1DB21/XXXXX-XXXX海參種類鑒定規(guī)程骨片法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了骨片法鑒定不同種類海參的術(shù)語(yǔ)和定義、判定原理、試劑、儀器和工具、樣品準(zhǔn)備、樣品固定、骨片制備、觀察和拍照、分析判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鮮品、鹽漬、干品、即食和食品海參種類的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB31602-2015食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)干海參SC/T3215-2014鹽漬海參SC/T3308-2014即食海參3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1海參骨片seacucumberossicles骨片是位于海參真皮表層的內(nèi)骨骼，主要成分是碳酸鈣，是隨海參胚胎發(fā)育而逐漸完善穩(wěn)定的重要特征，形狀、大小隨種類不同而差別很大，是進(jìn)行海參分類及快速鑒別的重要依據(jù)。3.2鹽漬海參Saltedseacucumber定義見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3215-2014。3.3干海參driedseacucumber定義見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)GB31602-2015。3.4即食海參Ready-to-eatseacucumber定義見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)SC/T3308-2014。2DB21/XXXXX-XXXX3.5食品海參foodseacucumber原料經(jīng)清洗、去臟，將經(jīng)切配的原料放入鍋中，加適當(dāng)?shù)恼{(diào)味品加工熱處理制成的海參產(chǎn)品。3.6桌形體table海參骨片的一種。典型的桌形體具穿孔的底盤(pán)，底盤(pán)邊緣平滑或帶突起，中央有一塔部，多由4個(gè)立柱和1個(gè)橫梁構(gòu)成，頂部具有齒。發(fā)育不全的桌形體只剩穿孔的底盤(pán)。4判定原理同種海參具有不同類型的骨片，特別是桌形體結(jié)構(gòu)，具有種的特異性，可用于鑒定海參。依據(jù)不同種海參體壁內(nèi)桌形體骨片形態(tài)的差異，能夠準(zhǔn)確、快速鑒定不同種類海參，且不受加工方式限制。5試劑蒸餾水。6儀器和工具掃描電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、醫(yī)用手術(shù)刀、滅菌吸水紙、燒杯、吸管、鑷子、濾紙、載玻片、蓋玻片、膠膜。7樣品準(zhǔn)備7.1新鮮海參對(duì)鮮活海參進(jìn)行清洗，清除表面泥沙等雜質(zhì)。從近尾端剖開(kāi)海參腹部，清除海參體腔內(nèi)的腸、呼吸樹(shù)、生殖腺等內(nèi)臟以及雜質(zhì)，剩余部分為刺參體壁組織。7.2鹽漬海參沿著海參的腹部開(kāi)口處將海參上下剪開(kāi)，清除泥沙等雜質(zhì)，去除海參口部石灰環(huán)。使用蒸餾水沖洗3次，用吸水紙將海參表面的水吸干。7.3干海參7.3.1樣品浸泡將海參表面清洗干凈，放入燒杯中，倒入蒸餾水，水量約為海參體積的50倍，浸泡24h。7.3.2清除雜質(zhì)沿著海參的腹部開(kāi)口處將海參上下剪開(kāi)，清除泥沙等雜質(zhì)，去除海參口部石灰環(huán)。3DB21/XXXXX-XXXX7.3.3樣品處理將處理好的海參放入裝有蒸餾水的燒杯中，水量浸沒(méi)參體，大火煮沸，調(diào)至小火保持沸騰30min，自然冷卻至室溫。7.4即食海參蒸餾水沖洗3次，用吸水紙將海參表面的水吸干。7.5食品海參用95%的C18H29NaO3S溶液（或洗滌劑）清洗食品海參表面的油漬，清水沖洗3次，用吸水紙將海參表面的水吸干。8樣品固定將上述制備好的海參體壁組織，置于無(wú)水乙醇中固定24h，無(wú)水乙醇需沒(méi)過(guò)海參樣品，每種海參固定三只，以便核對(duì)糾錯(cuò)。每個(gè)樣品配有單獨(dú)的燒杯和吸管，防止相互污染。9骨片制備9.1樣品清洗避開(kāi)疣足和管足，切取0.5cm3的背部體壁組織樣本，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分。9.2樣品處理將樣品放置到5mL離心管中，向燒杯中滴加2mL～3mL次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，靜置10min～30min，根據(jù)體壁溶解狀況，樣品析出肉眼可見(jiàn)的白色顆粒。9.3骨片懸液制備用鑷子取出剩余的體壁組織，加入蒸餾水，并用吸管反復(fù)沖洗。待白色顆粒沉淀后，用吸管吸去上層溶液，再滴加蒸餾水，重復(fù)漂洗3次。10觀察和拍照10.1光學(xué)顯微鏡觀察吸管吸取骨片懸液1滴～2滴置于載玻片上，用蓋玻片將其固定，顯微鏡下觀察并拍照。10.2掃描電子顯微鏡觀察將9.3處理后的樣品用無(wú)水乙醇漂洗3次～5次，吸取骨片懸液，均勻滴加在載玻片上，65℃烘干2min，噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。11分析判定11.1判定規(guī)則4DB21/XXXXX-XXXX根據(jù)自制的光學(xué)顯微鏡照片和掃描電鏡照片，并參考由斯蒂文·W.柏塞爾，耶依夫·薩摩和尚塔爾·康南德編著的《世界重要經(jīng)濟(jì)海參種類》（中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，ISSN1020-8682）等相關(guān)資料，總結(jié)出海參桌形體的形態(tài)特征。中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社出版的中文譯本，可直接借鑒外文原著。11.2海參骨片形態(tài)特征11.2.1仿刺參桌形體骨片形態(tài)特征仿刺參（Apostichopusjaponicus）桌形體骨片由底盤(pán)和立柱組成，底盤(pán)近似為圓形，具有穿孔，底盤(pán)邊緣具突起，中央有1個(gè)塔部。幼小刺參桌形體塔部高，有2～4個(gè)立柱和1～3個(gè)橫梁，底盤(pán)較大，邊緣平滑；成年刺參桌形體退化，塔部變低或消失，變成不規(guī)則的穿孔板。仿刺參的骨片形態(tài)圖見(jiàn)圖1。11.2.2梅花參骨片形態(tài)特征梅花參（Thelenotaananas）的體壁只有桿狀體，沒(méi)有桌形體。梅花參有4種類型的桿狀體。Ⅰ型桿狀體為繁簡(jiǎn)不同的分叉桿狀體,骨長(zhǎng)約120μm,枝干纖細(xì)較直,主、副枝干上具小尖刺,有的分枝2次,有的3～4次；Ⅱ型桿狀體為繁簡(jiǎn)不同的分叉桿狀體,骨長(zhǎng)約85μm,枝干彎曲不規(guī)則,枝干上小尖刺較多,有的分枝2次,有3-4次；Ⅲ型桿狀體形狀像英文字母“X”,骨長(zhǎng)約45μm,枝干上具多個(gè)尖刺,有的主干較短,長(zhǎng)約6μm,有的主干較長(zhǎng),長(zhǎng)達(dá)26μm；Ⅳ型桿狀體為棒狀,長(zhǎng)約110μm,直徑10μm左右,骨干上具多個(gè)小尖刺。11.2.3花刺參桌形體骨片形態(tài)特征花刺參（Stichopusherrmanni）桌形體底盤(pán)近圓形，面積有大有小，小的直徑在40μm左右，大的直徑在65μm左右，周緣呈波狀，中央有4個(gè)大孔，周緣有小孔12~18個(gè)。頂部有兩種類型的結(jié)構(gòu)：一種中央有1個(gè)大孔，周緣具小齒16個(gè)左右，成4簇排列；另一種中央有1個(gè)大孔，周緣具小齒15個(gè)，成5簇排列。頂部與底盤(pán)之間有4個(gè)立柱支撐，立柱之間無(wú)橫梁相連?；ù虆⒌墓瞧螒B(tài)圖見(jiàn)圖2）。11.2.4糙刺參桌形體骨片形態(tài)特征糙刺參（Stichopushorrens）桌形體有2種，疣足內(nèi)有巨大的I型桌形體，底盤(pán)巨大，呈圓形，周緣光滑，直徑約80μm～120μm，中央有4個(gè)大孔，周緣有許多大小不一的穿孔，塔部高，有4根立柱，1根～2根橫梁，末端愈合呈尖狀。II型桌形體底盤(pán)呈圓形，周緣光滑，直徑約30μm～50μm，中央有1個(gè)大孔，周緣有6個(gè)～12個(gè)小孔，塔部適度高，有4根立柱，1根橫梁，頂部呈馬耳他十字形，中央有1個(gè)穿孔，具小齒24個(gè)。糙海參的骨片形態(tài)圖見(jiàn)圖3。11.2.5玉足海參桌形體骨片形態(tài)特征5DB21/XXXXX-XXXX玉足海參（Holothurialeucospilota）桌形體底盤(pán)近圓形，直徑在55μm左右，周緣平滑或呈波狀，中央1個(gè)大孔，周緣12個(gè)左右的小孔。頂部有兩種類型的結(jié)構(gòu)：一種中央有1個(gè)大孔，周緣無(wú)小孔，具齒12個(gè)左右；另一種中央有1個(gè)大孔，周緣6個(gè)左右小孔，具齒14個(gè)左右。桌形體頂部與底盤(pán)有4個(gè)立柱支撐，立柱之間有1個(gè)橫梁相連。玉足海參的骨片形態(tài)圖見(jiàn)圖4。11.2.6虎紋海參桌形體骨片形態(tài)特征虎紋海參（Holothuriapervicax）桌形體底面近圓形，直徑約30μm～40μm，周緣光滑，中央有3個(gè)或4個(gè)大孔，周緣有3個(gè)～6個(gè)小孔。桌形體塔部退化，僅有3個(gè)或4個(gè)極低的立柱，其中3根立柱末端有橫梁相連，一根立柱獨(dú)立無(wú)橫梁?；⒓y海參的骨片形態(tài)圖見(jiàn)圖5。圖1仿刺參（Apostichopusjaponicus）（注：a仿刺參骨片掃描電鏡圖；圖2花刺參（Stichopusherrmanni）桌形體骨片掃描電鏡圖桌形體骨片掃描電鏡圖和光學(xué)顯微鏡圖b,c:仿刺參骨片光學(xué)顯微鏡圖）圖3糙刺參（Stichopushorrens）桌形體骨片掃描電鏡圖6DB21/XXXXX-XXXX圖4玉足海參（Holothurialeucospilota）桌形體圖5虎紋海參（Holothuriapervicax）桌形體骨片掃描電鏡圖骨片掃描電鏡圖注：圖2—圖4：a,b,c,d為不同角度骨片掃描電鏡圖表1海參骨片形態(tài)特征海參桌形體直徑穿孔桌形體底盤(pán)立柱與橫梁仿刺參具穿孔近似圓形，邊緣突起2~4個(gè)立柱1~3個(gè)橫梁梅花參只有桿狀體，無(wú)桌形體花刺參40μm~65μm中央有4個(gè)大孔，周緣近圓形，面積有大有小4個(gè)立柱無(wú)橫梁糙刺參II型：30μm~50μm周緣穿孔大小不一II型：中央1個(gè)大孔，周緣小孔6~12個(gè)大，圓形II型：底盤(pán)圓形，周緣光滑I