cellsignaling·TECHNOLOGY22在IF實(shí)驗(yàn)中，通常采用兩種方式來檢測目標(biāo)蛋白：一是直接使用與熒光基團(tuán)共價偶聯(lián)的所需材料冰凍組織22制備細(xì)胞或組織?組織制備細(xì)胞或組織?組織?鋪板條件?優(yōu)化細(xì)胞密度和改善細(xì)胞健康狀態(tài)1設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?實(shí)驗(yàn)對照?實(shí)驗(yàn)對照?多重分析 4?固定劑的選擇?固定孵育時間通透化處理?去污劑或醇類的選擇?封閉劑的選擇?封閉劑的選擇免疫染色?一抗稀釋?清洗和二抗孵育678899數(shù)據(jù)收集和成像33一抗是IF實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵成分，其性能可直接影響到數(shù)據(jù)質(zhì)量。能用于免疫印跡法(WB)檢測特異性條驗(yàn)證特異性以避免誤導(dǎo)性IF結(jié)果?充分保證其在IF分析中也具備相應(yīng)良好表疑難排解提示疑難排解提示44行藥物學(xué)處理、添加胞外配體來調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通平行的，這樣固定和后續(xù)步驟可以同時進(jìn)行。采評估抗體性能時所采用的對照方式。其中一些可敲除細(xì)胞系以驗(yàn)證靶標(biāo)特異性一種異構(gòu)體，還是能識別兩種異構(gòu)體，還是已知對目標(biāo)靶標(biāo)的表達(dá)呈陽性或陰性的細(xì)胞?通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)磷酸化狀態(tài)來確認(rèn)磷酸化特異性(C)實(shí)驗(yàn)擾動分析可確定某種抗體對PTM是否具有特異性。55?和?抗原抗原熒光基團(tuán)酪胺激活的酪胺組織/細(xì)胞組織多重操作步驟連續(xù)染色每個靶標(biāo)使用不同的宿主種類或同位素否是是信號擴(kuò)增無12取決于靶標(biāo)數(shù)量注取決于偶聯(lián)抗體的可用性；66IF-IC操作流程的最后一步是在熒光顯微鏡下觀察已固定和已染色細(xì)胞的成像。考慮到體材料上進(jìn)行細(xì)胞鋪板（從永生化細(xì)胞系中傳代培養(yǎng)，或從原代細(xì)胞中分離）。典型的載體形式包括玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿、使用聚賴氨酸和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分制成的玻璃蓋玻片（保存在塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，支持貼壁式細(xì)胞培養(yǎng)）、市面上可用于顯微鏡的玻片底多孔顯微鏡上以低放大倍數(shù)檢測細(xì)胞應(yīng)激跡象（比如多核細(xì)胞），確保您的細(xì)胞始終保持健康狀態(tài)。此外，還要確保細(xì)胞密度對相應(yīng)細(xì)在CST，我們會檢測各種各樣的固定和通透化條件，努力發(fā)現(xiàn)有助于每種抗體產(chǎn)生最佳信號的條件組合。樣本的固定和通透化步驟十分關(guān)鍵，決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。理想的固定劑可以使樣疑難排解提示疑難排解提示針對懸浮生長細(xì)胞系的IF操作方法有二：一固定步驟，然后低速離心至載玻片上進(jìn)行后續(xù)染色步驟；二是先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至77經(jīng)新鮮冰凍并在冷凍箱內(nèi)切片的IF-F樣本現(xiàn)可使用固定劑進(jìn)行處理?；蛘?，組織樣本也可首先通過穿心灌注、隨后固定、低后再進(jìn)行石蠟包埋和切片。在抗體孵育之前，必須對切片進(jìn)行抗原/表位修復(fù)步驟，即使用二甲苯脫蠟并用加熱或微波爐進(jìn)位，同時還利于抗體識別并標(biāo)記相應(yīng)靶標(biāo)?？焖賹⑴囵B(yǎng)介質(zhì)更（見下文），而最佳的固定方法取決于所使用的甲醛、福爾馬林（由溶解甲醛和較低比例的甲醇混合而成）和戊二醛等醛基固定劑都是十分常用的固定劑。針對大多數(shù)應(yīng)、形成交聯(lián)，從而穩(wěn)定和固化樣本。交聯(lián)程度取決于多種條件（見下文）。醛類在交聯(lián)質(zhì)膜、固定可溶性蛋白方面的性能引發(fā)脫水/變性的固定劑會移除細(xì)胞大分子周圍的水，導(dǎo)致在原位變性和沉淀。靶蛋白變性可能會將通常隱藏的表位暴露出來，因此該方法對某些抗體而言存在一定優(yōu)勢。(F)然而，脫水性固定劑不太適用于可溶性靶標(biāo)和修飾特異性抗體，比如磷交聯(lián)程度及IF信號保存情況取決于固定時間。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，保持甲醛濃度為4%，而對固定時長作出了改變。以熒光號最佳。當(dāng)固定不足該時長（僅5分鐘）時，出現(xiàn)信號移位。醇或IF甲醇-通透化），則需要根據(jù)這些抗體的最佳條件確定它們的使用優(yōu)先順序。首先進(jìn)行一次小型檢測，比較不同的操作步驟，可能會發(fā)現(xiàn)一些有益信息，為后續(xù)開展大型實(shí)驗(yàn)疑難排解提示疑難排解提示定期更換陳舊的醛類固定劑，制備新鮮的稀釋液；陳舊溶液88如果使用交聯(lián)性固定劑，質(zhì)膜將仍保持完整，抗體無法檢測胞），??、皂苷、洋地黃皂苷和移除了細(xì)胞膜中的多種分子，形成了各種“孔道”，使得抗體得以進(jìn)入胞內(nèi)?；蛘撸部稍诠潭ú襟E之后使用乙醇或甲醇進(jìn)行醇類通透化處理。該方法將交聯(lián)性固定劑的快速固定性能和醇類的中度變性結(jié)合了起來，可增強(qiáng)某些靶標(biāo)（尤其是與細(xì)胞器或細(xì)胞骨架相關(guān)的靶標(biāo)）的信號強(qiáng)度。同固定一樣，最佳通透化方法也根據(jù)所使用的抗體來調(diào)整確定。甲醇通透化處理可封閉步驟可減少一抗和二抗與非靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行非特異性結(jié)合時所產(chǎn)生的本底信號。理想情況是，封閉劑將占據(jù)樣本中的“黏性”位點(diǎn)，比如暴露的帶電性或疏水性蛋白表面，同時不會干擾一抗/二抗識別靶表位，從而盡可能提高信噪比整；請參見產(chǎn)品說明書中的建議。我們最常建議使用的是在??本之間產(chǎn)生非特異的、基于電荷的相互作用?；旧希x擇經(jīng)測試和批準(zhǔn)可適用于所選應(yīng)用的高質(zhì)量抗體，可在封閉操疑難排解提示疑難排解提示苷酸(NADH)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素和黃比較使用/未使用抗體/熒光基團(tuán)的信號強(qiáng)度有何差異。IF標(biāo)準(zhǔn)IF甲醇-通透化99請務(wù)必按照建議的稀釋比例使用抗體，以便獲得較高的信噪比(S/N)。一方面，如果抗體的使用濃度過低，會導(dǎo)致熒光信號十分模細(xì)胞系進(jìn)行滴定測試，以發(fā)現(xiàn)既能提供最佳信號又能最大程度降低本底染色的理想濃度，從而為您提供最佳建議。下圖為某種抗體雖然前一步已對樣本作封閉處理，但抗體通常還是會在含蛋白載體（牛血清白蛋白BSA）的稀釋緩沖液中被稀釋，然后再應(yīng)用到樣育時長和溫度條件的相關(guān)性。從圖中可以看出，在建議孵育條件（4°C/過夜）下可獲得最佳信號強(qiáng)度；而縮短孵育時間、提高溫度信號過低固定之后，在一抗和二抗孵育和/或復(fù)染色步驟之間務(wù)必進(jìn)行徹底清洗，這是降低背景、提高S/N的關(guān)鍵。經(jīng)IF驗(yàn)證的抗體，其抗原結(jié)合區(qū)域?qū)Π斜砦痪哂休^高的親合力；但其他區(qū)域可能存在程度較低的親和力，還可能發(fā)生非特異性相互作用，最終導(dǎo)致背景升IF-IC檢測是研究亞細(xì)胞定位變化情況的理想方法，因?yàn)樗梢?????），??????????可能原因按照經(jīng)嚴(yán)格測試的操作步驟進(jìn)行一抗孵育，才能獲得一致、可靠原因以未染色樣本為對照，檢測自發(fā)熒光程度。請用久了的固定劑可能會出現(xiàn)自發(fā)熒光；更換陳舊甲醛，制備新?????