ICS11.100CCS 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SBIAORG 001-2023《間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》Criteriaforqualitycontrolofexosomesfrommesenchymalstemcells2023-03-27布 2023-04-01上海市生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會PAGEPAGE10目 錄前言 3間充干胞泌質(zhì)控制準(zhǔn) 4范圍 4規(guī)性用件 4術(shù)和義 4充干胞泌采集 5間質(zhì)細(xì)來求 5間質(zhì)細(xì)上清 5間質(zhì)細(xì)倫求 5術(shù)求 5原料 5外體質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 6鑒方法 7徑濃度 78面志白 8菌測 8胞外病子測 8內(nèi)素測 8異免學(xué)應(yīng)測 8899附錄A規(guī)性錄泌體品射鏡察 10附錄B（范附泌體品光記納流式測 11主要參考文獻(xiàn) 12前言GB/T1.1-2020本標(biāo)準(zhǔn)由上海市生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會提出本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:余躍飛、韓忠朝、王京蘇、王曉冰、韓之雷、高博、嚴(yán)月華、王端賀、艾輝、李國榮、陳云生、李明、唐衛(wèi)、劉麗娟、杜東。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的質(zhì)量控制方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體制備、儲存、運(yùn)輸和應(yīng)用的質(zhì)量管理要求。2規(guī)范性引用文件（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法00010003T/CSCB0015-2022人干細(xì)胞來源細(xì)胞外囊泡制備通用要求術(shù)語和定義干細(xì)胞也能產(chǎn)生組成機(jī)體組織、器官的已特化的細(xì)胞，同時(shí)還能分化為祖細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化能力。外泌體外泌體（exosome）30~RNA等物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)運(yùn)核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞間的信息交流。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的采集間充質(zhì)干細(xì)胞來源要求對間充質(zhì)干細(xì)胞組織樣本的供者來源需進(jìn)行規(guī)范的供者篩查，且在樣本采（HIVHBVHCVEBVCMV的感染，無梅毒螺旋體感染。對于人類胚胎干細(xì)胞系或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和家族史中有明確遺傳性疾病的供者作為異體干細(xì)胞來源。膜獲取，并應(yīng)用于制備各種治療用的外泌體。間充質(zhì)干細(xì)胞上清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)基中去除細(xì)胞、細(xì)胞碎片及其他細(xì)胞成分后所余留的液體。間充質(zhì)干細(xì)胞倫理要求設(shè)指南》（2019版，附則六：干細(xì)胞臨床研究倫理審查）規(guī)定。技術(shù)要求原材料T/CSCB0001、T/CSCB0003的要求。間充質(zhì)干細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量控制要符合T/CSCB0003的規(guī)定。干細(xì)胞培養(yǎng)上清為了獲得高質(zhì)量的外泌體，收獲外泌體最佳時(shí)間為P5代間充質(zhì)干細(xì)胞，要求融合率達(dá)95%以上的細(xì)胞上清。5.1.4外泌體的制備與純化要符合T/CSCB0015-2022的規(guī)定。外泌體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)粒徑20060120（1形態(tài)2。濃度用于皮膚及骨關(guān)節(jié)抗衰用間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體濃度應(yīng)不低于3×1010/ml。標(biāo)志蛋白外泌體膜上富含的參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63、CD81和CD9)是最常用的外泌體標(biāo)志物，鑒定標(biāo)準(zhǔn)是其中任意兩個(gè)表達(dá)陽性。無菌檢査細(xì)菌等微生物檢測應(yīng)為陰性。支原體檢測支原體檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。細(xì)胞內(nèi)外致病因子檢測HIV抗體、HBsAg、HCV抗體、TP抗體、、抗體、HPVHHVEBVHBVHIV病毒核酸檢測應(yīng)為陰性。內(nèi)毒素檢測各樣本中內(nèi)毒素檢測值應(yīng)小于等于0.5EU/mL。異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測淋巴細(xì)胞亞群應(yīng)無異常增殖。鑒定方法粒徑及濃度外泌體粒徑及濃度分析方法采用納米流式檢測法(FlowNanoAnalyzer)和納米顆粒跟蹤分析（NTA)。A納米流式檢測儀(Flow200nm胞結(jié)構(gòu)，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)納米顆粒(7-1000nm)的粒徑及其分布檢測。B為外泌體表征手段之一。形態(tài)透射電子顯微鏡觀察法（TEM）可從形態(tài)和大小上對外泌體進(jìn)行鑒定。通A表面標(biāo)志蛋白CD63、CD9、CD81CD63、CD9、CD81相應(yīng)的無菌檢測1101無菌檢査法"3301支原體檢查法”項(xiàng)檢測。細(xì)胞內(nèi)外致病因子檢測ELISA檢測法檢測抗體水平；核酸檢測法檢測病毒核酸。內(nèi)毒素檢測按照《中華人民共和國藥典》中“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法"檢測。異常免疫學(xué)反應(yīng)檢測（CFSE標(biāo)記法）流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞增殖率。保存穩(wěn)定性、顆?；厥章屎椭睆揭约巴饷隗w的功能。迄今為止，最好的綜合儲存方式是-80℃冷凍貯藏，將外泌體長期存放幾個(gè)月的適當(dāng)條件是冷凍在-80°C或更低的溫度下，避免反復(fù)凍融。為防止外泌體期存儲通常是放置于4°C的溫度。運(yùn)輸凍存的外泌體應(yīng)在-20~-80°C條件下冷鏈運(yùn)輸，而非凍存的外泌體應(yīng)在2°C8°C標(biāo)簽附錄A（規(guī)范性附錄）外泌體樣品透射電鏡觀察主要試劑與儀器戊二醛溶液。載樣銅網(wǎng)檢測步驟10μ。10μL1min，濾紙吸去浮液。5min10μL1min，濾紙吸去浮液。常溫干燥數(shù)分鐘。100kv進(jìn)行電鏡檢測成像。獲得透射電鏡成像結(jié)果。附錄B（規(guī)范性附錄）外泌體樣品熒光標(biāo)記及納米流式檢測主要試劑與儀器FITCMouseAnti-HumanCD63FITCMouseAnti-HumanCD81FITCMouseAnti-HumanCD9PBS小型冷凍離心機(jī) Beckman粒徑分析儀NanoFCM檢測步驟20μL60μ30μL20μL標(biāo)記的抗體（CD63、CD9、CD81），3730min。1mLPBS410,000×g70min。1mL4×g，超速離心70min。50μL1×PBS重懸。度稀釋避免樣本堵塞進(jìn)樣針。NanoFCM儀器檢測蛋白指標(biāo)結(jié)果。主要參考文獻(xiàn)中華人民共和國藥典Identificationofstorageconditionsstabilizingextracellularvesiclespreparations.JExtracell2022Jun;11(6):e12238.GelibterS,MarosticaG,MandelliA,SicilianiS,PodiniFinardiA,FurlanR.Theimpactofstorageonextracellularvesicles:AsystematicJExtracellVesicles.2022Feb;11(2):e12162.doi:10.1002/jev2.12162.PMID:35102719;PMCID:PMC8804350.RohdeE.,PachlerK.,GimonaM.Manufacturingandcharacterizationofextracellularvesiclesfromumbilicalcord-derivedmesenchymalstromalcellsforclinicaltesting.Cytotherapy.2019,21：581-592.Z,GanL,X.ExtracellularVesicle-BasedDrugDeliverySystemsforEnhancedAnti-TumorTherapiesthroughModulatingCancer-ImmunityCycle.Adv2022:e2201054.Preservationofsmallextracellularvesiclesforfunctionalanalysisandtherapeuticapplications:acomparativeevaluationofstorageconditions.Drug2021Dec;28(1):162-170..Post