丙酮酸激酶(PK)活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理丙酮酸激酶（PyruvateKinase,PK,EC0）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化糖酵解過(guò)程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過(guò)程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測(cè)定PK活性具有重要意義。CheKine?丙酮酸激酶(PK)活性檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)生物樣本，如血清（漿）、動(dòng)物組織、細(xì)胞及細(xì)菌樣本中PK的活性。PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下測(cè)定NADH下降速率，即可反映PK活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·恒溫箱、低溫離心機(jī)·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。SubstrateMixWorkingReagent：臨用前配制，48T的SubstrateMix瓶中加入10.2mLAssayBuffer和0.6mL去離子水充分溶解，在96T的SubstrateMix瓶中加入20.4mLAssayBuffer和1.2mL去離子水充分溶解，溶解以后分裝，-20℃可保存6個(gè)月，避免反復(fù)凍融。LDHWorkingReagent：臨用前配制，在48T的LDH中加入0.6mL去離子水充分混勻，在96T的LDH中加入1.2mL去離子水充分混勻，稀釋后4℃可保存1個(gè)月，冰上放置備用。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。動(dòng)植物組織樣本：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。細(xì)胞、細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞或細(xì)菌，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。血清等液體的準(zhǔn)備：直接測(cè)定。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。該試劑盒提取的樣本也可以適用于KTB1251、KTB1341的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。SubstrateMixWorkingReagent置于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）孵育5min。96孔UV板或微量石英比色皿中加入10μL樣本，10μLLDHWorkingReagent和180μLSubstrateMixWorkingReagent，迅速混勻。用酶標(biāo)儀在340nm下測(cè)定20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.005，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到5min或10min或者適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA大于1.0，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下血清（漿）中PK活力的計(jì)算:單位的定義：每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。PK(U/mL)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=3,215×ΔA組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PK活力的計(jì)算:（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。PK(U/mgprot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=3,215×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。PK(U/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=3,215×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。PK(U/104)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=3215×ΔA÷500=6.431×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；109：1mol=1×109nmol；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，5×106。使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1110CheK