設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物方法科研經(jīng)驗(yàn)|文獻(xiàn)

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國自然作者：Lemon轉(zhuǎn)載請注明：解螺旋·臨床醫(yī)生科研成長平臺(tái)實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室最常用的實(shí)驗(yàn)。研究基因在mRNA表達(dá)水平,以及驗(yàn)證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。對于新手來說，如何快速設(shè)計(jì)引物呢？首先，推薦三個(gè)在線設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的網(wǎng)站，不用安裝軟件，直接上網(wǎng)就可搞定。一、Primerbank1.

首先進(jìn)入網(wǎng)站主頁，/primerbank/。選擇Keyword,根據(jù)自己需求選擇種屬以及基因名稱。比如設(shè)計(jì)人類BCL2基因。2.點(diǎn)擊submit后可以看到以下界面，網(wǎng)站會(huì)推薦多對引物，可以根據(jù)引物長度、Tm值選擇。二、Pubmed1.在Pubmed網(wǎng)站找到BCL2基因組序列，點(diǎn)擊FASTA獲得基因序列后，將基因序列下載到桌面上。2．點(diǎn)開pubmed主頁上面的Blast,進(jìn)入Primer-BLAST,輸入基因序列，可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)要求選擇引物長度。3．點(diǎn)擊Getprimer之后，可以得到多對引物序列?？梢愿鶕?jù)引物長度等要求進(jìn)行篩選。三、Primerplus31.在Pubmed-gene獲得基因序列后，在primer3plus主頁上輸入基因序列，網(wǎng)址;/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。2.點(diǎn)擊generalsetting,設(shè)置引物擴(kuò)增長度，一般可設(shè)置擴(kuò)增長度偏大一些，然后根據(jù)推薦引物選取合適擴(kuò)增長度。3.點(diǎn)擊pickprimers后，首先會(huì)看到優(yōu)選推薦的一對引物，同時(shí)在序列中看到引物所在位置。Primer3plus網(wǎng)站中可以看到引物Tm值以及GC含量。

最后簡單介紹一下實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則：（1）引物長度一般在15~30堿基之間，過長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。（2）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計(jì)算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值。（3）引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。（4）引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則