高三生物二輪復(fù)習(xí)基因工程及其應(yīng)用解題規(guī)律

江蘇省鎮(zhèn)江第一中學(xué)黃家麗基因工程在近三年高考中的體現(xiàn)202120222023題號13（單選）23非選24非選22非選側(cè)重考查內(nèi)容基因敲除、PCR技術(shù)原理、重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選PCR原理、DNA獲取、重組質(zhì)粒構(gòu)建及驗證、融合蛋白檢測PCR及電泳、重組酶技術(shù)、質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選近三年高考基因工程部分試題都是以真實的科研素材為背景，考查我們對基因工程相關(guān)技術(shù)的理解和掌握，既考查本部分的必備知識，還考查我們從情境背景中提取關(guān)鍵信息、歸納概括的能力，更側(cè)重考查我們的綜合運用能力、信息獲取及分析能力、拓展思維的能力。重點突破1.固定的答題套路（2023高考）對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)，原因是

。（2022高考）PCR擴(kuò)增時，需在

催化下，在引物的

端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測序。（2022高考）采集樣本、提取總RNA，經(jīng)

形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，……（2021高考）提取真菌細(xì)胞

，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)一步獲得基因m片段。（2021高考）為了獲得融合tag

標(biāo)簽的蛋白M，設(shè)計引物P2時，不能包含基因m終止密碼子的編碼序列，否則將導(dǎo)致

。（2021高考）若通過抗原—抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag

標(biāo)簽，說明

，后續(xù)實驗可借助tag

標(biāo)簽進(jìn)行蛋白M的分離純化。電泳只能測定DNA長度，不能確定堿基序列TaqDNA聚合酶3′逆轉(zhuǎn)錄蛋白M上不含tag標(biāo)簽RNA融合基因表達(dá)重點突破1.固定的答題套路（24.3南京鹽城二模）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增H基因，需根據(jù)H基因設(shè)計兩種引物，引物的作用有___________(填字母)。A.為Taq酶提供結(jié)合位點 B.決定擴(kuò)增產(chǎn)物大小C.決定反應(yīng)的特異性 D.決定變性時間（24.3南京鹽城二模）獲得H基因產(chǎn)物后需要進(jìn)行凝膠電泳，將符合要求的條帶____________以便提取純化并進(jìn)行測序。（24.3鎮(zhèn)江期初）RCA反應(yīng)體系中需添加多種物質(zhì)，除圖1所示物質(zhì)外，還應(yīng)添加的物質(zhì)是

。RCA產(chǎn)生長重復(fù)單鏈DNA過程中，Phi29DNA聚合酶既需催化

鍵的形成，也需催化

鍵的斷裂。（24.2連云港期初）構(gòu)建表達(dá)載體時，科研人員需要根據(jù)______________________設(shè)計表達(dá)載體中的cDNA序列切割回收ABC脫氧核苷酸（dNTP）磷酸二酯氫目的基因（PRRSV）序列

重點突破1.固定的答題套路（24.2宿遷期初）目的基因獲取，在低溫條件下，提取先期抽苔萵苣細(xì)胞中________，經(jīng)________獲得cDNA，再以cDNA為模版，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LsE3基因。PCR擴(kuò)增除了圖1標(biāo)出的物質(zhì)（模板和引物）以外，還需加入_______________________________________________(至少寫兩種)。（24.2泰州期初）利用上述引物對SOAT1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該實驗設(shè)計的擴(kuò)增程序中熱循環(huán)次數(shù)為30次，一般PCR反應(yīng)中設(shè)計的熱循環(huán)次數(shù)不超過40次，原因是______________________________________________。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠________后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。（24.1常州期末）圖中PCR反應(yīng)體系進(jìn)行時，除需要加入引物F和引物R、原始質(zhì)粒、緩沖液外，還需加入的物質(zhì)有___________________________?？俁NA40次循環(huán)后可能出現(xiàn)大量非特異性產(chǎn)物電泳逆轉(zhuǎn)錄TaqDNA聚合酶、緩沖液、dNTP、Mg2＋

dNTP、TaqDNA聚合酶重點突破1.固定的答題套路（24.1常州期末）圖中的DH5α細(xì)胞是處于________的大腸桿菌，對帶缺刻突變質(zhì)粒進(jìn)行修復(fù)時需要添加_______________酶。（24.1蘇州期末）質(zhì)粒中啟動子的作用是______________________________。

將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠____________。（24.1無錫期末）將S基因和TAP序列的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行___________________鑒定，結(jié)果顯示兩個片段均得到擴(kuò)增且與預(yù)期值大小相一致。再經(jīng)測序證實正確后，將這兩個片段經(jīng)________________酶連接定向克隆入質(zhì)粒pcDNA3.1。（24.1揚州期末）PCR反應(yīng)體系中需加入模板、_________、________________、引物、Mg2＋、緩沖液等，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行______________來確定可用于導(dǎo)入酵母菌的重組質(zhì)粒。感受態(tài)DNA連接酶(與RNA聚合酶結(jié)合)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA受精卵瓊脂糖凝膠電脈

(T4)DNA連接TaqDNA聚合酶dNTP電泳(或測序)

重點突破引物設(shè)計2.核心考查內(nèi)容①引物是什么?②為什么要設(shè)計引物？③引物的作用？④引物的設(shè)計原則？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸（P77）DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3′端開始延伸DNA鏈(P72)使DNA聚合酶能夠從引物的3‘端開始連接脫氧核苷酸（P77）引物的長度一般在20~30bp，否則會影響擴(kuò)增的特異性；設(shè)計兩種引物時,二者之間的堿基序列不能互補(bǔ)配對；一種引物自身不能有較多自身互補(bǔ)序列或反向重復(fù)序列；引物設(shè)計應(yīng)具有特異性（針對核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計）；引物中GC含量以40%~60%為宜，4種堿基最好隨機(jī)分布…...盡管有很多因素可影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的效率與特異性，但最關(guān)鍵的因素是引物的設(shè)計。重點突破2.核心考查內(nèi)容—引物設(shè)計⑤為了便于將擴(kuò)增的DNA片段與載體連接,設(shè)計引物時可如何操作？⑥在兩種引物上設(shè)計加入不同的限制酶識別序列,主要目的是？⑦引物的3’端和5’端哪個能改造？⑧一次成功的DNA片段擴(kuò)增應(yīng)該產(chǎn)生與預(yù)期大小一致的DNA片段。若出現(xiàn)與預(yù)期不一致的結(jié)果，其原因可能為？在引物的5’端

加上限制酶識別序列（同源序列）使目的基因定向插入載體，避免目的基因自身環(huán)化及與載體反向連接引物的3’端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基,一般不能改造，5‘端可添加限制酶切割位點等序列未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因：TaqDNA聚合酶的抑制劑；TaqDNA聚合酶失活；引物設(shè)計不合理；Mg2+濃度過低；變性溫度低，變性時間短；等等。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的原因：模板DNA出現(xiàn)污染；引物特異性不強(qiáng)，如與非目的序列有同源性；Mg2+濃度過高；退火溫度過低；PCR循環(huán)次數(shù)過多；等等。變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—引物設(shè)計例1（2024.2泰州期初）根據(jù)SOAT1的編碼序列設(shè)計的兩個引物如下圖1。引物F加入的EcoRⅠ酶切位點位于________端，引物R上添加的XhoⅠ酶識別的回文序列的6個堿基是________________________________________。F:5′—CGGAATTCATGAAGGAAGTTGGCAGTC—3′R：5′—CCGCTCGAGCTAAAACACGTAACGACAAG—3′圖1

CTCGAG(或5′—CTCGAG—3′)

5′變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—引物設(shè)計例2（24.2宿遷期初）

LsE3基因兩端序列如圖1所示，PCR中需要兩種引物F(左側(cè))、R(右側(cè))選用________(選項中為引物部分序列，方向為5′→3′)。A.GATTAG……TGTTGG

B.CCAACA……CTAATCC.TAGGTG……AGACCT

D.AGGTCT……CACCTAAC

重點突破限制酶選擇2.核心考查內(nèi)容根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點及是否破壞目的基因和標(biāo)記基因等來確定限制酶的種類（1）根據(jù)目的基因確定限制酶應(yīng)選擇位于目的基因兩端的限制酶；不能選擇目的基因內(nèi)部的限制酶。（2）根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶通常選擇與切割目的基因相同的限制酶，確保出現(xiàn)相同的末端；在只有一種標(biāo)記基因時，選擇的限制酶不能破壞標(biāo)記基因。變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—限制酶選擇例3（24.2如皋1.5模）為了使抗蟲基因定向插入質(zhì)粒中，第二次PCR擴(kuò)增時需要在兩個引物5′端分別添加的序列是______________________，不添加在引物3′端的原因是______________________________________________________。引物的3′端與模板鏈嚴(yán)格互補(bǔ)配對，保證子鏈的延伸AAGCTT和GTCGAC變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—限制酶選擇例4（24.2海安期初）為獲得MEL和Ec-cLYZ融合基因，同時兩端帶有pPICZαA的同源序列，過程1PCR反應(yīng)體系中加入的模板是

，引物應(yīng)該選擇以下

(2分)。A.5’-GAAACTGAAGCTCCCGAATTCGGTATTGGTGGT-3’B.5’-CATCATCATCATCCCCGTCGACTTGATGCTGCAAGC-3’C.5’-GGGGATGATGATGATGGAATTCTTGATGCTGCAAGC-3’D.5’-GGGAGCTTCAGTTTCGTCGACGGTATTGGTGGT-3’重組質(zhì)粒1AB重點突破重組質(zhì)粒篩選2.核心考查內(nèi)容類型檢測內(nèi)容方法⑴分子水平的檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR、分子雜交等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)重點突破2.核心考查內(nèi)容—重組質(zhì)粒篩選轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長功能、活性正常提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—重組質(zhì)粒篩選例5（24.2如皋1.5模）培育出的荔枝是否具有抗（蒂蛀）蟲性狀，可采用的鑒定方法是_________________________________________________________________。采摘轉(zhuǎn)基因抗蟲荔枝葉片飼喂蒂蛀蟲，觀察蒂蛀蟲的存活情況例6（24.2泰州期初）將測序正確的重組載體誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行電泳，實驗部分結(jié)果見下圖2，SOAT1重組蛋白的相對分子質(zhì)量為50kD左右，下圖中基本符合要求的條帶包括__________。2、3、5

變式訓(xùn)練2.核心考查內(nèi)容—重組質(zhì)粒篩選例7（24.2海安期初）畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源時需要大量表達(dá)醇氧化(AOX1)，AOX1基因的長度為2200bp。科研人員將蜂毒肽(MEL)與石斑魚c型溶菌酶(Ec-cLYZ)基因插入pPICZαA質(zhì)粒上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入畢赤酵母以獲得高效低毒的廣譜抑菌融合蛋白。為了驗證構(gòu)建是否成功，利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI對提取出的重組質(zhì)粒2進(jìn)行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示分別得到大小約為

(2分，限制酶識別序列不計)的片段。過程3將重組質(zhì)粒2