實驗細菌革蘭氏染色法第一頁，共15頁。課前提問與目的要求【課前提問】1.油鏡的特點及使用范圍是什么？2.革蘭氏染色的原理是什么？【目的要求】1.學習并掌握油鏡的原理和使用方法；2.了解革蘭氏染色原理；3.學習并掌握革蘭氏染色的方法。第二頁，共15頁。【基本原理】1.油鏡提高分辨率油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間是隔一層油質。如香柏油的折射率n=1.52，與玻璃相同。光線通過不減低視野的照明度；更主要能增加數(shù)值孔徑，提高顯微鏡的放大效能。分辨率=λ/2NAλ=光波波（物鏡的數(shù)值孔徑值）NA=n×sinαα=鏡口角的半數(shù)可知n（介質折射率）對提高顯微鏡的分辯力起著關鍵性的作用。第三頁，共15頁。2.革蘭氏染色革蘭氏染色法可將細菌分成革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）兩種類型，細菌對革蘭氏染色的不同反應是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。首先利用草酸銨結晶紫初染，所有細菌都會著上結晶紫的藍紫色。然后利用盧戈氏碘液作為媒染劑處理，由于碘與結晶紫形成碘-結晶紫復合物，增強了染料在菌體中的滯留能力。之后用95%乙醇作為脫色劑進行處理時，兩種細菌的脫色效果不同。【基本原理】第四頁，共15頁。革蘭氏陽性細菌細胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂質含量低，肽聚糖本身并不結合染料，但其所具有的網(wǎng)孔結構可以滯留碘-結晶紫復合物，現(xiàn)在一般認為乙醇處理可以使肽聚糖網(wǎng)孔收縮而使碘-結晶紫復合物滯留在細胞壁，菌體保持原有的藍紫色。而革蘭氏陰性細菌細胞壁肽聚糖含量低，交聯(lián)度低，壁薄且脂質含量高，乙醇處理時脂質溶解，細胞壁通透性增加，原先滯留在細胞壁中的碘-結晶紫復合物容易被洗脫下來，菌體變?yōu)闊o色，用復染劑（如番紅）染色后又變?yōu)閺腿緞╊伾t）?！净驹怼康谖屙?，共15頁。圖4-1革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞壁比較第六頁，共15頁?！緦嶒炗闷贰烤N：大腸桿菌16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)物。試劑：革蘭氏染液，草酸銨結晶紫染液，盧戈氏（Lugol）碘液，95%乙醇，番紅復染液等。儀器和其他用品：酒精燈，載玻片，顯微鏡，雙層瓶（內裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，接種環(huán)，試管架，鑷子，載玻片夾子，載玻片支架，濾紙，滴管和無菌生理鹽水等。第七頁，共15頁。【方法步驟】1.涂片：將大腸桿菌（16h）和金黃色葡萄球菌（16h）分別涂片、干燥、固定。2.染色：1）初染：加草酸銨結晶紫一滴（以剛好將菌膜覆蓋為宜），染色1～2min后傾去染液，水洗至流出水無色；2）媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min，傾去碘液，水洗至流出水無色。3）脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水（從邊緣吸，以防擦去菌體），將玻片傾斜，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約20～30秒，立即用水沖去乙醇；第八頁，共15頁?！痉椒ú襟E】4）復染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復染液染色2min，水洗，吸去殘水晾干（圖4-1）。3.鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細菌顏色為準，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4.混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。菌齡和脫色程度對染色結果影響較大。第九頁，共15頁?！痉椒ú襟E】A.初染B.水洗C.媒染D.水洗E.脫色F.水洗G.復染H.水洗I.吸干圖4-1革蘭氏染色程序第十頁，共15頁?！痉椒ú襟E】獲得本實驗成功的關鍵：1）選用活躍生長期菌種染色，老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成假陰性。2）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性。3）脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵，脫色不夠造成假陽性，脫色過度造成假陰性。第十一頁，共15頁?！緦嶒灲Y果】圖4-2大腸桿菌染色結果圖4-3大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合染色結果第十二頁，共15頁?！咀⒁馐马棥客科灰诉^厚，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。加熱時使用載玻片夾子及試管夾，以免燙傷。使用染料時注意避免沾到衣物上。使用乙醇脫色時勿靠近火焰。實驗后洗手。第十三頁，共15頁?！緦嶒瀳蟾妗?.結果1）繪出油鏡下觀察的混合區(qū)菌體圖像。2）填表菌名菌體顏色細菌形態(tài)結果（G+,G-）大腸桿菌金黃色葡萄球菌表4-1結果記錄表第十四頁，共15頁。2.思考題1）革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？2）現(xiàn)有一株未知桿菌，個體明顯大于大腸桿菌，請你鑒定