動物實驗技術(shù)基本技能訓(xùn)練主講人：王千慧，劉金鵬（佰昊生物）項目六實驗動物安死術(shù)與解剖、取材任務(wù)一大/小鼠安死術(shù)的實施與樣本取材與人類“替難者”的告別實驗動物是人類的“替難者”，它們?yōu)槿祟惿】滇t(yī)療、科技文明進(jìn)步做出了卓越的貢獻(xiàn)；安樂死(euthanasia)詞源于古希臘語，eu意思是“好的”，thanatos意思是“死亡”；安樂死是指公眾認(rèn)可的、以人道主義的方法處死實驗動物的過程，即采用一種降低或消除痛苦和焦慮的方法來結(jié)束單個動物的生命。課程目標(biāo)知識目標(biāo)了解常見實驗動物安死術(shù)方法、種類，掌握大/小鼠脫臼處死的操作要領(lǐng)與注意事項；技能目標(biāo)在盡可能降低實驗動物傷害的基礎(chǔ)上，能獨(dú)立、標(biāo)準(zhǔn)采用脫臼法對大/小鼠進(jìn)行處死；熟悉大/小鼠解剖生理學(xué)特點(diǎn)，掌握取材與組織固定原則，能按照要求快速完成大/小鼠組織取材、修剪與固定；素質(zhì)目標(biāo)珍愛生命、敬畏生命；能根據(jù)具體動物種類、實驗需求，選擇合理、合適的處死方式；熟悉實驗動物生理解剖學(xué)特點(diǎn)，能快速、準(zhǔn)確對實驗動物進(jìn)行樣本取材與固定，為下一模塊“病理技術(shù)訓(xùn)練”提供實驗材料、奠定基礎(chǔ)。一、安死術(shù)安死術(shù)：以迅速造成動物意識喪失而至身體、心理痛苦最小之處死動物的方法01（1）處死動物是對動物福利的最終剝奪，對必須處死的動物應(yīng)實施安死術(shù)；（2）應(yīng)有明確的政策規(guī)定對動物實施安死術(shù)的時機(jī)、方案和方式，應(yīng)經(jīng)過IACUC（動物管理和使用委員會）的審核；（3）選擇安樂死的藥物與方法的原則：避免動物在死亡之前處于疼痛、焦慮、恐懼、應(yīng)激等不良狀態(tài)；縮短動物從失去知覺直至死亡所耗費(fèi)的時間；安樂死藥物與方法的可靠性；對操作人員的安全性；不可逆性；對操作和觀察人員情緒上的影響；對不同品種、年齡與健康狀態(tài)的動物的適合性；對不同實驗需求和目的的適合性；設(shè)備的獲取及維護(hù)的便利性；對環(huán)境的影響；人濫用藥物的潛在危害性《實驗動物機(jī)構(gòu)質(zhì)量和能力的通用要求》(GB/T27416-2014)，國家標(biāo)準(zhǔn)|GB/T27416-2014()

）動物實驗人道終點(diǎn)的確定是科學(xué)目的與動物福利相權(quán)衡的結(jié)果；如何科學(xué)合理地確定動物實驗的人道終點(diǎn),在實現(xiàn)研究目的的同時,最大程度地減輕實驗動物所承受的疼痛和痛苦,是動物使用計劃中一項重要的工作。人道終止時機(jī)也稱人道終止點(diǎn)：考慮人道對待動物的要求和實驗要求，合理終止動物用于實驗的時機(jī)。二、人道終止時機(jī)人道終止時機(jī)的重要意義：01大家來思考02（1）何時為“最佳終止點(diǎn)”？在盡可能降低實驗動物傷害的基礎(chǔ)上，能獨(dú)立、標(biāo)準(zhǔn)采用脫臼法對大/小鼠進(jìn)行處死；熟悉大/小鼠解剖生理學(xué)特點(diǎn)，掌握取材與組織固定原則，能按照要求快速完成大/小鼠組織取材、修剪與固定；（2）人道終止時機(jī)設(shè)定的目的是什么？為體現(xiàn)動物實驗中的福利及“3R”原則，“優(yōu)化”動物實驗策略，給與實驗動物人道主義關(guān)愛，設(shè)置“人道終點(diǎn)”，幫助判斷安樂死時機(jī)，予以動物合理的死亡節(jié)點(diǎn)，幫助動物減少臨終疼痛和應(yīng)激。（3）什么樣的實驗動物適用人道終止時機(jī)？當(dāng)研究的科學(xué)目標(biāo)已達(dá)到，實驗沒必要繼續(xù)進(jìn)行下去；當(dāng)動物遭受意外的痛苦；意外的痛苦是指：該痛苦不是由實驗本身引起的，且是實驗開始前未預(yù)料到的；實驗開始前預(yù)料到動物會遭受這種痛苦，但實際中遭受的痛苦比預(yù)料得更嚴(yán)重；動物遭受的疼痛/痛苦由實驗本身引起，并在實驗開始前就預(yù)料到。評價指標(biāo)包括通用指標(biāo)和特定研究的指標(biāo)；動物實驗評估人員根據(jù)實驗特點(diǎn)，選擇合適的指標(biāo)，以充分反映動物實驗過程中所承受的疼痛、痛苦、疾病、焦慮等指標(biāo)，作為評價指標(biāo)。通用指標(biāo)指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)體重下降快速失去體重失去體重的10-20%生長期動物持續(xù)無增重長期無增重未檢測體重但動物呈現(xiàn)惡病質(zhì)及持續(xù)性肌肉消耗時肌肉持續(xù)性消耗、消瘦喪失食欲小型嚙齒類動物完全喪失食欲或食欲不佳食欲低于正常量之50%，喪失食欲達(dá)24小時；食欲不佳達(dá)3天及以上大動物完全喪失食欲或食欲不佳食欲低于正常量之50%，喪失食欲達(dá)5天；食欲不佳達(dá)7天及以上虛弱無法自行攝食或飲水無自主飲食長期無法站立或極度勉強(qiáng)才可站立達(dá)24小時（需先排除是否為麻醉后動物蘇醒期，再評估是否因疾病或?qū)嶒灥纫蛩貙?dǎo)致動物虛弱）身體器官感染呈現(xiàn)物理性指標(biāo)及異常的血檢值對藥物治療無良好反應(yīng)且持續(xù)演變?yōu)槿硇约膊〈顾?瀕死動物在沒有麻醉或鎮(zhèn)靜的狀態(tài)下，表現(xiàn)精神抑郁伴隨體溫過低明顯精神抑郁，對呼喊驅(qū)趕無反應(yīng)或具備反應(yīng)但無法自由活動，體溫持續(xù)低于37℃器官系統(tǒng)衰竭出現(xiàn)嚴(yán)重的器官系統(tǒng)功能障礙的臨床癥狀且治療無效經(jīng)獸醫(yī)（資質(zhì)人員）判斷器官系統(tǒng)衰竭、預(yù)后不佳其他持續(xù)性的自殘行為；嚴(yán)重影響動物進(jìn)食飲水病癥、傳染性病末期不愈合的傷口；持續(xù)性低溫、明顯的器官及五官功能損傷動物遭受窘迫及疼痛時的行為及生理現(xiàn)象（2）特定指標(biāo)特定指標(biāo)指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)腫瘤腫瘤生長體積過大生長超過動物原體重的10%，平均腫瘤直徑在小鼠超過15mm、在大鼠超過30mm腫瘤破潰腫瘤轉(zhuǎn)移或快速增長至潰爛，造成感染或壞死等呼吸道系統(tǒng)嚴(yán)重呼吸道感染呼吸困難、發(fā)紺循環(huán)系統(tǒng)嚴(yán)重貧血、無法控制的出血紅細(xì)胞比積（PCV）低于正常值的15%黃疸癥狀消化道系統(tǒng)疾病或?qū)嶒炘斐上绬栴}嚴(yán)重持續(xù)性嘔吐或下痢、阻塞、暢套迭、腹膜炎、腹圍擴(kuò)大等泌尿生殖系統(tǒng)泌尿生殖系統(tǒng)疾病腎衰竭、腹腔積水等肌肉骨骼系統(tǒng)肌肉損傷、骨骼受損等四肢無法站立行走或自主運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)異常的中樞神經(jīng)反應(yīng)抽搐、顫抖、癱瘓、歪頭等，無法有效控制疼痛人道終點(diǎn)評價指標(biāo)03（1）通用指標(biāo)三、大/小鼠等實驗動物常見處死方法頸椎脫臼法：01是將實驗動物的頸椎脫臼，離斷脊髓后致死，為大、小鼠最常用的處死方法（1）操作方法：用右手抓住鼠尾根部并將其提起，放在鼠籠蓋或其他粗糙面上；用左手拇指、食指用力向下按壓鼠頭及頸部，右手抓住鼠尾根部用力拉向后上方，造成頸椎脫臼；脊髓與腦干斷離，實驗動物立即死亡。（2）優(yōu)點(diǎn)：能使動物快速失去意識，執(zhí)行時間短，無化學(xué)藥物影響機(jī)體組織（3）可能造成執(zhí)行者的心理負(fù)擔(dān)。如操作手法不熟練，可無法使動物迅速死亡，反而對動物造成極大的痛苦過量麻醉處死法：02過量麻醉處死法可采用吸入性麻醉劑如異氟烷、七氟烷，也可采用非吸入性麻醉劑如巴比妥類麻醉劑等；目前常用吸入性麻醉劑對實驗動物實施安死術(shù)。（1）吸入性藥物通過汽化器或密閉容器進(jìn)入動物體內(nèi)，因此須具有相關(guān)的設(shè)備，密閉容器應(yīng)透明以便觀察動物。大部分情況下，動物快速暴露于高濃度藥物中時可快速失去知覺；（2）優(yōu)勢：對于體重小于7公斤或難以注射的動物具有良好適用性；氟烷、異氟烷、恩氟烷和七氟烷在一般環(huán)境條件下無易燃易爆性；小動物處死時建議以低濃度誘導(dǎo)麻醉后轉(zhuǎn)入高濃度（5%），使動物迅速失去意識；（3）缺點(diǎn)：由于汽化的麻醉劑有刺激性，麻醉誘導(dǎo)期動物可能出現(xiàn)掙扎及焦慮二氧化碳吸入處死法03二氧化碳實驗動物處死是一種常用的實驗室動物安樂死方法，其原理是利用二氧化碳濃度過高導(dǎo)致動物窒息，最終導(dǎo)致死亡。該方法操作簡單、成本低廉、對實驗結(jié)果影響小，因此被廣泛應(yīng)用于實驗室動物的安樂死操作中（1）二氧化碳處死法操作流程：準(zhǔn)備材料：待安樂死的動物、安樂死箱、有通氣孔的密閉式上蓋、二氧化碳（CO2）鋼瓶；放入動物前，不可先灌注CO2到安樂死箱內(nèi)；放入動物，以每分鐘替換安樂死箱容積的10-30%的速度灌注CO2于箱內(nèi)，確定動物不動、不呼吸、瞳孔放大。關(guān)閉CO2；再觀察2分鐘，確定動物死亡。（2）優(yōu)點(diǎn)：快速鎮(zhèn)靜、止痛、麻醉效果明顯；高壓瓶裝二氧化碳容易獲取，容易使用、價格便宜，無易燃易爆危險，無異味，在通風(fēng)良好的場所配合適當(dāng)設(shè)備使用時，較其他藥物安全性更高。（3）使用注意事項：應(yīng)根據(jù)動物品種選用本法實施安樂死；高壓瓶裝的二氧化碳是唯一建議使用的設(shè)備，不推薦使用干冰或其他化學(xué)方法制造二氧化碳；動物裝入容器內(nèi)時，不可過度擁擠，且不可同時混入不同品種的動物；以低濃度誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)入高濃度，使動物迅速失去意識；當(dāng)動物呈現(xiàn)死亡狀態(tài)后再持續(xù)灌注氣體至少數(shù)分鐘，將動物從安樂死容器內(nèi)取出前必須確認(rèn)動物死亡；如動物未死亡，則立即使用其他方法（如頸椎脫臼、斷頭、開胸）對動物進(jìn)行安樂死。斷頭法：04此方法僅適用于對小型嚙齒類動物或仔兔的安樂死。此方法保證組織或體液無化學(xué)藥物干擾，也可提供完整的腦部組織以供研究。斷頭后動物雖呈現(xiàn)約13-14s的腦部活性，但研究表明此時已無疼痛反應(yīng)的傳導(dǎo)，動物迅速失去意識（1）優(yōu)點(diǎn)：使動物快速失去意識，無化學(xué)藥物污染生物組織；（2）缺點(diǎn)：抓取及保定動物至斷頭臺可能導(dǎo)致動物緊張，也易造成操作人員的不適感，因此需接受完整的技術(shù)培訓(xùn)（3）操作注意事項：使用本方法進(jìn)行動物安樂死時，須具備科學(xué)研究的必要性，由實驗動物倫理福利委員會批準(zhǔn)后方可執(zhí)行；需注意保持?jǐn)囝^臺刀刃的鋒利度，每次使用后徹底清洗殘留的血跡和氣味；操作人員保定動物的手法需輕柔，快速將頭頸連接處砍斷急性失血法：05對于已經(jīng)失去意識或擊暈后的動物，配合放血方法可確保動物完全死亡；由于大量失血，動物會表現(xiàn)出焦慮和痛苦，因此放血不可作為安樂死的單一方法；如因研究所需采集動物血液，必須先擊暈或麻醉動物后執(zhí)行，且避免放血不完全導(dǎo)致動物蘇醒。此外還有空氣栓塞法、擊打法、化學(xué)試劑處死法06大/小鼠可采用頸動脈、腹主動脈放血方式進(jìn)行處死四、執(zhí)行安樂死前后的注意事項1、避免造成存活動物的恐懼動物的應(yīng)激性叫聲和驚恐行為、或令動物驚恐的氣味等，都會引起動物的焦慮、不安和應(yīng)激，這些因素會影響存活動物的身心健康和福利，干擾實驗結(jié)果。因此，動物安樂死時應(yīng)在遠(yuǎn)離存活動物的非公開場所執(zhí)行。2、安樂死設(shè)備執(zhí)行安樂死所用的藥物與儀器設(shè)備，應(yīng)隨時保持最佳的使用狀態(tài)。依據(jù)動物品種、體重及數(shù)量，事先準(zhǔn)備好足量的藥物與設(shè)備儀器，并定期維護(hù)。動物安樂死時被血液、糞尿污染的器具應(yīng)及時清洗消毒，一面造成其他安樂死前動物的焦慮。3、輔助安樂死的方法動物安樂死首要考慮解除動物臨死前的痛苦與焦慮，因此對于精神亢奮或難以控制的動物，應(yīng)先給予相應(yīng)的鎮(zhèn)靜劑或止疼藥后再對其執(zhí)行安樂死。四、執(zhí)行安樂死前后的注意事項4、確認(rèn)動物死亡所有動物的安樂死，最終步驟須確認(rèn)動物是否已經(jīng)完全死亡。應(yīng)檢查動物的心跳是否完全停止、瞳孔是否放大。停止呼吸的單一現(xiàn)象不能作為判斷動物是否死亡的依據(jù)，因為動物往往先停止呼吸，數(shù)分鐘之后才停止心跳，在使用二氧化碳對動物進(jìn)行安樂死時尤其明顯。另外，兔子與禽類會憋氣，因此不適用二氧化碳作為安樂死方案。5、動物尸體處理執(zhí)行動物安樂死及尸體處理的人員必須了解該動物是否有人畜共患病的潛在危害、是否曾進(jìn)行過放射性物質(zhì)或有毒化學(xué)物質(zhì)試驗，必要時應(yīng)有適當(dāng)?shù)娜藛T防護(hù)措施（PPE）。五、剖檢、取材與組織固定1.實驗動物尸體的固定：通常為仰臥位固定2.剖檢順序多為先腹腔后胸腔，再腦、脊髓、骨髓、皮膚肌肉等；取材順序基本與此相同。3.檢查內(nèi)容（1）位置：有無移位、異位；（2）大小：體積增大、縮小或腫大；（3）色澤：整體或局部顏色的增減改變；（4）附加物：有無出血、積液、粘連；（5）質(zhì)地：硬、韌、軟等；（6）切面：多汁、泡沫狀、帶血、膿汁、干燥等；（7）中空器官的黏膜面有無出血、潰瘍、增厚、隆起物等。4.剖檢和取材程序（1）腹腔和腹腔器官：沿腹部正中線切開劍突至肛門之間的腹前壁，再沿最低位肋骨分別向左右兩側(cè)切開側(cè)腹壁至脊柱兩旁，完全暴露腹腔器官。脾臟：檢查大小、厚薄、硬度、性狀、色澤、有否肥厚、破裂等。然后沿長軸將脾切成兩半，切面要平整，檢查脾小梁、紅髓、濾泡的色澤，切面的出血量；胰腺：檢查胰腺色澤和硬度，切面檢查有無出血；胃腸：檢查胃的大小、胃腸道漿膜面的色澤，有無粘連、腫瘤、寄生蟲結(jié)節(jié)。然后沿胃大彎、腸系膜附著部依次剪開胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸。腎臟：首先檢查腎臟大小、硬度、被膜是否容易剝離，腎表面的色澤、平滑度，有無疤痕、出血變化；肝臟：首先檢查肝臟的大小、被膜的性狀、邊緣的厚薄、實質(zhì)的硬度和色澤，以及肝淋巴結(jié)、血管、肝管等的性狀；腎上腺：觀察外形、大小、色澤和硬度，作縱切和橫切，檢查皮質(zhì)和髓質(zhì)的色澤及有無出血。（2）盆腔器官：膀胱：檢查膀胱的大小、尿量及色澤，黏膜有無出血、炎癥和結(jié)石等；雄性生殖器官：檢查睪丸、附睪、凝固腺、前列腺有無粘連、出血、水腫、積液等；雌性生殖器官：沿子宮體背側(cè)剪開子宮角，檢查子宮內(nèi)膜的色澤、有無充血、出血、炎癥等，觀察卵巢和輸卵管有無粘連、出血、水腫、積液等。子宮卵巢膀胱陰蒂睪丸附睪精囊和凝固腺膀胱包皮腺（3）胸腔及其器官用鑷子夾住胸骨劍突，剪斷膈肌與胸骨的連結(jié)，提起胸骨，在胸椎兩側(cè)分別剪斷左、右側(cè)胸壁的肋骨，取下整個胸壁，打開胸腔，依次取出胸腺和心臟。心臟：剪開心包膜，暴露心臟，注意心包的光澤度及心包內(nèi)液體的情況，心臟的大小、外形、心外膜情況；氣管：檢查氣管有無出血、黏液量等；肺臟：檢查肺的色澤、有無出血、炎癥、肺氣腫、肺萎縮、腫瘤等；1.

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