4香型粳稻分子育種技術規(guī)程本文件規(guī)定了香型粳稻分子育種前的準備和育種程序等。本文件適用于粳稻品種中香味品質(zhì)的改良及攜帶香味基因Badh2的香稻品種的分子標記輔助育種。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15682大米食用品質(zhì)感官評價方法GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測通用要求和定義GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法NY/T83米質(zhì)測定方法NY/T593食用稻品種品質(zhì)NY/T596香稻米DB21/T3079優(yōu)良食味水稻品種（品系）選育技術規(guī)程3術語、定義和縮略語3.1術語和定義GB/T19495.1界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1.1分子育種molecularbreeding指通過分子技術對育種的目標基因和目標性狀進行轉(zhuǎn)移和選擇，進而培育出優(yōu)良的新品種。3.1.2純合個體Homozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個等位基因相同的基因型個體，自交后代不會分離。3.1.3雜合個體heterozygousindividual指同源染色體在同一基因座上的兩個等位基因不同的基因型個體，自交后代產(chǎn)生分離。3.1.4輪回親本recurrentparent指回交育種中用于多次回交的親本。3.1.5供體親本donorparent5指回交育種中提供目標性狀的親本。3.2縮略語Badh2：香味基因（betainealdehydedehydrogenaseaDNA：脫氧核糖核酸(deoxyribonuclcicacid)；PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction)；bp：堿基對(basepair)；4準備4.1設備、試劑和材料樣品DNA提取所需設備、試劑和材料的準備按GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。PCR檢測所需設備、試劑和材料的準備見本文件的附錄A。4.2引物同時使用4條PCR引物，兩條3’末端位于突變位點上的分屬不同基因型的方向相反的內(nèi)引物（引物2和引物3），兩條位于突變位點外側(cè)并與突變位點距離不等的外引物（引物1和引物4）。內(nèi)引物用來檢測等位基因型，外引物在PCR反應中不但作為陽性參照而且和內(nèi)引物分別配對有選擇性地擴增，通過擴增片段大小和有無即可判斷個體的基因型。引物信息見附錄B。5育種程序5.1技術路線技術路線圖見附錄C。5.2親本選擇5.2.1輪回親本選擇當?shù)刎S產(chǎn)性好、抗病性強、抗倒伏、米質(zhì)優(yōu)、綜合性狀較好的品種作為輪回親本（P1)。5.2.2供體親本選擇含有香味基因Badh2的香型優(yōu)質(zhì)水稻品種作為供體親本(P2)。5.3雜交以P1為母本，以P2為父本，去雄授粉按照DB21/T3079規(guī)定執(zhí)行，成熟后雜交粒全部收獲，脫粒、記錄、保存，獲F1代種子。5.4回交6以P1為母本，以F1為父本，人工授粉回交，獲BC1F1代種子。5.5BC1F1香味基因Badh2雜合個體篩選BC1F1一般種植10株以上，單株栽插。5.5.1采樣待植株長至三葉一心時，按單株采取葉片進行樣品制備，樣品編號要與田間單株一一對應。5.5.2DNA提取與純化按照按GB/T19495.3的規(guī)定執(zhí)行。5.5.3PCR擴增具體檢測方法見附錄D。5.5.4分型與結(jié)果判讀電泳圖中擴增產(chǎn)物片段大小為499bp和171bp，判定該品種為香型純合體；擴增產(chǎn)物片段大小為499bp和364bp，則判定該品種為非香型純合體；擴增產(chǎn)物片段大小為499bp、364bp和171bp，則判定該品種為香型雜合體。5.5.5篩選根據(jù)電泳圖中顯示擴增結(jié)果，篩選香味基因Badh2的雜合個體。5.6BC1F1回交以P1為母本，以5.5收獲的香型雜合個體為父本，回交，獲BC2F1代種子。5.7BC2F1自交BC2F1一般種植10株以上，單株栽插，自交，混收，獲BC2F2代種子。5.8BC2F2群體中香味基因純合個體篩選BC2F2一般種植1000株左右，單株栽插，按照5.5中方法采樣、提取DNA、PCR擴增、判讀結(jié)果，利用分子標記輔助選擇技術篩選香味基因Badh2的純合個體，分單株收獲種子形成株系。5.9常規(guī)系選分株系種植BC2F3代，自交獲得BC2F4代，篩選株高、穗型整齊，抽穗期一致，抗性好的株系。5.10米質(zhì)鑒定、抗病鑒定按NY/T83米質(zhì)測定方法測定米質(zhì)性狀，利用谷粒分析儀和食味分析儀測定樣品的食味值，按GB/T15682大米食用品質(zhì)感官評價方法，結(jié)合人工品嘗，確定食味品質(zhì)，按照NY/T596香稻米檢驗方法，選擇香味綜合評分≥60，食味值≥75，粳稻品質(zhì)等級達到NY/T593規(guī)定的三等以上的優(yōu)良品系，在稻瘟病自然發(fā)病嚴重區(qū)進行田間稻瘟病綜合抗性鑒定，篩選出優(yōu)質(zhì)抗病香型粳稻品系。7PCR檢測所需要的設備、試劑的準備A.1設備準備A.1.1PCR儀。A.1.2凝膠成像系統(tǒng)。A.1.3瓊脂糖電泳槽及電泳儀等電泳裝置。A.1.4移液槍和吸頭（200μL和10μL）。A.2試劑和材料準備A.2.12×TaqPCRMasterMix（包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反應緩沖液、PCR反應的增強劑和優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑，濃度為2×。DNA擴增時，只需加入模板，引物和水，使MasterMix溶液的A.2.2DL2000（標準分子量的核酸標記，可以清楚地區(qū)分100bp～1000bp的DNA片段）。A.2.31×TAE緩沖液（1X的電泳緩沖液）。A.2.4Goldenview（核酸染料）。擴增香味基因Badh2的引物表B.1給出了用于本文件規(guī)定的擴增香味基因Badh2的引物。表B.1擴增香味基因Badh2的引物序列(5’-3’)TGTCATCACACCCTGGTGTAGACACCATAGGAGCAGCTGAAATATCTGGTAAAAAGATTATGGCTTCAGCTCAGTTAAGTGCTTTACAAAGTCCC香型粳稻分子育種技術路線圖C.1給出了用于本文件規(guī)定的香型粳稻分子育種技術路線P1×P2P1×F1P1×香味基因雜合的BC1F1個體↓↓?香味基因純合的個體↓?穩(wěn)定株系↓米質(zhì)鑒定、抗病鑒定優(yōu)良品系圖C.1香型粳稻分子育種技術路線注：圖中×表示雜交；?表示自交。（規(guī)范性）PCR擴增步驟D.1PCR反應體系將試樣DNA、2×TaqPCRMasterMix、引物1、引物2、引物3、引物4及ddH2O置于冰上融化。在200μL加蓋無菌離心管中，加入：2×TaqPCRMasterMix引物1(100nM)引物2(100nM)引物3(100nM)引物4(100nM)試樣DNA(50ng/μL)ddH2O0.4μL1.6μL1.6μL0.4μL 用移液槍抽打混勻，蓋上蓋子短暫離心，置于冰上待用。D.2PCR反應程序94℃預變性5min