1牛輪狀病毒腹瀉診斷技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了牛輪狀病毒性腹瀉的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方法、操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛輪狀病毒性腹瀉的診斷、監(jiān)測和檢疫等。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫3縮略語下列縮略語適用于本文件。BRV：牛輪狀病毒（Bovineratovirus）CPE：致細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect）PBS：磷酸鹽緩沖鹽水（PhosphateBufferSaline）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）TCID50：半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）LD50：半數(shù)致死量（MedianLethalDose）MA104細(xì)胞：恒河猴腎細(xì)胞（Rhesuskidneycell）Vero細(xì)胞：非洲綠猴腎細(xì)胞（VerdaRenoCell）MDBK細(xì)胞：牛腎細(xì)胞（MadinDarbyBovineKidneyCell）DMEM：DuLbecco’sModifiedEagleMedium4生物安全措施樣品采集的生物安全措施符合GB/T27401的規(guī)定。樣品處理的生物安全措施符合GB19489的規(guī)定。5病原牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，病毒顆粒無囊膜，近似球形，直徑約70～75nm，具有外、中、內(nèi)三層衣殼，每層均為20面體對稱?；蚪M為線狀雙股RNA。26臨床診斷6.1流行病學(xué)6.1.1傳染源病牛和帶毒牛是本病自然流行的傳染源，隱性感染牛和痊愈?？沙掷m(xù)排毒長達(dá)3周。6.1.2傳播途徑消化道是主要的傳播途徑。6.1.3易感動(dòng)物不同年齡和品種牛均可感染BRV，3周齡內(nèi)牛最易感，多發(fā)生于1周齡內(nèi)的犢牛。6.1.4流行特點(diǎn)有明顯季節(jié)性，多發(fā)生在晚秋、冬季和早春。6.2臨床癥狀犢牛感染后在12～24h引起嚴(yán)重腹瀉，發(fā)病突然，病初表現(xiàn)為精神不振、厭食、嘔吐和腹瀉，體溫正?；蚵愿撸劈S白色、液狀糞便，有時(shí)排出帶有黏液和血液的稀便。病程長者脫水明顯，嚴(yán)重者常有死亡。成年牛多呈隱性感染，并在一定時(shí)間持續(xù)向外界排毒。6.3病理變化牛輪狀病毒感染主要表現(xiàn)在消化道，腸腔內(nèi)充滿凝乳塊和乳汁，小腸腸壁變薄、半透明，腸內(nèi)容物呈液狀、灰黃或灰黑色，有時(shí)小腸黏膜出現(xiàn)廣泛出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大。6.4結(jié)果判定易感動(dòng)物出現(xiàn)上述臨床癥狀和病理變化，可初步判定為牛輪狀病毒性腹瀉疑似病例。7實(shí)驗(yàn)室診斷7.1器材7.1.1CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱7.1.2T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶7.1.3漩渦振蕩器7.1.4倒置顯微鏡7.1.5電鏡7.1.6電泳儀7.1.7水平電泳槽7.1.8凝膠成像儀7.1.9不同規(guī)格可調(diào)移液器與槍頭7.1.10PCR儀7.1.11臺式高速離心機(jī)7.1.12低速離心機(jī)7.1.13水浴鍋7.1.14電子天平7.1.1596孔細(xì)胞培養(yǎng)板7.1.16無菌棉拭子7.1.17玻璃珠7.1.18不同規(guī)格離心管7.1.19PCR管7.1.20無菌密封袋7.1.21手術(shù)刀、手術(shù)剪7.1.22無菌鑷7.1.23研缽7.1.24分光光度計(jì)7.1.25不同規(guī)格移液器及槍頭7.1.26漩渦振蕩器7.1.27溫箱7.1.28低溫高速離心機(jī)7.2試劑7.2.1PBS7.2.2DMEM培養(yǎng)基7.2.3細(xì)胞培養(yǎng)液7.2.4細(xì)胞維持液7.2.5FBS7.2.6青鏈霉素7.2.70.25%EDTA-胰酶7.2.8MA104細(xì)胞7.2.9Vero細(xì)胞7.2.10MDBK細(xì)胞7.2.11丙酮7.2.122%磷鎢酸7.2.13無酶水7.2.14PCRTaq酶7.2.15電泳緩沖液7.2.16瓊脂糖7.2.17DNAMarker7.2.18RNA提取試劑盒7.2.19蒸餾水7.3樣品采集與處理7.3.1糞便樣品4將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，地上有剛排出的新鮮糞便時(shí)無菌采集。分別放入裝有3mLPBS的管中，編號并記錄相關(guān)信息。漩渦振蕩器充分振蕩，4℃、12000r/min離心5min～8min，取上清編號備用。7.3.2組織樣品取病死牛小腸及內(nèi)容物，置于無菌密封袋內(nèi)。稱取1g樣品置于研缽，充分研磨后加5mLPBS，混勻，4℃、8000r/min離心5min，取上清編號備用。7.3.3血液樣品一次性采血管采集血液3～4mL，犢牛采用頸靜脈采血，成年牛采用尾靜脈采血。室溫靜置30min，3000～4000r/min離心5min～10min。分離血清編號備用。7.4樣品運(yùn)輸與保存采集的樣品運(yùn)送時(shí)放置冷凍冰袋，盡量12h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。采集或處理后的樣品在2℃~8℃保存，一般不超過24h，若長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件保存。7.5病原學(xué)檢測7.5.1電鏡檢查將采集的糞便或腸內(nèi)容物用PBS制成1:4懸液，裝入盛有玻璃珠的管內(nèi)充分震蕩30min，取懸液3000r/min離心30min，取上清液，再以15000r/min離心30min，棄上清，加1～2滴蒸餾水懸浮，2%磷鎢酸染色，電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。7.5.2病毒分離鑒定7.5.2.1病毒分離7.5.2.1.1單層細(xì)胞制備MA104、Vero和MDBK細(xì)胞均可用于牛輪狀病毒分離培養(yǎng)。將細(xì)胞用0.25%EDTA-胰酶消化，加入至少等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液終止，吹打混勻，使其分散濃度為1～2×106個(gè)/mL，分裝到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h～48h。隨時(shí)觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞鋪成單層備用。7.5.2.1.2接種細(xì)胞將處理后的樣品用細(xì)胞維持液制成1:5懸液，漩渦振蕩混勻，4℃、3000r/min離心10min，用0.22μm濾膜過濾后取上清，添加濃度為10～20μg/mL胰酶，37℃處理0.5h～1h。每份樣品接種3瓶細(xì)胞，設(shè)置正常細(xì)胞對照組。接種前棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中液體，按細(xì)胞維持液終體積的10%加入處理好的樣品，37℃吸附1h，期間每隔20min搖晃一次，吸附完成后補(bǔ)加含0.5μg/mL～2μg/mL胰酶的細(xì)胞維持液。對照組不接種樣品，棄去培養(yǎng)液后加入等量細(xì)胞維持液。均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。7.5.2.1.3觀察和記錄5每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄，連續(xù)觀察4d～5d。如對照組細(xì)胞單層完好，細(xì)胞生長正常，接種樣品的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，且80%以上細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，置-70℃以下凍存。若接種的細(xì)胞無CPE出現(xiàn)，反復(fù)凍融3次，進(jìn)行盲傳。7.5.2.1.4盲傳將第1代無CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次后混合，4℃、5000r/min離心5min～8min，取上清繼續(xù)接種細(xì)胞，進(jìn)行觀察、記錄、收毒，盲傳第2代。此過程中培養(yǎng)物仍無CPE則按同樣的方法繼續(xù)盲傳至第5～7代，若出現(xiàn)CPE，達(dá)到80%以上時(shí)收毒，置-70℃以下凍存。7.5.2.2中和試驗(yàn)7.5.2.2.1單層細(xì)胞制備將細(xì)胞濃度制備為1～2×106個(gè)/mL，于96孔板培養(yǎng)，每孔100μL，加細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)齊至1mL/孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。7.5.2.2.2固定血清-稀釋病毒法用DMEM培養(yǎng)基將病毒液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-8將不同稀釋梯度的病毒液和已滅活的血清等體積混合，37℃水浴感作1h；取混合液200μL分別加至已長成單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋梯度接種4孔；同時(shí)設(shè)1:10稀釋的BRV陽性血清對照、1:5稀釋的陰性血清對照和正常細(xì)胞對照各4孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察并記錄各孔CPE，連續(xù)觀察5d～7d。7.5.3PCR檢測7.5.3.1總RNA提取將采集的樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行處理，按RNA提取試劑盒方法提取核酸。在-20℃條件下可短時(shí)間保存，若需長期保存，應(yīng)置于-70℃以下條件，避免反復(fù)凍融。7.5.3.2引物合成根據(jù)BRVVP6基因設(shè)計(jì)引物。BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：GTCCAATTCATACCTGGTGG。7.5.3.3反應(yīng)體系按25μL反應(yīng)體系配制（見附錄C）。一步法：模板2μL，上、下游引物各1μL，OnestepTaq酶12.5μL，RNase-FreeH2O8.5uL。H2O8.5uL。7.5.3.4反應(yīng)程序一步法：50℃30min；94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。兩步法：94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。7.5.3.5電泳檢測制備瓊脂糖凝膠，取5～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入上樣孔，同時(shí)加入陽性和陰性對照以及DNAMarker，于1×TAE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，凝膠成像儀觀察結(jié)果。67.5.3.6測序分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測序分析，序列Blast比對是否為牛輪狀病毒VP6基因。7.5.4ELISA檢測待檢糞便樣品按牛輪狀病毒抗原診斷ELISA試劑盒方法進(jìn)行檢測。使用分光光度計(jì)檢測450nmOD值。7.5.5結(jié)果判定7.5.5.1電鏡檢查結(jié)果可見略呈球形，直徑約70～75nm的病毒顆粒，其形態(tài)似典型的“車輪”狀，即判定樣品為牛輪狀病毒陽性。7.5.5.2中和試驗(yàn)結(jié)果當(dāng)正常對照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長良好，陽性血清對照組不出現(xiàn)CPE，陰性血清對照組出現(xiàn)CPE，證明試驗(yàn)成立，可進(jìn)行結(jié)果判定。被檢血清的中和指數(shù)＞50，有2個(gè)或2個(gè)以上孔的細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，即判定為陽性(見附錄B.1)。7.5.5.3PCR檢測結(jié)果陽性對照、PCR產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致（380bp），同時(shí)陰性對照無條帶；即判定為陽性測序分析Blast比對為牛輪狀病毒VP6基因，即判定為陽性。7.5.5.4ELISA檢測結(jié)果按ELISA試劑盒要求進(jìn)行判定，樣品結(jié)果符合陽性標(biāo)準(zhǔn)即判定為陽性。7.6血清學(xué)檢測采用中和試驗(yàn)（固定病毒-稀釋血清法）進(jìn)行血清學(xué)檢測。7.6.1檢測時(shí)間發(fā)病初期和發(fā)病后2周各檢測1次。7.6.2血清稀釋于1.5mL離心管中加入DMEM培養(yǎng)基，每管100μL；取56℃,30min滅活的血清100μL加入管內(nèi)，從第一個(gè)管開始做10倍連續(xù)稀釋，從最后一管內(nèi)棄去100μL液體。7.6.3感作每個(gè)不同稀釋度的血清內(nèi)加入等量BRV病毒液，充分混勻，37℃水浴感作1h。7.6.4接種取200μL感作后的液體分別加至已長成單層細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋梯度接種4孔；同時(shí)設(shè)血清毒性對照（細(xì)胞內(nèi)加最低稀釋度的血清）、1:10稀釋的BRV陽性血清對照、1:5稀釋的陰性血清對照和正常細(xì)胞對照各4孔及BRV病毒液回歸對照100～10-3的4個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度各4孔。77.6.5觀察和記錄將細(xì)胞板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)觀察5d～7d，觀察并記錄各孔CPE。7.6.6結(jié)果判定1)當(dāng)正常對照組孔內(nèi)細(xì)胞單層生長良好，陽性血清對照組不出現(xiàn)CPE，陰性血清對照組出現(xiàn)CPE，證明試驗(yàn)成立。記錄血清各稀釋度的4個(gè)孔中出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench法(見附錄B.2)分別計(jì)算血清中和BRV的抗體效價(jià)，抗體效價(jià)大于1:5時(shí)，即為中和試驗(yàn)結(jié)果陽性。2)發(fā)病初期和發(fā)病后2周中和試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，且發(fā)病后2周抗體效價(jià)達(dá)發(fā)病初期的4倍，即判定為牛輪狀病毒感染。8綜合判定8.1初診符合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化可初步診斷為牛輪狀病毒性腹瀉。8.2確診符合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，同時(shí)病原學(xué)檢測中任一檢測（電鏡檢查、病毒分離鑒定、PCR檢測、ELISA檢測）結(jié)果判定為陽性可確診牛輪狀病毒性腹瀉。符合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，同時(shí)血清學(xué)檢測（中和試驗(yàn)）結(jié)果判定為陽性可確診牛輪狀病毒性腹瀉。8試劑配制A.1PBS緩沖液：NaClKClNa2HPO4KH2PO41.44g0.24g蒸餾水定容至800mL，HCl調(diào)其pH至7.4左右，加蒸餾水定容至1000mL，121℃15min高壓滅菌。A.2細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基FBS青鏈霉素44.5mL混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。A.3細(xì)胞維持液DMEM培養(yǎng)基0.25%EDTA-胰酶消化液青鏈霉素44.5mL0.25g/mL500μL混合均勻后，4℃密封保存，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。A.450×TAE電泳緩沖液三羥甲基氨基甲烷（Tris）EDTA-2Na冰乙酸去離子水242g37.2g57.1mL942.9mLTris和EDTA-2Na溶于800mL去離子水，攪拌均勻；加入冰乙酸，充分溶解；用1moL/LNaOH調(diào)pH值至8.3，滅菌去離子水定容至1000mL后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為1×TAE電泳緩沖液9中和試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算方法B.1固定血清-稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量但不同稀釋度的病毒，用對照組和待檢血清同時(shí)進(jìn)行測定，計(jì)算每一組的LD50，然后計(jì)算中和指數(shù)。表B.1中和指數(shù)計(jì)算示例LD1010根據(jù)表B.1計(jì)算：中和指數(shù)=試驗(yàn)組LD50/對照組LD50中和指數(shù)=10-2.2/10-5.5=103.3=1995說明待檢血清中和病毒能力為對照血清的1995倍。通常待檢血清的中和指數(shù)＞50，即可判定