DB15-T 3534-2024 籽用西葫蘆葉片三種病毒R-T-PCR檢測技術(shù)規(guī)程_第1頁
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15I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：王萍、龍建國、劉杰才、陳貴華、蘇1籽用西葫蘆葉片三種病毒RT-PCR檢測技術(shù)規(guī)程本文件適用于籽用西葫蘆葉片中黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvi3.1屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒（Cu為葉片斑駁花葉，葉肉淺綠，葉脈深綠；嚴(yán)重時呈現(xiàn)葉片皺縮，葉肉退化，蕨葉等3.2西瓜花葉病毒W(wǎng)atermelonmosa3.3小西葫蘆黃化花葉病毒Zucchiniyellow2RemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒、pMD18-T載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：可以清楚區(qū)分100bp～500bp的D4.2溶液配制AGACGTGGGAATGCGTTGGT4.2.9ZYMV病毒檢測上游引物ZYMV-F:5’-ATGCAGAGGCACCATACAT-3’，下游引物ZYMV-R:5’-分析天平、組織研磨儀、PCR擴(kuò)增儀、電泳槽、電泳儀等電泳裝置、Nanodrop微量分光光度計、凝通過RT-PCR擴(kuò)增明確不含有CMV、WMV、ZYMV的樣品為陰性38.2RNA提取和質(zhì)量檢測8.2.2RNA濃度檢測：提取的樣品總RNA用Nanodrop微量分光光度計測定RNA相對濃度，當(dāng)OD260/OD2808.3反轉(zhuǎn)錄48.5.2電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，置于凝膠成像儀上成像，進(jìn)行結(jié)8.6測序驗(yàn)證PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化目的片段，并在4℃連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)病毒序列(參見附錄A)比對，確定PCR擴(kuò)增的DNA片段是否為目的DN測。當(dāng)結(jié)果有效時，試樣檢測出目標(biāo)條帶判定為病5注1：序列方向?yàn)?’-3’。注2：5’下劃線為PCR上游引物序列，3’下劃線為PCR下游引物6

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