乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理乙酰輔酶A羧化酶（AcetylCoACarboxylase，ACC）在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。CheKine?乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒（微量法）可檢測動(dòng)植物組織，細(xì)菌和細(xì)胞、血清或血漿等生物樣本。在該試劑盒中，ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機(jī)磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機(jī)磷的增加量來測定ACC活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)（能測660nm處的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭、1.5mL離心管·水浴鍋、低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器或研缽（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：臨用前配制；48T加入5mLReagentⅠ，96T加入10mLReagentⅠ，充分溶解，4℃避光保存可穩(wěn)定1個(gè)月。ReagentIII：臨用前配制；48T加入4mL去離子水，96T加入8mL去離子水，充分溶解，用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。ReagentIV：臨用前配制；48T加入5mL去離子水，96T加入10mL去離子水，充分溶解，4℃避光保存可穩(wěn)定1周。ReagentV：臨用前配制；48T加入5mL去離子水，96T加入10mL去離子水，充分溶解，4℃避光保存可穩(wěn)定1周。ReagentVI：即用型；室溫保存。注意：ExtractionBuffer有毒且有刺激性氣味，ReagentVI具有腐蝕性，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。WorkingReagent：按去離子水：ReagentIV：ReagentV：ReagentVI=2：1：1：1的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。Standard：即用型；10μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液，使用前，平衡到室溫。4℃保存。0.5μmol/mLStandard：取50μLStandard加950μL去離子水，充分混勻。注意：每次實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用新配制的標(biāo)準(zhǔn)品；配制好的標(biāo)準(zhǔn)品需要在4h之內(nèi)使用。樣本制備注意：建議使用新鮮樣本。如果不立即使用，可將樣品在-80℃下保存一個(gè)月。測定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。細(xì)菌和細(xì)胞：收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)菌或細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞30次（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s），然后8,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接檢測。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見光分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到660nm，可見光分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。將ReagentⅠ、II、III在37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）預(yù)熱10min。操作表（下述操作在1.5mL離心管中操作）：試劑空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）測定孔（μL）對(duì)照孔（μL）樣本001010ReagentⅠ00090ReagentII00500ReagentIII0040037℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，90℃滅活5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10,000g，25℃離心5min，取上清。以下操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作：上清液0020200.5μmol/mLStandard02000去離子水20000WorkingReagent180180180180充分混勻，37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃（其它物種）孵育30min后，冷卻至室溫，記錄660nm處吸光值，空白孔記為A空白，標(biāo)準(zhǔn)孔記為A標(biāo)準(zhǔn)，測定孔記為A測定，對(duì)照孔記為A對(duì)照。計(jì)算ΔA測定=A測定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次，每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測定小于0.04可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測定大于1.5，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。ACC活性的計(jì)算按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每毫克蛋白每小時(shí)產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量定義為一個(gè)酶活力單位。ACC(U/mgprot)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr按樣本鮮重計(jì)算：酶活單位定義：每克樣本每小時(shí)產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量定義為一個(gè)酶活力單位。ACC(U/g鮮重)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活單位定義：每104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量定義為一個(gè)酶活力單位。ACC(U/104)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(n×V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷n按樣本體積計(jì)算：酶活單位定義：每毫升液體每小時(shí)產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。ACC(U/mL)=C標(biāo)準(zhǔn)×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V反總÷(V樣÷V樣總)÷T=10×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，0.5μmol/mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.1mL；V樣：加入的樣本體積，0.01mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min=0.5h；n：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì)；W：樣本質(zhì)量，g。注意事項(xiàng)配制WorkingReagent最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。配好的WorkingReagent應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染。顯色結(jié)束后應(yīng)立即檢測，最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果展示以下數(shù)據(jù)僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測。Figure1.本試劑盒測定小鼠腦和煙草葉