血吸蟲病免疫診斷技術(shù)

------現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)規(guī)范血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范一、目前常用的血吸蟲病免疫診斷類型與方法

1)凝集反應(yīng)直接凝集試驗(yàn)間接凝集試驗(yàn)正向間接凝集試驗(yàn)----間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（IHA）反向間接凝集試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)2)沉淀反應(yīng)環(huán)卵沉淀試驗(yàn)（COPT）3)免疫電泳技術(shù)經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)對(duì)流免疫電泳酶標(biāo)記抗原對(duì)流免疫電泳雙向酶標(biāo)對(duì)流免疫電泳免疫印跡技術(shù)4)免疫標(biāo)記技術(shù)酶免疫測定---酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（ELISA）免疫熒光法放射免疫測定法免疫膠體金技術(shù)---斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA滲濾法）免疫膠體染料試驗(yàn)---膠體染料試紙條試驗(yàn)（DDIA層析法）化學(xué)發(fā)光免疫分析血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范二、未稍采血（塑料管法）操作規(guī)程1．采血部位通常取手指或耳垂。耳垂末梢血循環(huán)較差，受氣溫影響較大，冬季最好不用；由于耳垂采血痛感較輕，病人容易接受，可先充分按摩，改善耳垂末梢循環(huán)。手指采血應(yīng)選擇無名指。2．采血器材一次性三棱針或彈簧刺血針、75%的酒精、無菌脫脂棉球、聚乙烯塑料管（直徑2mm，長8cm）、鑷子、酒精燈等。

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范3．采血方法1）以手指按摩采血部位，使局部充血，再用75%酒精棉球消毒皮膚。2）待干后用左手固定采血部位，右手持消毒針迅速刺入皮膚2-3mm，取出刺針，血液即自行溢出。如血流不暢，可于四周稍加壓力。3）用消毒干棉球擦去第一滴血液，以后流出的血即可采用。4）用塑料管進(jìn)血口靠近血滴讓血液自行流入管內(nèi)，采集＞3cm血液(一次檢測)。5）采血完畢，刺處用消毒棉球拭擦干凈。6）采血后的塑料管將進(jìn)血端留一小段空隙，靠近酒精燈燒熔管口，用鑷子輕輕夾住已基本溶化的采血管進(jìn)血端約10秒,將進(jìn)血端牢牢封住,貼上標(biāo)簽。7）塑料管封口端朝下垂直于容器中，待血清自然析出或離心后，剪去塑料管之血球部分，將血清移至中部，用于檢測?；騼啥朔饪诤蠓疟浔４?zhèn)溆谩Ｑx病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4．注意事項(xiàng)采血部位要嚴(yán)格消毒，做到一人一針；采血針忌用注射針頭；采血針刺入速度要迅速；有炎癥部位不能采血；采血時(shí)切忌用力擠壓；采血后傷口繼續(xù)出血應(yīng)用干棉球壓迫；用塑料管收集血液時(shí)應(yīng)盡量避免空氣進(jìn)入管內(nèi);如果空氣進(jìn)入管內(nèi)可將塑料管的另一端位置提高,以排除空氣,然后繼續(xù)采集血液到指定位置可用普通離心機(jī)低速(1000-1500轉(zhuǎn))離心5分鐘,以分離血清，防止離心過速或過長。塑料管封口要嚴(yán)密，防止血液流失。用剪刀剪塑料管時(shí)應(yīng)保持剪刀的清潔，避免交叉污染。分離后的血清（或血漿）樣品可置冰箱保存。實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)按照相關(guān)規(guī)定處理，嚴(yán)禁隨意丟棄。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范三、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(IHA)操作規(guī)程

1基本原理

抗原吸附于經(jīng)適當(dāng)處理的紅細(xì)胞表面，使紅細(xì)胞致敏。致敏紅細(xì)胞與病人血清中特導(dǎo)性抗體（抗SEA特異性抗體）相遇時(shí)，在適宜的條件下（電解質(zhì)、溫度、pH），抗原與特導(dǎo)性的抗體相結(jié)合，使紅細(xì)胞出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)。為正向間接凝集。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范2凍干致敏紅細(xì)胞的制備工藝血吸蟲蟲卵抗原制備紅細(xì)胞醛化紅細(xì)胞鞣化紅細(xì)胞致敏致敏紅細(xì)胞的冰凍干燥致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，只能使用2～3天。新鮮紅細(xì)胞能吸附多糖類抗原，但吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體的能力較差。為此一般在致敏前先將紅細(xì)胞醛化，先用甲醛或戊二醛，再用鞣酸處理。醛化紅細(xì)胞能耐60℃加熱，可長期保存而不溶血。并可反復(fù)凍融不破碎，在4℃可保存3～6個(gè)月，在－20℃可保存一年以上。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范3實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備1)穿戴好工作服、口罩和手套等，做好基本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。2）實(shí)驗(yàn)試劑和器材檢查和擺放。要求試劑批號(hào)與有效期符合產(chǎn)品說明；器材符合相關(guān)質(zhì)量要求。3)檢查完畢后，按照實(shí)驗(yàn)常規(guī)要求擺布好實(shí)驗(yàn)試劑和器材。4）實(shí)驗(yàn)試劑和器材準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試劑盒：1.凍干致敏紅細(xì)胞（紅瓶）2.致敏紅細(xì)胞稀釋液（蒸餾水、紅瓶）3.標(biāo)本稀釋液（生理鹽水、蘭瓶）4.陽性對(duì)照品（凍干品、紅色）5.陰性對(duì)照品（凍干品、蘭色）6.使用說明書

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范器材：1.移液器100μl一支、1000μl（1ml）一支、配套吸頭、吸頭盒及移液器架等2.“V”型反應(yīng)板一塊、白紙一張、記號(hào)筆3.旋轉(zhuǎn)震蕩器一臺(tái)4.溫箱一臺(tái)5.實(shí)驗(yàn)記錄紙、記錄筆、廢棄物杯5)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備要求：待檢血清（或血漿）要新鮮，不能有溶血或混有紅細(xì)胞。應(yīng)選擇“V”型，底角為90度的反應(yīng)板。不要選擇“U”型及不同底角的“V”型反應(yīng)板?！癡”型反應(yīng)板要清潔、不潮濕，反應(yīng)孔完好光潔。試劑盒在有效期內(nèi)血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4實(shí)驗(yàn)操作步驟1)樣本編號(hào)，從左到右按1～n號(hào)排列。2）取一塊96孔“V”型反應(yīng)板橫向平放縱向使用。血凝反應(yīng)板編號(hào)：1）橫向（行）從左到右編號(hào)：1、2、3、……、陰、陽；2）縱向（列）從上到下編號(hào)：1:5、1:10、1:20、1:40。3）稀釋對(duì)照品：陰性對(duì)照、陽性對(duì)照品各加100μl蒸餾水稀釋溶解，加蓋混勻后放回原處備用。4）配置致敏紅細(xì)胞懸液：啟開安瓶，以每支凍干致敏紅細(xì)胞加1ml致敏紅細(xì)胞稀釋液（蒸餾水、紅瓶）稀釋混勻備用。5)啟開標(biāo)本稀釋液（生理鹽水、蘭瓶）安瓶。6）調(diào)節(jié)移液器為100μl。血凝反應(yīng)板的第1行（橫向）第1孔各加標(biāo)本稀釋液

100μl。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范

7）調(diào)節(jié)移液器為25μl。血凝反應(yīng)板的縱向（列）第2～4孔各加標(biāo)本稀釋液

25μl。加液完畢，檢查每孔是否有漏加孔或加雙倍孔，并及時(shí)糾正。

8）于第一排第1孔加1號(hào)待測血清25μl，加完血清（蓋上蓋子）放回原處，

充分混勻（吸打4次，混勻吸打在第一檔進(jìn)行，移液吸頭不能觸碰反應(yīng)孔

底壁）,使血清成1﹕5稀釋。（加血清時(shí)要核對(duì)一下樣本編號(hào)防止加錯(cuò)

位）。

9）在第1孔吸出25μl于第2孔（縱向），同上混勻使血清成1:10稀釋。后吸出

25μl于第3孔（縱向），同上混勻使血清成1:20稀釋。后吸出25μl于第4

孔縱向），同上混勻使血清成1:40稀釋,后吸出25μl棄去，自動(dòng)卸去吸頭。

同上操作進(jìn)行第2～n號(hào)樣本、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照倍比稀釋。倍比稀釋

一個(gè)樣本一個(gè)吸頭。

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范10）全部樣品（及對(duì)照）倍比稀釋完成后，調(diào)節(jié)移液器為75μl，然后在第一行（縱列第一孔）吸取75ml棄去，一個(gè)樣本一個(gè)吸頭。11)檢查每孔液面是否在同一高度，否則應(yīng)及時(shí)糾正。

12）充分混勻致敏紅細(xì)胞懸液（每加若干次要混勻一次），然后在每孔加致敏紅細(xì)胞懸液25μl（原則上以每個(gè)樣品為單位即列為單位加液），不需換吸頭，但不能觸碰反應(yīng)板，自動(dòng)卸去吸頭。13）先試一試震蕩器，正常運(yùn)轉(zhuǎn)后將反應(yīng)板震搖1～2分鐘，蓋上蓋子，置37℃

(水浴)30min后下墊白紙觀察結(jié)果。并做好記錄。14）記錄結(jié)果后，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清理：未使用試劑、未使用吸頭、移液器（刻度復(fù)原至最高檔）等放回原處；實(shí)驗(yàn)廢物放入規(guī)定的收集器內(nèi)。

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范5結(jié)果判定

1）首先應(yīng)觀察對(duì)照管：陰性對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，陽性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，結(jié)果方可成立。如出現(xiàn)異常則說明實(shí)驗(yàn)操作有誤或血球本身有自凝現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果不能成立。2）根據(jù)紅細(xì)胞凝集程度以“－”，“＋”，“＋＋”，“＋＋＋”記錄結(jié)果，以呈“＋”凝集的血清最高稀釋度作為血清的效價(jià),

以效價(jià)≥1:10作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。3）報(bào)告形式：1:40陽性（＋＋）血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4）血凝反應(yīng)強(qiáng)度的判定如下：

－：紅細(xì)胞全部下沉在孔底，形成肉眼可見緊密、邊緣光滑的小圓點(diǎn)。

＋：多數(shù)紅細(xì)胞下沉在孔底形成圓點(diǎn)，周圍可見少量凝集紅細(xì)胞，肉眼見周邊模糊(或中間出現(xiàn)較為明顯的空白點(diǎn))。

＋＋：孔底中心可見少量紅細(xì)胞下沉的小圓點(diǎn)，多數(shù)凝集紅細(xì)胞在孔底周圍形成小薄層＋＋＋：紅細(xì)胞形成薄層凝集,邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則的皺褶。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范6注意事項(xiàng)1）結(jié)果觀察時(shí)不能移動(dòng)反應(yīng)板，如條件限制則要非常小心慢移，切勿搖動(dòng)反應(yīng)板，以免凝集分散，影響結(jié)果判斷。結(jié)果觀察時(shí)下墊白紙。2）血凝板以96孔“V”型底角應(yīng)為90度有機(jī)玻璃板為適宜，確保所用器材清潔,血凝板清洗不能用毛刷、移液吸頭不能觸碰反應(yīng)孔,以避免損壞反應(yīng)孔,造成假陽性。

3）待測血清或血漿不能混有紅細(xì)胞或被細(xì)菌污染。標(biāo)本不能及時(shí)檢測可在內(nèi)4℃度保存2

～3

天。長時(shí)間保存應(yīng)放冰箱凍存。4）結(jié)果判斷的時(shí)間與溫度有關(guān)，應(yīng)根據(jù)作業(yè)指導(dǎo)書在相同溫度相同時(shí)間條件下判斷。

5）使用加樣器加樣，每測1個(gè)樣本要更換滴頭，在倍比稀釋待檢血清中，混勻時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡（混勻吸打都在第一檔進(jìn)行）而影響吸量準(zhǔn)確性。6）試劑盒于2～8℃避光保存。自檢定合格之日起有效期為2年。醛化紅細(xì)胞能耐60℃加熱，并可反復(fù)凍融不破碎，在4℃可保存3～6個(gè)月，在－20℃可保存一年以上。從冰箱取出使用時(shí)先要放室濕平衡一定時(shí)間。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范1基本原理

血吸蟲病患者血清中存在的抗血吸蟲抗體（IgG）與膠體染料標(biāo)記的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA)相結(jié)合，形成染料標(biāo)記的抗原—抗體復(fù)合物，這復(fù)合物通過層析技術(shù)與固定在硝酸纖維膜上的抗人IgG（二抗）相結(jié)合，形成可見的染色帶，即為陽性反應(yīng)。四、膠體染料試紙條法（DDIA）操作規(guī)程血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范2實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。2）實(shí)驗(yàn)試劑和器材檢查和擺放。要求試劑批號(hào)與有效期符合產(chǎn)品說明；器材符合相關(guān)質(zhì)量要求。3)檢查完畢后，按照實(shí)驗(yàn)常規(guī)要求擺布好實(shí)驗(yàn)試劑和器材。4）實(shí)驗(yàn)試劑和器材實(shí)驗(yàn)試劑盒：1.染料標(biāo)記液2.試紙條3.PVC小杯4.使用說明書器材：1.移液器50μl一支、吸頭、吸頭盒及移液器架等2.PVC小杯架、廢棄物杯3.實(shí)驗(yàn)記錄紙、記錄筆、記號(hào)筆5）要求：1待檢血清要新鮮，不能有溶血或混有紅細(xì)胞血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范3實(shí)驗(yàn)操作1）樣本編號(hào)1～n號(hào)，并從左到右按1～n號(hào)排列。2）取PVC小杯架子，裝上PVC小杯（下墊白紙）3）編號(hào)：橫向（行）（標(biāo)在小杯架子上）從左到右編號(hào)：1、2、3、……。做好相應(yīng)實(shí)驗(yàn)記錄。4）輕輕顛倒混勻染料標(biāo)記液，確保沉淀完全被混懸。5）調(diào)節(jié)移液器為50μl。根據(jù)樣品數(shù)每小杯加50μl染料標(biāo)記液至PVC小杯中。加液完畢，檢查每孔是否有漏加孔或加雙倍孔，并及時(shí)糾正。6）調(diào)節(jié)移液器為20μl。分別加20μl待檢血清（加血清時(shí)要核對(duì)一下樣本編號(hào)防止加錯(cuò)位），每個(gè)樣本緩緩混勻（吸打4次），混勻時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。整板樣本加完后，檢查每孔是否有漏加孔或加雙倍孔，并及時(shí)糾正。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范7）將整板放手上輕輕震蕩，加血清一分鐘（含混勻時(shí)間）后加試紙條。

8）取試紙條插入小杯中，待小杯內(nèi)反應(yīng)液吸干后觀察結(jié)果（15分鐘）。

9）在光線充足但非強(qiáng)光下觀察，正面面向試紙條觀察（陽性檢測帶一般

在對(duì)照帶下0.9cm處，插入杯底斜靠時(shí)一般在PVC小杯上沿略上處，防

止誤判），觀察結(jié)束放回原處，記錄結(jié)果。

10）實(shí)驗(yàn)臺(tái)面清理：未使用試劑、未使用吸頭、移液器（刻度復(fù)原至最高

檔）等放回原處；實(shí)驗(yàn)廢物放入規(guī)定的收集器內(nèi)。

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4要求1）標(biāo)記液混均要輕，倒置時(shí)沒有沉淀物后再顛倒2次；2）一個(gè)樣品一支吸頭；加血清時(shí)要集中注意力切不可漏加或跳管或重疊；3）取試紙條時(shí)，用手捏住吸水墊（較長的一端），嚴(yán)禁觸摸檢測膜或倒捏。4）試紙條一定要入杯底。5）試紙條面向自己排列整齊、一次放好，在結(jié)果觀察前嚴(yán)禁觸碰試紙條和小杯架，也不要做臺(tái)面清潔工作，防止試紙條頃倒；6）觀察結(jié)果時(shí)要注意光線、方向，不要刻意判斷，防止將“固相二抗”的折光誤判陽性。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范5結(jié)果判斷陽性反應(yīng)：1）檢測帶和對(duì)照帶都出現(xiàn)紫藍(lán)色帶。

2）檢測帶出現(xiàn)深紫藍(lán)色帶（反應(yīng)強(qiáng)），對(duì)照帶顯色減弱甚至不顯色。陰性反應(yīng)：對(duì)照帶出現(xiàn)紫藍(lán)色帶而檢測帶無顯色帶。無效：檢測帶和對(duì)照帶都不出現(xiàn)顯色帶。6儲(chǔ)存條件及有效期試劑盒保存于4-8℃，防止冷凍。有效期6個(gè)月。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范

五、酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)（ELISA）操作規(guī)程血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范1基本原理1)抗原（日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原SEA）以物理性地吸附于固相載體（聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板）表面（包被），并保持其免疫學(xué)活性；2)加待檢標(biāo)本（有相應(yīng)的特異性抗體）（一抗），即與固相上抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。3)加酶標(biāo)記的二抗形成Ag-Ab1-Ab2*HRP三聯(lián)復(fù)合物（第二抗體通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物---辣根過氧化物酶（HRP）－標(biāo)記結(jié)合物），而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；4)洗滌后加底物和顯色劑（H2O2的鄰苯二胺（OPD）或四甲基聯(lián)苯胺（TMB）），酶結(jié)合物中的酶再催化底物和顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生顯色反應(yīng)。5)根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范2實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。2)實(shí)驗(yàn)試劑和器材檢查和擺放。要求試劑批號(hào)與有效期檢查符合產(chǎn)品說明；器材符合相關(guān)質(zhì)量要求。3)檢查完畢后，按照實(shí)驗(yàn)常規(guī)要求擺布好實(shí)驗(yàn)試劑和器材。4）實(shí)驗(yàn)試劑盒(康百得)：1）預(yù)包被板（SEA預(yù)包被聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板）48T/96T2）酶結(jié)合物（1號(hào)液）（辣根過氧化物酶（HRP）－標(biāo)記結(jié)合物）1支3）洗滌液（2號(hào)液）1支4）底物（3號(hào)液）（四甲基聯(lián)苯胺（TMB））1支5）顯色劑（4號(hào)液）（H2O2）1支6）樣本稀釋液（5號(hào)液）1支7）終止液（6號(hào)液）（硫酸（H2SO4））1支8）陽性對(duì)照品（凍干品）1支9）臨界對(duì)照品（凍干品）1支10）陰性對(duì)照品（凍干品）1支11）使用說明書1份血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范5）實(shí)驗(yàn)器材：移液器20μl、100μl、1000μl各一支、200μl、1000μl吸頭及吸頭盒和移液器架樣品稀釋板酶標(biāo)板架塑料洗瓶（裝蒸餾水）恒溫水浴箱一臺(tái)吸水紙、廢棄物杯實(shí)驗(yàn)記錄紙、記錄筆、記號(hào)筆、剪刀6）血清樣本檢查，要求：1待檢血清要新鮮，不能有溶血或混有紅細(xì)胞或脂血或嚴(yán)重黃膽或已污染，

血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范3操作程序1）樣本編號(hào)：樣本編號(hào)1～n號(hào)，排列，并做好記錄。2）樣品稀釋板編號(hào)：選取一塊樣品稀釋板橫向平放縱向使用。橫向（行）從左到右編號(hào)：1、2、3、……..3）樣本稀釋：樣品稀釋板內(nèi)每孔加入樣本稀釋液（5號(hào)液）500μl，根據(jù)樣本數(shù)一次全部加完。分別加入待檢測血清5μl（待檢測血清按1：100稀釋），充分混勻（吸打4次）。4）陰性、臨界、以及陽性對(duì)照每支加入300μl蒸餾水復(fù)溶，充分溶解后放置樣品稀釋板邊以陰性、臨界、陽性對(duì)照品排列。5）加樣反應(yīng)：取預(yù)包被板放入板架內(nèi)，安好，標(biāo)記好或安排好樣品與對(duì)照位置，并做好記錄。樣本檢測孔第1-n孔每孔分別加已稀釋樣本血清100μl，取樣時(shí)要將樣品吸打幾次混均后再吸。每板最后依次為陰性、臨界、陽性及空白對(duì)照孔，分別加入復(fù)溶后的陰性、臨界、陽性對(duì)照液及樣本稀釋液（5號(hào)液）各100μl。6）置37℃水浴箱避光反應(yīng)30分鐘后甩去孔內(nèi)液體。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范7）洗滌：每孔加洗滌液（2號(hào)液）1滴(滴瓶垂直加液，下同)，立即用蒸餾水注滿（首次加蒸餾水時(shí)盡量不要溢出孔外，以免抗體溢出到臨孔），靜置30秒后甩去，再直接用蒸餾水洗滌四次，每次均需靜置30秒。最后一次甩去拍干。8）加酶反應(yīng):

除空白對(duì)照孔外其余每孔加酶結(jié)合物（1號(hào)液）2滴，置37℃水浴箱避光反應(yīng)30分鐘后甩去孔內(nèi)液體，如上洗滌，拍干（關(guān)健操作：要洗滌到位并拍干，否則可能產(chǎn)生假陽性）。9）顯色反應(yīng)：加底物（3號(hào)液）1滴。加顯色劑（4號(hào)液）1滴，混勻（輕輕敲打）。置37℃水浴箱避光顯色10分鐘。初步觀察，做好預(yù)記錄。加終止液（6號(hào)液）1滴，混勻，終止反應(yīng)（加終止液后藍(lán)色會(huì)變?yōu)辄S色，無色的仍然無色）。置白紙上觀察結(jié)果。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4結(jié)果判斷1）肉眼觀察：空白無色，陰性對(duì)照無色或接近無色，臨界對(duì)照呈淺黃色，陽性對(duì)照呈明顯黃色，表示實(shí)驗(yàn)有效。待檢孔無色或呈淺于臨界對(duì)照孔的微黃色表示該標(biāo)本為陰性，待檢孔呈深于臨界對(duì)照空的黃色表示該標(biāo)本為陽性。2）儀器判斷：以空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀于450nm（TMB）（620nm作參比波長）讀取OD值，待檢孔OD值大于陰性對(duì)照P/N≥2.1倍者為陽性。當(dāng)陰性對(duì)照OD值低于0.05時(shí)按0.05計(jì)算。3）結(jié)果記錄血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范結(jié)果判斷目測判讀結(jié)果B1-7,10-11,D1-2為正常血清，B8、9,12及D3、4為血吸蟲病人血清；D5陰參，D6臨界，D7陽參，D9空白病人血清陰參臨界陽參正常人血清31血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范結(jié)果判斷加2MH2SO4后32血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范ELISA結(jié)果B1-7,10-11,D1-2為正常血清，B8、9,12及D3、4為血吸蟲病人血清；D5陰參，D6臨界，D7陽參，D9空白測定OD值33血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范5注意事項(xiàng)1）試劑盒在2-8℃保存，冰凍失效、溫度過高保存活性降低。每次取出時(shí)先平衡至室溫后使用。滴瓶每次用后一定要將蓋擰緊，各瓶蓋之間切不可混用。各試劑盒之間不可混用。2）洗滌時(shí)將蒸餾水加滿孔內(nèi)，每次停放30秒鐘后，甩去孔內(nèi)液體。禁用自來水等其他水源。3）為提高實(shí)驗(yàn)的可比性建議使用儀器判讀結(jié)果，并對(duì)陰性對(duì)照測復(fù)孔以減少誤差。4）洗滌要徹底，特別是酶結(jié)合物反應(yīng)后，洗滌一定要充分；5）OPD對(duì)光非常敏感，應(yīng)避光反應(yīng)；結(jié)果應(yīng)盡快檢測6）酶標(biāo)反應(yīng)均應(yīng)在濕盒中進(jìn)行。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范六、斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）操作規(guī)程血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范1試驗(yàn)原理

將抗原（日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原SEA）包被于硝酸纖維素薄膜(微孔濾膜)上,滴加在膜上的待檢血清通過濾膜時(shí)，其中的抗體與膜上的抗原相接觸，起到親和層析的濃縮，形成抗原抗體復(fù)合物。然后，紅色膠體金顆粒標(biāo)記的第二抗體所形成的金標(biāo)探針，與復(fù)合物中的抗體結(jié)合，滯留在反應(yīng)板上，形成肉眼可見的紅色斑點(diǎn)。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范3實(shí)驗(yàn)操作準(zhǔn)備1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。2)實(shí)驗(yàn)試劑和器材檢查和擺放。要求試劑批號(hào)與有效期檢查符合產(chǎn)品說明；器材符合相關(guān)質(zhì)量要求。3)檢查完畢后，按照實(shí)驗(yàn)常規(guī)要求擺布好實(shí)驗(yàn)試劑和器材。4）實(shí)驗(yàn)試劑盒：1）預(yù)處理空白反應(yīng)板(含質(zhì)控點(diǎn))2）洗滌液3）金標(biāo)抗體液4）使用說明書5）器材：1.移液器50μl、200μl吸頭、吸頭盒及移液器架2.實(shí)驗(yàn)記錄紙、記錄筆、記號(hào)筆。6）被檢樣血清檢查，要求：本方法對(duì)待檢血清要求高，要仔細(xì)檢查，詳見注意事項(xiàng)。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范4操作程序1）將試劑盒、試劑取出，置予室溫下平衡2）樣本編號(hào)：樣本編號(hào)1～n號(hào)，從左到右按1～n號(hào)排列，并作好記錄。3）取n塊預(yù)處理空白反應(yīng)板(含質(zhì)控點(diǎn))放好并編號(hào)。4）按順序每次取2塊板，依次在反應(yīng)孔中間位置加入2滴洗滌液，待液體完全滲透5）依次在每塊板反應(yīng)孔正中間垂直加入25μl新鮮特檢血清（對(duì)應(yīng)編號(hào)），待血清完全滲透。（關(guān)健操作：1、如沒完全滲透就加液可呈假陰性，但過干后再加液則呈假陽性。2、完全滲透的標(biāo)準(zhǔn)是膜上特別是孔周邊折光液體消失）血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范6）依次在每塊板加入2滴洗滌液，待液體完全滲透。7）依次在每塊板加入4滴金標(biāo)抗體液，待液體完全滲透。8）依次在每塊板加入2滴洗滌液，待液體完全滲透，觀察結(jié)果。9）按順序取下一輪2塊板，同上進(jìn)行第3和第4份、第5和第6份、……樣本檢測。10）樣品全部檢測完成后復(fù)查結(jié)果（但必須控制在1小時(shí)內(nèi)），并記錄。11）清理臺(tái)面，移液器調(diào)至最高檔。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范5結(jié)果判斷

判斷結(jié)果的時(shí)間應(yīng)以完成操作后，即時(shí)觀察為準(zhǔn)。部分品種在放置數(shù)小時(shí)或1日后，結(jié)果會(huì)發(fā)生變化1）出現(xiàn)兩個(gè)紅色圓點(diǎn)為陽性；2）出現(xiàn)一個(gè)紅色圓點(diǎn)為陰性；3）無圓點(diǎn)（呈白板狀）表示試劑失效或操作有誤，應(yīng)當(dāng)重新測試血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范6注意事項(xiàng)1）本試驗(yàn)對(duì)血清標(biāo)本要求高，最好應(yīng)用新鮮血清。測定血清標(biāo)本要求離心分離以消除血脂的影響(4000轉(zhuǎn)／分，15分鐘或8000轉(zhuǎn)l／分，5分鐘)，不宜用未稍采血（塑料管法）樣本。吸取血清標(biāo)本時(shí)，應(yīng)避開血脂、纖維蛋白或沉淀等，取其清亮透明部分。2）試劑盒從冰箱取出后應(yīng)恢復(fù)至室溫才能使用，試劑盒最佳使用溫度是30～37℃。3）以2個(gè)樣本為一批依次進(jìn)行操作。血清樣品加樣時(shí)，應(yīng)在反應(yīng)孔的正上方垂直加樣。4）待反應(yīng)板上的液體完全滲透后，立即加入下一種液體。既要防止?jié)B透不全，又須避免反應(yīng)膜干枯（是本試驗(yàn)操作的關(guān)鍵）。在加液時(shí)應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，尤其是金標(biāo)液。5）判斷結(jié)果以即時(shí)觀察為準(zhǔn)．若較長期保存，將反應(yīng)板正面朝下放置即可。6）于2-8℃冷藏保存，切勿冷凍應(yīng)當(dāng)避免強(qiáng)烈光照和高溫。檢測完畢后,未用的反應(yīng)板要立即放入自封袋中密閉冷藏。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)規(guī)范七、移液器的使用規(guī)程1量程的調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)量程時(shí)，逆時(shí)針或順時(shí)針按照正常的調(diào)節(jié)方法，旋轉(zhuǎn)旋鈕即可;在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否則會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)