病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)概述免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

概述

免疫熒光技術(shù)(immunofluorescencetechnique)和免疫組織化學(xué)技術(shù)相類似,也是把組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)結(jié)合起來的一門技術(shù),利用免疫學(xué)反應(yīng)在組織切片或細(xì)胞涂片上原位顯示組織細(xì)胞中的抗原以及抗原的分布和含量,以了解相關(guān)抗原在組織和細(xì)胞中的變化及其意義。

所不同的是免疫熒光染色技術(shù)所用的抗體標(biāo)記物是熒光素而不是酶,不需要顯色劑和顯色反應(yīng),通過激發(fā)抗原-抗體結(jié)合物上結(jié)合的熒光素發(fā)出可見熒光,用熒光顯微鏡觀察這些可見熒光來確定是否有抗原表達(dá)。眼睛在暗視場觀察抗原部位發(fā)出的熒光比在明視場觀察陽性結(jié)果的顏色要敏感。免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

用熒光抗體檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標(biāo)記物檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)染色方法有直接法、間接法、補(bǔ)體法、雙重?zé)晒鈽?biāo)記法。直接法是免疫熒光組化技術(shù)最簡單和基本的方法。把熒光抗體(或抗原)滴加于待檢標(biāo)本片上,直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原(或抗體)結(jié)合,洗滌后在熒光顯微鏡下即可見抗原(或抗體)存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法常用于細(xì)菌、病毒等的快速檢查和淋巴細(xì)胞表面抗原與受體的鑒定。其缺點是敏感性較差。間接法用已知抗體檢測未知抗原時,先用特異性抗體(第一抗體,簡稱“一抗”)與相應(yīng)抗原結(jié)合,再用熒光素標(biāo)記的抗特異性抗體(第二抗體,簡稱“二抗”)與特異性抗體結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。用已知抗原檢測未知抗體時,先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng),再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合,抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間。補(bǔ)體法直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法間接檢查組織內(nèi)抗原法討論免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的概念。免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)的分類。病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備

一、組織切片

（一）組織及組織切片的保存用直接法進(jìn)行免疫熒光染色的組織切片通常為冷凍切片,因此,組織不需要固定,組織離體后應(yīng)該馬上取材,用低溫恒冷切片機(jī)切片,組織如果不馬上進(jìn)行冷凍切片,或冷凍切片后不馬上染色,應(yīng)將組織或冷凍切片放-30℃冰箱保存,如果保存時間超過1天,最好放-80℃冰箱保存。在冰箱保存時,應(yīng)將組織或冷凍切片密封,防止干涸。在免疫熒光染色間接法中,組織切片可以用冷凍切片,也可以用石蠟切片。

一、組織切片（二）組織切片厚度的要求組織切片的厚度為4~5um；腎穿刺組織切片要薄,3~4um。切片太厚,除了在染色過程中容易脫片和細(xì)胞重疊影響觀察診斷外,還會造成激發(fā)光過多消耗在標(biāo)本下面,標(biāo)本上面照射不足等,造成上下不均勻的現(xiàn)象。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備二、組織細(xì)胞固定作冷凍切片的組織不用固定,經(jīng)冷凍切片后切片用冷丙酮(4℃)固定10分鐘；細(xì)胞涂片固定和冷凍切片固定相同。石蠟切片組織固定與免疫組化染色相同。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備三、玻片選擇常用的普通玻片或多或少都會產(chǎn)生自發(fā)熒光,如果玻片清洗干凈,影響不會很大。理想的是選用專用的無熒光載玻片和干涉蓋玻片,干涉蓋玻片的作用是選擇性讓熒光通過,避免其他光通過干擾熒光圖像。切片時應(yīng)貼在硅化或涂膠玻片上,防止染色時脫片。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備四、緩沖液選擇在免疫熒光染色中,最常用、配制簡單的首選緩沖液是pH7.4的磷酸鹽生理鹽水緩沖液PBS,用于稀釋抗體和浸洗切片；最好選用與抗體同一生產(chǎn)廠生產(chǎn)的抗體稀釋液稀釋抗體。五、實驗對照設(shè)立

與免疫組化染色相同。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備六、抗原修復(fù)

用冷凍切片進(jìn)行免疫熒光直接法染色一般不需要行抗原修復(fù)處理。如果是石蠟切片用間接法進(jìn)行免疫熒光染色,是否行抗原修復(fù),則按照每一種不同的抗體說明書要求來進(jìn)行，井非所有的抗體染色前都需要進(jìn)行抗原修復(fù)。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備七、血清封閉

直接法染色一般不需用血清封閉；間接法染色時,需要根據(jù)二抗的種類選擇相應(yīng)的正常非免疫血清封閉組織。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備八、抗體選擇

熒光素標(biāo)記的二抗大多是含單一種動物的兔疫球蛋白,或鼠或兔或羊,因此,需要根據(jù)一抗的動物源性來選擇相應(yīng)的二抗配套使用,如選擇不對,則抗體連接不上,染色就失敗。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備九、組織背景復(fù)染免疫熒光染色后一般不需要行組織背景的復(fù)染。如果FITC標(biāo)記抗體染色有非特異性熒光背景染色,可用伊文思藍(lán)試劑作復(fù)染,背景呈紅色熒光。伊文思藍(lán)復(fù)染適用于結(jié)果為亮黃綠色熒光的FITC標(biāo)記抗體的染色,而不適合結(jié)果為橙紅色熒光的TRITC標(biāo)記抗體的染色。伊文思藍(lán)復(fù)染是在抗體孵育經(jīng)PBS洗后進(jìn)行,復(fù)染后再經(jīng)PBS洗,然后封片。伊文思藍(lán)試劑的配制：伊文思藍(lán)(evansblue)0.01g0.01mol/LPBS(pH7.4)100ml

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備十、封片與封片劑切片染色后不需要脫水透明,可以直接用緩沖甘油封片劑封片。最好選用商品化的專用熒光染色封片膠,可避免封片劑內(nèi)自發(fā)熒光的干擾。緩沖甘油的配制：1.0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0)Na2CO30.53gNaHCO33.78gH2O100ml必要時用1mol/LHCl或1mol/LNaOH調(diào)至pH9.0。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備十、封片與封片劑2.緩沖甘油0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0)1份甘油(丙三醇)9份用FITC標(biāo)記抗體時,常用0.5mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0)來溶解熒光素和稀釋抗體,FITC在pH8.5~9.5的堿性環(huán)境下發(fā)出熒光效果最好,所以一般用碳酸鹽緩沖液(pH9.0)來配制緩沖甘油,也可以用0.01mol/LPBS(pH7.4)配制。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備十一、標(biāo)本保存經(jīng)免疫熒光染色后應(yīng)及時觀察,否則熒光會慢慢減弱,如果不馬上觀察,染色片應(yīng)放冰箱(低溫、暗處)保存,可延緩熒光衰減。

免疫熒光技術(shù)操作準(zhǔn)備病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光染色方法及操作免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

免疫熒光染色方法及操作

一、免疫熒光染色方法(一)直接法用熒光素標(biāo)記的一抗直接與組織細(xì)胞特異性結(jié)合，即可在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，直接法中只有抗原抗體特異性結(jié)合，沒有連接其他抗體，所以特異性極高，非特異性染色少。但由于沒有將抗原一抗體結(jié)合物放大，所以敏感性不及間接法。

免疫熒光染色方法及操作(一)直接法將抗體標(biāo)記上熒光素→熒光抗體與組織細(xì)胞抗原結(jié)合→形成有熒光素的抗原-抗體結(jié)合物→激發(fā)光(紫外光)照射,熒光素發(fā)出可見熒光→熒光顯微鏡觀察。1.特點

最大的優(yōu)點是操作步驟少,染色快速,幾乎沒有非特異性背景染色;缺點是抗體種類不多。目前熒光一抗主要用于腎穿刺和皮膚的病理診斷,多數(shù)是兔源抗體,標(biāo)記FITC。2.檢測試劑盒

不需檢測試劑盒,只需要選擇目的熒光標(biāo)記的一抗。免疫熒光染色方法及操作3.染色步驟(1)冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗,PBS洗。(2)滴加熒光標(biāo)記一抗工作液孵育45分鐘,37℃。(3)PBS洗5分鐘,3次。(4)晾干或甩去PBS用緩沖甘油封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果熒光呈明暗不一的亮黃綠色(FITC標(biāo)記抗體)或橙紅色(TRITC標(biāo)記抗體)。免疫熒光染色方法及操作(二)間接法先用目的一抗與抗原特異性結(jié)合,再加入熒光素標(biāo)記的二抗與一抗連接,然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法中加入二抗,將抗原-抗體結(jié)合物進(jìn)一步放大,所以敏感性較高。將第二抗體標(biāo)記上熒光素→第一抗體與組織抗原結(jié)合→第二抗體與第一抗體結(jié)合→形成有熒光素的抗原-抗體結(jié)合物→激發(fā)光(紫外光)照射熒光素發(fā)出可見熒光→熒光顯微鏡觀察。免疫熒光染色方法及操作1.特點在染色中加入熒光素標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合,使抗原一抗體結(jié)合物不斷放大，敏感性較高。一抗不需標(biāo)記熒光素,和兔疫組化染色一樣可選擇的一抗種類多,用一個檢測試劑盒就可以分別檢測各種抗原。間接法除了用冷凍切片外,還可以用石蠟切片。2.測試劑盒沒有專門做免疫熒光染色的檢測試劑盒,通常是根據(jù)所用的一抗選擇單一的熒光素標(biāo)記二抗。目前可供選擇的主要有標(biāo)記FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及TRITO標(biāo)記的抗兔和抗鼠二抗,必要時還可以選擇非免疫正常血清,可供選擇的封閉用正常血清有羊、兔和馬血清。免疫熒光染色方法及操作3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水,冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)必要時進(jìn)行正常血清封閉10分鐘,甩去血清,不洗。(4)滴加一抗工作液孵育30~60分鐘,37℃；或孵育過夜(約16小時),4℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加熒光素標(biāo)記二抗孵育30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)晾干或甩去PBS用緩沖甘油封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果熒光呈明暗不一的亮黃綠色(FITC標(biāo)記二抗)或橙紅色(TRITC標(biāo)記二抗)。三、免疫熒光染色質(zhì)量控制免疫熒光染色質(zhì)量控制與免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量控制基本相同。此外,免疫熒光染色后,染色片放置時間長熒光會慢慢衰減,因此,應(yīng)及時觀察,否則熒光衰減會導(dǎo)致陽性強(qiáng)度的錯誤判斷或出現(xiàn)假陰性。觀察時,光源長時間照射標(biāo)本,會加快熒光淬滅,應(yīng)避免長時間觀察同一標(biāo)本。如果用石蠟切片行免疫熒光染色,則必須徹底脫蠟,否則石蠟會有青色熒光發(fā)出,影響觀察。免疫熒光染色方法及操作病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)熒光素標(biāo)記的抗體免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

熒光素標(biāo)記的抗體

一、抗體的標(biāo)記熒光素異硫氰酸熒光素和四甲基異硫氰酸羅丹明B均含有硫碳胺鍵(一NCS),在標(biāo)記抗體時硫碳胺鍵與抗體蛋白的氨基(一NH2)結(jié)合,形成較為牢固和穩(wěn)定的熒光素-蛋白質(zhì)結(jié)合物(熒光抗體)。

免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

熒光素標(biāo)記的抗體

一、抗體的標(biāo)記一個抗體免疫球蛋白分子可與3~8個分子的FITC結(jié)合,在臨床病理診斷中,主要使用商品化的熒光抗體。

熒光素標(biāo)記的抗體二、標(biāo)記抗體的類型熒光素可以標(biāo)記一抗,也有標(biāo)記二抗,商品化的熒光一抗的抗體標(biāo)記熒光素主要是FITC,大都是用于腎臟和皮膚組織病理診斷的兔多克隆抗體。標(biāo)記一抗用于直接法熒光素標(biāo)記的抗體二、標(biāo)記抗體的類型

標(biāo)記二抗抗體的熒光素有FITC和TRITC,所標(biāo)記的二抗有抗鼠lg和抗兔Ig兩種,與鼠源和兔源一抗配套使用。熒光素標(biāo)記二抗用于間接法熒光素標(biāo)記的抗體利用兩種熒光素FITC和TRITC發(fā)出兩種不同顏色的熒光(黃綠色和橙紅色),可配合使用進(jìn)行免疫熒光雙重染色。討論熒光素標(biāo)記抗體的類型及應(yīng)用？病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)熒光顯微鏡免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

熒光顯微鏡

免疫熒光染色后,染色結(jié)果需要通過熒光顯微鏡觀察來進(jìn)行病理診斷。熒光顯微鏡是免疫熒光技術(shù)中重要的工具,光源給出特定波長的激發(fā)光激發(fā)標(biāo)本發(fā)出熒光,通過物鏡和目鏡觀察組織細(xì)胞中的熒光圖像。激發(fā)濾片是熒光顯微鏡的重要部件,不同的激發(fā)濾片可讓不同范圍波長的激發(fā)光通過,所以選擇不同的激發(fā)濾片可獲得一定波長范圍的激發(fā)光。

免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

熒光顯微鏡

因此,需要根據(jù)抗體所標(biāo)記的熒光素來選擇合適的激發(fā)濾片,以獲得合適的激發(fā)光。顯微鏡的分辨率與光源波長的長短成反比,熒光顯微鏡光源為紫外光的波長比可見光短,所以比普通光學(xué)顯微鏡分辨率高。

一、激發(fā)濾片的選擇熒光顯微鏡

一般的熒光顯微鏡配有紫外、藍(lán)色、綠色和紫色激發(fā)熒光濾光片組。激發(fā)濾片也有厚、薄兩種,厚激發(fā)濾片可使熒光顯微鏡觀察視場為暗視場,薄激發(fā)濾片為較明亮視場。激發(fā)濾片的選擇要使熒光明亮而背景適中,背景太亮,會影響熒光的觀察；背景太暗,則看不到組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。一、激發(fā)濾片的選擇熒光顯微鏡

1.UV激發(fā)濾片通過的激發(fā)光波波長為330~400nm。2.V激發(fā)濾片通過的激發(fā)光波波長為395~415nm。3.B激發(fā)濾片通過的激發(fā)光波波長為420~485nm,主要用于FICT熒光素標(biāo)本的觀察。一、激發(fā)濾片的選擇熒光顯微鏡

4.G激發(fā)濾片通過的激發(fā)光波波長為460~550nm,主要用于TRICT熒光素標(biāo)本的觀察。由于FITC和TRITC為最常用的抗體標(biāo)記熒光素,所以,一些牌子的顯微鏡專門生產(chǎn)配套有FITC專用激發(fā)濾板如KP490濾板和TRITO專用激發(fā)濾板如S546濾板。二、熒光顯微鏡的使用1.要提前打開熒光顯微鏡電源,超壓汞燈開啟15分鐘后光源穩(wěn)定,適合觀察。開啟光源后每次使用不超過2小時,超過2小時光亮強(qiáng)度逐漸下降,觀察到的熒光也會變?nèi)酢ｊP(guān)閉光源后需要等燈泡冷卻后才能再次開啟,否則影響燈泡壽命。熒光顯微鏡二、熒光顯微鏡的使用2.熒光顯微鏡應(yīng)安裝紫外光擋板或在觀察時戴上防護(hù)眼鏡,防止紫外光損害眼睛。3.用高倍油鏡觀察時,應(yīng)選用無熒光鏡油,避免非特異性熒光干擾。4.拍攝熒光圖像時,應(yīng)選用較高的lSO感光度模式。熒光顯微鏡病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)熒光與熒光素免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

熒光與熒光素

在免疫熒光技術(shù)中,熒光顯微鏡電光源發(fā)出激發(fā)光,將標(biāo)記在抗體上的熒光素激發(fā)出熒光,通過熒光顯微鏡觀察熒光圖像。

熒光與熒光素

一、熒光在一定波長的光如紫外光等照射后,某些物質(zhì)吸收照射光后被激發(fā)出的比照射光波長更長的可見光,稱為熒光(fluorescence)。熒光壽命很短,一般約為10-9~10-8秒,所以當(dāng)紫外光停止照射后熒光便馬上消失,但這種消失并非為熒光淬滅現(xiàn)象。熒光與熒光素

一、熒光熒光淬滅是指標(biāo)記了抗體的熒光素或與組織細(xì)胞結(jié)合的熒光染料,在染色過程中與各種試劑的作用,長時間保存尤其是在高溫環(huán)境或經(jīng)過長時間紫外光照射后,使熒光素被激發(fā)出熒光的能力減弱,甚至消失。因此,免疫熒光染色結(jié)果難以長時間保存。熒光與熒光素

熒光可分為以下兩種:（一）誘發(fā)熒光一些物質(zhì)本身不能發(fā)出熒光，但經(jīng)過標(biāo)記熒光素或經(jīng)熒光染料染色后,經(jīng)過紫外光照射激發(fā)熒光素或經(jīng)熒光染料發(fā)出的熒光稱為誘發(fā)熒光。經(jīng)免疫熒光染色后觀察到的組織細(xì)胞中的熒光屬于誘發(fā)熒光。（二）自發(fā)熒光一些物質(zhì)如血紅蛋白等本身在紫外光照射后,能發(fā)出熒光,這種熒光稱為自發(fā)熒光。自發(fā)熒光相對較弱,但也是造成免疫熒光非特異性染色的原因之一。二、激發(fā)光激發(fā)光是由熒光顯微鏡光源發(fā)出,激發(fā)引起熒光最有效的是波長較短的緊外光和藍(lán)紫光,而熒光的亮度與光源發(fā)出的激發(fā)光強(qiáng)度成正比。因此,熒光顯微鏡所用的激發(fā)光源要求強(qiáng)度大,常用高壓汞弧燈或高壓氙弧燈為激發(fā)光源,用激光作為激發(fā)光源,可獲得更加明亮的熒光,如使FITC發(fā)出的熒光比汞弧燈強(qiáng)上百倍。熒光與熒光素

三、熒光素

能吸收一定波長的光(如紫外光)的照射光后,被激發(fā)出可見光的物質(zhì)稱為熒光素(fluorescein)。許多物質(zhì)都能產(chǎn)生熒光,但在免疫熒光技術(shù)可用做熒光素的物質(zhì)需要滿足以下要求:1.性質(zhì)穩(wěn)定,安全無毒性。2.能與抗體蛋白牢固結(jié)合。3.標(biāo)記抗體后不影響抗體的活性。4.標(biāo)記抗體簡單,方便。5.被激發(fā)出的熒光鮮艷,明亮。6.標(biāo)記抗體后,熒光淬滅緩慢。熒光與熒光素

用于標(biāo)記抗體的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)、四乙基羅丹明(RB200)和某些鑭系螯合物(如3價稀上鑭系元素銪和鋱)等,常用的有以下兩種：1.異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)能與各種抗原蛋白結(jié)合,不影響結(jié)合后的抗體與抗原結(jié)合的特異性。被波長為490~495nm的激發(fā)光激發(fā),發(fā)出的熒光呈明亮的黃綠色,由于人眼觀察黃綠色較敏感、舒適,所以是最常用的熒光素。熒光與熒光素

2.四甲基異硫氰酸羅丹明B(tetramethylrhodamineBisothiocyanate,TRITC)為熒光染料,也用于標(biāo)記抗體。波長為550nm的激發(fā)光激發(fā),發(fā)出的熒光呈橙紅色熒光。熒光沒有黃綠色明亮,但熒光淬滅較緩慢。熒光與熒光素

病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)概述免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

概述

臨床病理診斷中應(yīng)用的免疫組織化學(xué)技術(shù)主要是免疫酶組織化學(xué)技術(shù),首先用或熒光素標(biāo)記特異性第一抗體(一抗)或連接抗體(二抗或三抗),然后使這些抗體與組織細(xì)胞中相應(yīng)的抗原或抗原抗體結(jié)合物結(jié)合,再通過酶參與顯色劑的化學(xué)反應(yīng)或激發(fā)熒光素而使抗原-抗體結(jié)合物呈色,在顯微鏡下可觀察到這些呈色,從而能在組織切片或細(xì)胞涂片中檢測組織細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的抗原。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

一、抗體標(biāo)記酶及其性質(zhì)免疫酶組織化學(xué)技術(shù)中酶標(biāo)抗體就是將特定的酶與抗體穩(wěn)定的結(jié)合,酶標(biāo)記的抗體有特異性第一抗體,更多的是標(biāo)記第二抗體或第三抗體。理論上選擇標(biāo)記抗體的酶時應(yīng)考慮組織細(xì)胞中最好不存在相同或同類型的內(nèi)源性酶,但實際中并非如此,這需要在免疫組化染色中采取一些措施避免這些內(nèi)源性酶的干擾。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

用于標(biāo)記抗體的酶有很多,一般要符合以下要求:1.分子量不大,容易獲得,是商品化的試劑。2.能夠與抗體牢固結(jié)合,結(jié)合后不容易解離,而且與抗體結(jié)合后不會抑制抗體的活性。3.催化的底物是容易獲得和保存的試劑。4.催化底物發(fā)生反應(yīng)所形成的反應(yīng)物必須具有一定的顏色,該顏色越鮮艷、越深越好，容易被觀察到；反應(yīng)物要穩(wěn)定,不容易褪色或被染色所顯示出來的物質(zhì)要具有穩(wěn)定性,盡可能不被制片過程中所用的化學(xué)試劑和封片劑等溶解,不會在反應(yīng)部位向周圍擴(kuò)散。

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

二、常用的抗體標(biāo)記酶

1.辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)屬于過氧化物酶類的酶,來源于深根性植物辣根。由于辣根過氧化物酶存在于植物,具有活性高、分子量小、穩(wěn)定和純酶容制備出高純度酶的特點,所以在免疫組化技術(shù)中最常用于標(biāo)記抗體。但是辣根過氧化物酶和存在于人體和動物的其他過氧化物酶一樣具有相同催化某些化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì),而且這些過氧化物酶能耐受甲醛固定、乙醇和二甲苯以及石蠟的浸泡,在石蠟切片中酶的活性依然很高。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

二、常用的抗體標(biāo)記酶

1.辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)因此,辣根過氧化物酶的催化反應(yīng)會受到人體或動物中存在的內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。內(nèi)源性過氧化物酶主要存在于血細(xì)胞、甲狀腺、乳腺和唾液腺等。氰化物可抑制過氧化物酶的活性。利用過氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

二、常用的抗體標(biāo)記酶

2.堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP,ALP,AP)屬于水解酶類的酶,容易分離純化穩(wěn)定。在免疫組化技術(shù)中常用于標(biāo)記抗體。廣泛存在于人體和動物的組織中,常見于具有活躍運轉(zhuǎn)功能的細(xì)胞中,如毛細(xì)血管內(nèi)皮、肝、骨骼、腎皮質(zhì)和腎上腺等。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

二、常用的抗體標(biāo)記酶

2.堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP,ALP,AP)因此,堿性磷酸酶的催化反應(yīng)會受到人體或動物中存在的內(nèi)源性堿性磷酸酶的干擾。在石蠟切片制片過程中,受各種因素影響,酶將部分或全部失去活性。氰化物、砷酸鹽、左旋咪唑等可作為堿性磷酸酶的抑制劑。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)—概述

辣根過氧化物酶HRP堿性磷酸酶AP常用的抗體標(biāo)記酶病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備免疫酶組織化學(xué)技術(shù)染色操作與常規(guī)的制片技術(shù)有許多相同之處,但在操作上也有其特殊性。免疫組化染色操作包括組織切片制備的各個環(huán)節(jié)都會成為影響免疫組化染色結(jié)果的因素。這些環(huán)節(jié)不管哪一個出現(xiàn)失誤都會影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性,從而可能影響病理診斷的準(zhǔn)確性。因此,在免疫組化技術(shù)中作好前期準(zhǔn)備工作,并進(jìn)行規(guī)范操作和質(zhì)量控制極其重要。

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—步驟一、檢測標(biāo)本選擇二、組織固定三、組織石蠟切片制備四、載玻片處理五、組織切片六、緩沖液的應(yīng)用七、抗原修復(fù)八、內(nèi)源性酶消除九、內(nèi)源性生物素消除十、內(nèi)源性色素消除免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—步驟十一、實驗對照設(shè)立十二、血清封閉十三、抗體使用十四、顯色與顯色劑十五、背景復(fù)染與復(fù)染試劑十六、封片與封片劑十七、染色結(jié)果的觀察免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—顯色機(jī)制1.辣根過氧化物酶是一種過氧化物酶，能催化多種物質(zhì)被過氧化氫氧化。DAB的顯色反應(yīng)是在HRP的催化下,H2O2將DAB氧化成還原型的DAB,還原型的DAB呈棕色的不溶性沉淀(圖4-1)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—顯色機(jī)制2.堿性磷酸酶是一種水解酶,可催化水解萘酚磷酸酯釋放出萘酚和重氮鹽偶聯(lián)而顯色。固藍(lán)/固紅的顯色反應(yīng)是在AP的催化下,萘酚AS-MX磷酸酯被水解為萘酚,萘酚和固藍(lán)/固紅起偶聯(lián)反應(yīng),在AP的活性部位形成藍(lán)色/紅色的不溶性沉淀(圖4-2)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—顯色機(jī)制選用不同的顯色劑需要配套使用不同的酶標(biāo)抗體檢測試劑盒,不同的顯色劑可呈不同的顏色(表4-1)。免疫組化檢測試劑盒標(biāo)識是LSAB/HRP/Rabbit,表示LSAB法，抗體標(biāo)記酶是辣根過氧化物酶，二抗為兔免疫球蛋白，用于檢測兔單抗或兔多抗的第一抗體；EnVision/AP/Mouse則表示EnVision法，抗體標(biāo)記酶是堿性磷酸酶，二抗為鼠免疫球蛋白，用于檢測鼠單抗的第一抗體。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)操作準(zhǔn)備—顯色機(jī)制合理選用酶標(biāo)抗體檢測系統(tǒng)和顯色劑，可進(jìn)行多重免疫組化染色,在同一切片上清晰地顯示組織細(xì)胞中多種抗原呈多種不同顏色的表達(dá)。如圖4-3示DAB顯色,結(jié)果呈棕色；如圖4-4示AEC和固藍(lán)顯色,結(jié)果分別為紅色和藍(lán)色；如圖4-5示DAB、固藍(lán)和固紅顯色結(jié)果分別為棕色、藍(lán)色和紅色。病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)染色方法及操作免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)染色方法及操作

免疫組化染色方法有多種,臨床病理診斷要求使用敏感性高和特異性強(qiáng)的免疫組化技術(shù)方法。近年來,由于抗體制備技術(shù)不斷地改進(jìn)和提高,不同公司生產(chǎn)的檢測試劑盒,在特異性和敏感性方面各有特點,各實驗室可以根據(jù)自己的實際情況,合理選用。

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法

（一）EnVision法1.特點EnVision法為采用聚合物技術(shù)的二步法,是非生物素檢測系統(tǒng),可避免內(nèi)源性生物素干擾,不需要進(jìn)行封閉內(nèi)源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封閉,具有敏感性高,操作簡便和非特異性染色少的優(yōu)點,已成為最常用的方法之一(圖49)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒只

有EnVision/HRP/抗鼠/抗兔二抗工作液。不同編號的試劑盒有所不同，有的還配有過氧化物酶阻斷劑和顯色劑。也可選擇EnVision/AP/抗鼠/抗兔二抗。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)滴加一抗工作液,孵育30~60分鐘,37℃；或孵育過夜(約16小時),4℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗,孵育10~30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(9)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細(xì)胞核3~5分钅鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(10)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法LSAB(S-P)法1.特點LSAB法采用鏈菌抗生物素蛋白-生物素技術(shù),其中鏈菌抗生物素蛋白與生物素具有很強(qiáng)的親和力,三步法染色,加入的二抗和三抗可將抗原-抗體結(jié)合物不斷放大,敏感性較高。高純化的抗體技術(shù),使背景更加清晰。為含生物素檢測系統(tǒng),需注意封閉內(nèi)源性生物素。二抗含有抗鼠、抗兔和抗羊免疫球蛋白,適用于與鼠抗、兔抗和羊抗等一抗配套使用。價格較便宜(圖4-10)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒

包含生物素標(biāo)記的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白(biotin-mouse/rabbit/goatlgG)工作液,標(biāo)記HRP的鏈菌抗生物素蛋白(streptavidin/HRP)工作液。不同編號的試劑盒有所不同,有的還配有過氧化物酶阻斷劑和顯色劑。也可選擇標(biāo)記AP的鏈菌抗生物素蛋白(streptavidin/AP)。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)正常血清封閉后直接滴加一抗工作液,孵育30~60分鐘:或孵育過夜(約16小時)。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加鼠/兔/羊二抗,孵育20~30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)滴加鏈菌抗生物素蛋白/HRP(三抗),孵育20~30分鐘,37℃。(9)PBS洗5分鐘,3次。(10)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(11)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細(xì)胞核3~5分鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(12)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法(三)EPOs法1.特點EPOS法采用聚合物技術(shù)的一步法,敏感性高。一抗不含生物素,可避免內(nèi)源性生物素干擾,不需要進(jìn)行封閉內(nèi)源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封閉。最大的優(yōu)點是操作步驟少,染色快速,幾乎沒有非特異性背景染色。缺點是抗體種類不多,一抗只有標(biāo)記HRP(圖4-11)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒

不用檢測試劑盒,只需要選用EPOS一抗即可。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)滴加一抗工作液,孵育45分鐘,37℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(7)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細(xì)胞核3~5分鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(8)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---質(zhì)量控制1.組織離體后應(yīng)及時固定,最理想的固定液為10%的中性緩沖甲醛液(pH7.2~7.4)固定時間為4~6小時,不超過24小時。固定不足或過度固定都不利于免疫組化染色。2.石蠟切片脫蠟要徹底,脫蠟不干凈會造成局灶性陽性等染色不均勻的現(xiàn)象,甚至染色失敗。3.是否進(jìn)行抗原修復(fù),可參考一抗說明書或?qū)嶒炇翌A(yù)實驗結(jié)果來定。許多抗原檢測進(jìn)行抗原修復(fù)時,可以用熱處理方法替代蛋白酶消化方法。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原定位發(fā)生改變,即應(yīng)該細(xì)胞質(zhì)陽性的則出現(xiàn)細(xì)胞核陽性等；也會引起假陽性或假陰