，或相當(dāng)者。7.3.2.2一維分析柱：Poroshell120PFP，4.6×100mm，4μm，或相當(dāng)者。7.3.2.3捕獲柱：Poroshell120EC-C18，4.6×5mm，4μm，或相當(dāng)者。7.3.2.4二維分析柱：ZorbaxEclipsePlusPAH，2.1×100mm，3.5μm，或相當(dāng)者。7.3.2.5柱溫：35°C。7.3.2.6SPE泵流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表見表1。7.3.2.7一維流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表見表2。7.3.2.8二維流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表見表3。7.3.2.9閥位置：閥1：0min（位置1-6）；4.5min（位置1-2）；5.9min（位置1-6）；閥2：0min（位置1-6）；19.1min（位置1-2）；19.8min（位置1-6）。閥2具體時(shí)間閥切以系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)維生素D出峰時(shí)間為準(zhǔn)。7.3.2.10進(jìn)樣量：100μL。7.3.2.11檢測(cè)波長(zhǎng)：一維：0~18.5min：325nm；18.5~20.5min：264nm（根據(jù)維生素D保留時(shí)間調(diào)整）；20.5~30.0min：294nm。二維：264nm。表1SPE泵流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表%%%%0000000000000000000000000000表2一維液相色譜流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表%%00表3二維液相色譜流動(dòng)相、流速及參考洗脫梯度表%%005T/SHFCA002—2024%%007.3.3維生素D切割窗口的確定按7.3.2色譜條件，此時(shí)閥2不切換：0~30min（位置1-6）。按順序分別進(jìn)1針空白溶液和2針維生素液相色譜圖見附錄B圖2所示。7.3.4維生素A、D、E完整分析方法的建立根據(jù)附錄B圖2結(jié)果確定維生素D捕獲窗口并編輯閥2的切換時(shí)間。切換開始時(shí)間為維生素D色譜峰起始時(shí)間減去0.1min，切換結(jié)束時(shí)間為維生素D色譜峰回到基線時(shí)間加0.1min。其余條件與6.3.2色譜條件一樣，得到完整的維生素A、D、E分析方法。8分析結(jié)果表述式中：X——試樣中維生素A或維生素D或維生素E的含量，維生素A、維生素D單位為微克每百克(μg/100g），維生素E單位為毫克每百克(mg/100g)；c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中維生素A、維生素D、維生素E的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL）；V——定容體積，單位為毫升(mL)；f——換算因子（維生素A、維生素D：f=1；維生素E：f=0.001）；100——由每克換算為每百克的換算系數(shù)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。如維生素E的測(cè)定結(jié)果要用α-生育酚當(dāng)量(α-TE）表示，可按下式計(jì)算：維生素E（mgα-TE／100g）=α-生育酚（mg/100g）+β-生育酚（mg/100g）×0.5+γ-生育酚（mg/100g）×0.1+δ-生育酚（mg/100g）×0.01；試樣中同時(shí)含有維生素D2和維生素D3，維生素D的測(cè)定結(jié)果以維生素D2和維生素D3的含量之和計(jì)算。9精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的15%。10檢出限和定量限當(dāng)取樣量為5g，定容體積為100mL時(shí)，維生素A的檢出限為9μg/100g，定量限為24μg/100g；維生素D的檢出限為1.92μg/100g，定量限為4.8μg/100g；各生育酚的檢出限為0.24mg/100g，定量限為0.60mg/100g。6T