1馬鈴薯病毒鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了規(guī)定了內(nèi)蒙古馬鈴薯病毒鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、檢驗對象、取樣、鑒定方法和判定規(guī)則。本文件適用于內(nèi)蒙古馬鈴薯的病毒鑒定。環(huán)境相似的馬鈴薯產(chǎn)區(qū)可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T40974-2021核酸樣本質(zhì)量評價方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1馬鈴薯Solanumtuberosum別稱土豆、地蛋、洋芋等。是茄科茄屬一年生草本植物。3.2反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)提取洋蔥、大蒜檢材的總RNA，以其中的mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。4檢測對象4.1洋蔥主要病毒a）甘薯卷葉病毒（Sweetpotatoleafcurlvirus，SPLCVb）馬鈴薯A病毒（PotatovirusA，PVAc）番茄黑斑病毒（Tomatoblackringvirus，TBRVd）馬鈴薯卷葉病毒（Potatoleafrollvirus，PLRVe）苜?；ㄈ~病毒（Alfalfamosaicvirus，AMVf）馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potatospindletuberviroid，PSTVdg）馬鈴薯奧古巴花葉病毒（Potatoaucubamosaicvirus，PAMV2h）煙草壞死病毒（Tobacconecrosisvirus，TNVi）馬鈴薯V病毒（PotatovirusV，PVVj）馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVYk）煙草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRVl）馬鈴薯M病毒（PotatovirusM，PVMm）馬鈴薯帚頂病毒（Potatomop-topvirus，PMTVn）馬鈴薯S病毒（PotatovirusS，PVSo）黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMVp）安第斯馬鈴薯潛隱病毒（Andeanpotatolatentvirus，APLVq）馬鈴薯X病毒（PotatovirusX，PVXr）番茄環(huán)紋斑點病毒（Tomatozonatespotvirus，TZSVs）番茄斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus，TSWVt）馬鈴薯黃矮病毒（Potatoyellowdwarfvirus，PYDV5取樣5.1取樣方法5.1.1五點取樣法對于洋蔥、大蒜無癥狀的種植區(qū)或面積較大的種植區(qū)采用5點取樣法隨機抽取。1000株以內(nèi)抽檢10株（含1000株）；1000株～10000株（含10000株）,首個1000株抽檢10株之后每增加1000株增檢5株，不足1000株按1000株計；超過10000株，第1000～10000株按上述方法抽樣，之后每增加1000株增檢20株，不足1000株按1000株計。5.1.2根據(jù)癥狀觀測取樣感染病毒病的洋蔥、大蒜極易表現(xiàn)出矮化、扭曲、黃化、褪綠以及壞死斑等癥狀。根據(jù)在洋蔥、大蒜上觀測的各癥狀表現(xiàn)可進行有效取樣。5.2取樣部位疑似病毒病感染的馬鈴薯植株，癥狀如植株矮小，塊莖萎縮，葉片皺縮斑駁等。取馬鈴薯植株莖稈和葉柄放置于自封袋內(nèi)，4℃保存不超過24h或液氮預(yù)冷后立即放置于-80℃長期保存?zhèn)溆茫韷K存放置干燥處備用。6反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR法)鑒定詳見附錄A。7判定規(guī)則RT-PCR檢測呈陽性反應(yīng)的判定為攜帶病毒。脫毒馬鈴薯帶毒率為0。3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR法)鑒定A.1試劑盒A.1.1植物DNA、RNA提取試劑盒：選擇適合提取含有多糖多酚材料的DNA、RNA試劑盒。B.1.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒：使用市售的商品反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明進行操作。B.1.3PCR擴增試劑盒：使用市售的商品PCR擴增試劑盒，按照說明進行操作。A.2引物病毒PCR檢測特異性引物見表A.1表A.1馬鈴薯病毒的特異性引物病毒引物名稱引物序列（5’-3’）片段大?。╞p）SPLCVSPLCV-FACTTCGAGACAGCTATCGTGSPLCV-RACGAATTCAAGATGGATGTCPVAGATGTCGATTTAGGTACTGCTG273TCCATTCTCAATGCACCATACTBRVTBRV-FGGCATTTCTTATAGAGAATATCCCTCC277TBRV-RGCTTTTTGCAGAAAAYATTTTATCATPLRVPLRV-FCGCGCTAACAGAGTTCAGCC336PLRV-RGCAATGGGGGTCCAACTCATAMVAMV-FCCATCATGAGTTCTTCACAAA351AMV-RTCGTCACGTCATCAGTGAGACPSTVdPSTVd-FCACCCTTCCTTTCTTCG359PSTVd-RAAAACCCTGTTTCGGCGGGAPAMVPAMY-FACCCAAGCGTTCCTATATACTC360PAMV-RGGTCAAATCATTGCCAGCAATCTNVTNV-FAAGATACAACACATTACGATCG416TNV-RACTAGACGTTCATTGAGGGATTGAPVVPVV-FCTAACGCAAGGGCAACTCAG434PVV-RCAGTGCTGCTGCCTTCATCT4PVYPVY-FGGCATACGGACATAGGAGAAACT447PVY-RCTCTTTGTGTTCTTCTCTTGTGTTRVTRV-FGACGTGTGTACTCAAGGGTT463TRV-RCAGTCTATACACAGAAACAGAPVMPVM-FACATCTGAGGACATGATGCGC520PVM-RTGAGCTCGGGACCATTCATACPMTVPMTV-FATGGCTGAAAACAGAGGTGA531PMTV-RCTATGCACCAGCCCAGCGTAAPVSPVS-FTCTCCTTTGAGATAGGTAGG602PVS-RCAGCCTTTCATTTCTGTTAGCMVCMV-FGTTTATTTACAAGAGCGTACGG650CMV-RGGTTCGAARRWATAACCGGGAPLVAPLV-FCACCCAAATGGACCTCTGCTGTGTGCTA688APLV-RTGCTTCCCTTTTTCAATTCPVXPVX-FATGTCAGCACCAGCTAGCA711PVX-RTGGTGGTGGTAGAGTGACAATZSVTZSV-FTGGTTAAAAAGACAGATCATTGCT852TZSV-RCTACTTGCCAACATGTCTAACGTCTSWVTSWV-FTCACTGTAATGTTCCATAGCAA861TSWV-RAGAGCAATYGTGTCAATTTTATTCPYDVPYDV-FATATTCATTTCCAGGCTTGCATT890PYDV-RATCTGATACTGGCCTACCCTTA.3操作步驟A.3.1馬鈴薯各病毒DNA或RNA提取A.3.1.1提取方法按照試劑盒操作說明書提取。A.3.1.2判定規(guī)則5提取的RNA質(zhì)量判定參照GB/T40974-2021執(zhí)行。DNA判定采用電泳法檢測，RNA有兩條條帶，條帶清晰明亮；微量分光光度計測得OD260/OD280比值1.8以上、濃度30ng/μL以上的，以此為模板直接進行反轉(zhuǎn)錄或置于-80℃條件下保存。不符合以上指標(biāo)的需重新提取。A.3.2逆轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書提取。A.3.3病毒檢測A.3.3.1PCR擴增A.3.3.1.1PCR反應(yīng)體系按說明書指定的劑量在PCR反應(yīng)管中依次加入多聚酶，病毒特異性檢測上下游引物，cDNA模板或提取的樣本DNA，無菌蒸餾水。目標(biāo)病毒對應(yīng)檢測引物見表A.1。A.3.3.1.2PCR反應(yīng)程序?qū)CR管放入PCR儀中，按說明書指定程序進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，待測病毒引物退火溫度按指定值進行輸入，延伸時長可根據(jù)片段大小適當(dāng)調(diào)整，采用凝膠電泳法檢測反應(yīng)產(chǎn)物。A.3.3.2電泳檢測制備1%的瓊脂糖凝膠，每個泳道加入5μL的PCR產(chǎn)物，110V恒壓電泳30分鐘。A.3.3.3凝膠成像分析電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于藍(lán)光切膠儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴增