胰蛋白酶活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外，胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。CheKine?胰蛋白酶活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動植物組織生物樣本。在該試劑盒中，胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致溶液的pH值降低，以苯酚紅為指示劑，測定溶液在555nm處吸收值的變化，可以快速測得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測555nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。WorkingReagent：臨用前配制；根據(jù)用量按照ReagentⅠ（V）：ReagentII（V）：去離子水（V）：ReagentIII（V）=1mL：1mL：5.4mL：0.4mL的比例充分混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。用多少配多少，在空瓶中配制，48T中帶有2個(gè)空瓶，96T中帶有4個(gè)空瓶。注意：ReagentII有一定的刺激性，建議在使用過程中做好個(gè)人防護(hù)。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到555nm，可見光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：試劑測定孔（μL）樣本5WorkingReagent195混勻后立即測定，記錄555nm下1min時(shí)的吸光值A(chǔ)1和2min時(shí)的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算△A=A1-A2。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長到5min。如果ΔA大于0.5，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。胰蛋白酶活性的計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位。胰蛋白酶(U/mgprot)=ΔA×V反總÷(Cpr×V1)÷0.5÷T=80×ΔA÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：室溫下每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位。胰蛋白酶(U/g鮮重)=ΔA×V反總÷(W×V1÷V2)÷0.5÷T=80×ΔA÷WCpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：組織質(zhì)量，g；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積，5μL=0.005mL；V2：粗酶液總體積，1mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠脾臟和玉米種子中胰蛋白酶的活性相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB2270CheKine?酸性蛋白酶（ACP）