國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)通則》編制說(shuō)明

一任務(wù)來(lái)源

根據(jù)國(guó)家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)文件[2019]22號(hào)《國(guó)家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)

2019年第二批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知》，項(xiàng)目編號(hào)為：20192274-T-424的“酶聯(lián)

免疫分析試劑盒檢測(cè)通則”列入2019年推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制修訂計(jì)劃。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由江南大學(xué)、中國(guó)計(jì)量大學(xué)、中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院等單位起草。

二標(biāo)準(zhǔn)制定的目的和意義

酶聯(lián)免疫試劑盒，是指能完成酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbent

assay，ELISA）必需試劑和器材的集合，其檢測(cè)原理是將一定濃度的抗原或者抗體

通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過酶標(biāo)物顯色

的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。其具有檢測(cè)通量高、

操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、生

化等檢測(cè)領(lǐng)域，市場(chǎng)上常用的有細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒、免疫

腫瘤學(xué)ELISA試劑盒、神經(jīng)生物學(xué)ELISA試劑盒、牛孕酮ELISA試劑盒、葡萄糖-6-

磷酸酶活性檢測(cè)ELISA試劑盒以及抗生素殘留、農(nóng)藥殘留、真菌毒素等各類ELISA試

劑盒等。

隨著ELISA檢測(cè)技術(shù)的普遍應(yīng)用，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定也隨之增多。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)

的檢索結(jié)果可知，現(xiàn)有采用ELISA檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)共有20項(xiàng)（表1），行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

34項(xiàng)，地方標(biāo)準(zhǔn)35項(xiàng)；主要是針對(duì)某種特定目標(biāo)物（真菌毒素、農(nóng)獸藥、微生物等）

ELISA檢測(cè)方法的規(guī)定。此外，有《酶免疫檢測(cè)抗體檢測(cè)通則》（GB/T40265-2021）

規(guī)定了酶免疫檢測(cè)抗體檢測(cè)的一般要求、檢測(cè)過程和結(jié)果表述，適用于酶免疫檢測(cè)

用抗體的檢測(cè)控制，不適用于具有標(biāo)記物的酶免疫檢測(cè)用抗體的檢測(cè)控制。另有1項(xiàng)

《酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則》（GB/T33411-2016），其規(guī)定了酶聯(lián)免疫分析試劑盒

的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、使用說(shuō)明書和標(biāo)簽，適用于小分子化合物檢測(cè)用的酶聯(lián)免

疫分析試劑盒；該標(biāo)準(zhǔn)屬于ELISA試劑盒產(chǎn)品通則，除適用范圍不適用于大分子化合

物檢測(cè)的試劑盒外，其主要對(duì)試劑盒的組成及要求、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、靈敏度、定

量限、精密度以及正確度等進(jìn)行了規(guī)定，缺乏對(duì)檢測(cè)樣品、檢測(cè)過程以及參比方法

一致性等檢測(cè)要求相關(guān)的規(guī)定。此外，衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS/T124-1999《臨床化學(xué)體外

診斷試劑盒質(zhì)量檢驗(yàn)總則》對(duì)臨床用化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量規(guī)定了技術(shù)要求；2005

2

年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)獸藥殘留檢測(cè)的免疫試劑盒有官方注冊(cè)（備案）管理要求，出臺(tái)

了《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測(cè)試劑（盒）管理的通知》（農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號(hào)），制定了

《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留試劑（盒）

備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)獸藥殘留檢測(cè)試劑（盒）進(jìn)行管理。國(guó)家食品藥品管理局

標(biāo)準(zhǔn)YY/T1183-2010《酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑》對(duì)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室用酶聯(lián)免疫試劑盒

規(guī)定了通用技術(shù)要求；2011年，原國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布了SN/T2775-2011

《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》規(guī)定了用于食品檢測(cè)的商業(yè)化檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)

方法的通用要求，適用于商品化食品檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)企業(yè)、用戶及第三方機(jī)構(gòu)在生

產(chǎn)或使用商品化食品檢測(cè)試劑盒對(duì)相關(guān)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中對(duì)商品化食品試劑

盒的包裝、評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室以及評(píng)價(jià)方法給出了具體要求；評(píng)價(jià)指標(biāo)包括線性和范圍、

檢測(cè)限、定量限、正確度、特異性、精密度、耐變形以及與參考檢測(cè)方法的比較，

具體評(píng)價(jià)方法中將與參考檢測(cè)方法的比較納入正確度的指標(biāo)中。食藥監(jiān)辦械函

[2013]3號(hào)公示了《酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，主要針對(duì)酶聯(lián)免

疫類檢測(cè)試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)

性技術(shù)要求。

表1.現(xiàn)有關(guān)于ELISA檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定

1GB5009.22-2016

（第四法酶聯(lián)免疫吸附篩查法）

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M族的測(cè)定

2GB5009.24-2016

（第三法酶聯(lián)免疫吸附篩查法）

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定

3GB5009.96-2016

（第四法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中T-2毒素的測(cè)定

4GB5009.118-2016

（第二法間接ELISA法，以及第三法直接ELISA法）

5GB/T40368-2021植物代謝產(chǎn)物胰蛋白酶抑制因子測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

紡織品生物化學(xué)分析方法第2部分：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥

6GB/T40175.2-2021

（酶聯(lián)免疫法）

紡織品生物化學(xué)分析方法第3部分：有機(jī)磷類農(nóng)藥

7GB/T40175.3-2021

（酶聯(lián)免疫法）

8GB/T40220-2021植物代謝產(chǎn)物大豆凝集素測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

9GB/T40223-2021植物代謝產(chǎn)物游離棉酚測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

犬科動(dòng)物感染細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原的抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試

10GB/T32948-2016

驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)

11GB/T17999.6-2008SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測(cè)第6部分：SPF雞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

12GB/T17480-2008飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

3

食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生

13GB/T22429-2008

李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法

14GB/T21330-2007動(dòng)物源性食品中鏈霉素殘留量測(cè)定方法-酶聯(lián)免疫法

15GB/T21329-2007動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留量檢驗(yàn)方法酶聯(lián)免疫法

16GB/T21319-2007動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法

17GB/T18932.28-2005蜂蜜中四環(huán)素族抗生素殘留量測(cè)定方法酶聯(lián)免疫法

18GB/T18932.27-2005蜂蜜中泰樂菌素殘留量測(cè)定方法酶聯(lián)免疫法

19GB/T18932.21-2003蜂蜜中氯霉素殘留量的測(cè)定方法酶聯(lián)免疫法

20GB/T14926.50-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

國(guó)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也主要以特定分析物的ELISA檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用指南為主，如XP

V03-147:2020《食品.真菌毒素的測(cè)定.酶免疫試劑盒微孔板(ELISA試劑盒)的使用指

南（Foodstuffs-Determinationofmycotoxins-Guideofuseofimmunoenzymatickits

microplateformat(kitsELISA)）》、NFV03-814*NFEN17254:2019《食品.酶聯(lián)免疫

吸附試驗(yàn)測(cè)定谷蛋白的最低性能要求（Foodstuffs-Minimumperformancerequirements

fordeterminationofglutenbyELISA）》、NFV03-054:2011《食品.用于食物過敏原

檢測(cè)的ELISA技術(shù)實(shí)施的良好實(shí)踐指南（Foodproducts-Goodpracticeguidanceon

implementationofELISAtechniquesforfoodallergensdetection）》、BSENISO

18330-2003《牛奶和奶制品.抗菌劑殘留物檢測(cè)用免疫分析或受體分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述

指南》和NFU47-019-2010《動(dòng)物健康分析方法.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)應(yīng)用

的良好實(shí)施指南（Animalhealthanalysismethods-Guideofgoodpracticesfor

implementationofELISAtechniques）》。2003年，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布了《食品和

飼料中微生物檢測(cè)可替代方法驗(yàn)證規(guī)范》（ISO16140：2003），是針對(duì)微生物快檢

方法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，為市場(chǎng)上的微生物相關(guān)快檢產(chǎn)品的評(píng)價(jià)認(rèn)證提供了非常好的依據(jù)；

法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)在ISO16140：2003的基礎(chǔ)上增加了實(shí)用性評(píng)價(jià)。1989年，國(guó)際分析

化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）出臺(tái)了針對(duì)檢測(cè)試劑盒的指南：AOACResearchInstituteTestKit

DefinitionsandModificationsGuideline，對(duì)檢測(cè)試劑盒做了定義，沒有形成評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

ELISA試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)也發(fā)展迅速，但在各類檢測(cè)試劑盒的品種多樣的情況

下，并沒有對(duì)適用于所有酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)技術(shù)要求進(jìn)行具體規(guī)定。因?yàn)?/p>

ELISA測(cè)定過程中影響因素較多，對(duì)其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過程中除正

常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①

標(biāo)本因素，如血清樣本稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，可能產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，造成假陰

性或假陽(yáng)性的結(jié)果；②試劑因素，ELISA檢測(cè)的核心試劑為生物制品，如抗原、抗體、

4

酶標(biāo)底物等，不同批次的生物制品質(zhì)量有差異，同一批生物制品在不同保存時(shí)間和

不同保存條件下的質(zhì)量是不同的，即生物制品的性質(zhì)具有可變性和易變性，易受各

種因素的影響，如貯存溫度以及恢復(fù)室溫的時(shí)間等；③操作因素，如溫育時(shí)間、比

色時(shí)間、比色波長(zhǎng)的選擇等。如果沒有完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和方法，即使上等的ELISA

試劑盒也有可能得出錯(cuò)誤的結(jié)果，因此，需要對(duì)ELISA試劑盒檢測(cè)的具體操作過程以

及結(jié)果處理進(jìn)行相關(guān)規(guī)定，這對(duì)于保證ELISA試劑盒適用對(duì)象進(jìn)行正確的ELISA操作

以及保證ELISA結(jié)果的準(zhǔn)確度，具有重要的指導(dǎo)意義。

三標(biāo)準(zhǔn)編制過程

1、2019年7月8日，國(guó)家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)文件[2019]22號(hào)《國(guó)家化標(biāo)準(zhǔn)管理委

員會(huì)關(guān)于下達(dá)2019年第二批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知》，項(xiàng)目編號(hào)為：

20192274-T-424的“酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)通則”列入2019年推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的

制修訂計(jì)劃。隨后成立了標(biāo)準(zhǔn)研制小組。開始了標(biāo)準(zhǔn)方法的研究工作。

2、2020年1月至2020年12月，在前期的工作基礎(chǔ)上，對(duì)不同檢測(cè)對(duì)象的同類試

劑盒以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行調(diào)研，確定ELISA試劑盒的檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)文

本。

3、2021年1月至2021年12月，選取不同類型的ELISA試劑盒，對(duì)相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)

進(jìn)行測(cè)試。

4、2022年1月至2022年11月，選取5家驗(yàn)證單位，分別對(duì)相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)

證測(cè)試，并根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)試結(jié)果，形成征求意見稿。

四標(biāo)準(zhǔn)編制原則和編制依據(jù)

在標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中，嚴(yán)格貫徹國(guó)家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等，嚴(yán)格執(zhí)

行強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策性和協(xié)

調(diào)同一性的原則。

本標(biāo)準(zhǔn)的格式按GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫

規(guī)則》要求，其技術(shù)內(nèi)容參照WS/T124-1999《臨床化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量檢驗(yàn)

總則》、GBT33411-2016《酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則》、GBT40369-2021《免疫層

析試紙條檢測(cè)通則》、GB/T40265-2021《酶免疫檢測(cè)抗體檢測(cè)通則》、

GBT20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則編寫-試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》、GB/T27417-2017《合格評(píng)定化

學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》、農(nóng)業(yè)部的獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案參考評(píng)

5

判標(biāo)準(zhǔn)等要求，并結(jié)合酶聯(lián)免疫分析試劑盒產(chǎn)品的特性進(jìn)行編寫的。在標(biāo)準(zhǔn)制訂過

程中力求技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無(wú)誤；文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)明、易懂；標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)

合理；內(nèi)容編排、層次劃分等邏輯與符合規(guī)定。

五標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容的確定

1.適用范圍

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表

面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，

又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面

的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中

的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。

此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底

物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢林璐物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根

據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反

應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA測(cè)定可具有多種形式，大致分為四種主要的不同類型：直接法、間接法、

競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法，如圖1所示。①直接ELISA。將抗原固定于多孔板表面，用特定于

該抗原并且直接偶聯(lián)到HRP或其他檢測(cè)分子的抗體檢測(cè)。②間接ELISA。與直接

ELISA測(cè)定相似，將抗原固定于多孔板表面。但是，檢測(cè)需要兩步過程，通過該過程

先將特定于該抗原的一抗結(jié)合到靶標(biāo)，然后將針對(duì)一抗的宿主物種的標(biāo)記二抗與一

抗結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。該方法還可用于通過血清代替一抗來(lái)檢測(cè)血清樣品中的特定抗體。

③夾心ELISA。夾心ELISA式最常用的形式。這種形式需要特定于該抗原的不同表位

的兩種抗體。這兩種抗體通常被稱為匹配抗體對(duì)。其中一種抗體包被于多孔板表面

上并用作捕獲抗體以促進(jìn)抗原的固定。另一種抗體被偶聯(lián)并促進(jìn)抗原的檢測(cè)。④競(jìng)

爭(zhēng)ELISA。該方法通過檢測(cè)信號(hào)干擾測(cè)量抗原濃度。前三種形式都適用于競(jìng)爭(zhēng)形式。

樣品抗原與參考抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到特定量的標(biāo)記抗體。參考抗原預(yù)包被于多孔板上。

將樣品用標(biāo)記抗體預(yù)孵育并加入孔中。根據(jù)樣品中抗原的量，將有更多或更少的游

離抗體可用于結(jié)合參考抗原。樣品中的抗原越多，檢測(cè)到的參考抗原就越少，信號(hào)

就越弱。也有一些競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒使用標(biāo)記抗原代替標(biāo)記抗體。標(biāo)記抗原和樣品抗

原（未標(biāo)記）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到一抗。樣品中抗原的量越少，則因孔中的更多標(biāo)記抗原產(chǎn)

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生的信號(hào)就越強(qiáng)。

圖1.四種不同類型的ELISA

在商品化試劑盒中用的比較多的是雙抗體夾心法和間接競(jìng)爭(zhēng)法，其中雙抗體夾

心法多用于大分子化合物檢測(cè)，如致敏蛋白、細(xì)胞因子、病毒等；間接競(jìng)爭(zhēng)法多用

于小分子化合物檢測(cè)，如農(nóng)獸藥、抗生素等。

收集整理不同類型ELISA試劑盒說(shuō)明書及標(biāo)準(zhǔn)，了解不同ELISA試劑盒的組成要

求、外觀、貯存條件等一般要求、以及樣品處理、檢測(cè)步驟、檢測(cè)指標(biāo)、結(jié)果計(jì)算

等檢測(cè)過程等；同時(shí)，解讀不同類型ELISA檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)，從方法學(xué)的角度分析不

同類型ELISA的技術(shù)要求。通過分析總結(jié)，綜合性地提出ELISA試劑盒檢測(cè)的相關(guān)要

求。

本文件規(guī)定了ELISA試劑盒的一般要求、檢測(cè)過程和檢測(cè)報(bào)告，適用于ELISA試

劑盒的檢測(cè)。

2、檢測(cè)指標(biāo)的選擇

商業(yè)化的ELISA試劑盒均附有產(chǎn)品說(shuō)明書，小分子化合物以25羥基維生素D檢測(cè)

試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說(shuō)明書（附件1）為例，說(shuō)明書文件內(nèi)容包括以下幾個(gè)部分：

（1）產(chǎn)品名稱；（2）包裝規(guī)格；（3）概要說(shuō)明；（4）檢測(cè)原理；（5）試劑盒的

主要組成成分：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品等；（6）儲(chǔ)存條件及有效期；（7）樣本要求；（8）

檢驗(yàn)方法：自備材料、試劑制備、操作步驟；（9）參考值；（10）檢測(cè)結(jié)果的解釋：

樣本分析數(shù)據(jù)、典型標(biāo)準(zhǔn)曲線；（11）產(chǎn)品性能指標(biāo)：精確度、靈敏度、精密度、

回收率、線性、特異性；（12）參考文獻(xiàn)；（13）生產(chǎn)企業(yè)及售后服務(wù)單位、批準(zhǔn)

號(hào)等。大分子化合物以人TNF-αELISA試劑盒為例（附件2），該說(shuō)明書內(nèi)容包括：

（1）產(chǎn)品名稱；（2）儲(chǔ)存和穩(wěn)定性；（3）試劑盒提供的材料；（4）試劑盒未提

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供但需用到的材料：酶標(biāo)儀、去離子水等；（5）試劑制備：洗液、抗體稀釋、標(biāo)準(zhǔn)

品等；（6）樣品制備；（7）酶標(biāo)板準(zhǔn)備；（8）測(cè)定步驟；（9）方法特異性；（10）

交叉反應(yīng)；（11）物種特異性；（12）標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算以及典型標(biāo)曲數(shù)據(jù)；（13）

典型樣本值：靈敏度、回收率、線性稀釋、精密度（包括批內(nèi)和批間）。

由上可知，ELISA試劑盒應(yīng)附產(chǎn)品說(shuō)明書，或等同的指導(dǎo)性文件。文件內(nèi)容應(yīng)至

少包括以下部分：（1）品種名稱（中英文）；（2）測(cè)定原理；（3）適用范圍，

提及檢測(cè)的目標(biāo)物和適用的基質(zhì)范圍；（4）適用單位需自備的設(shè)備和試劑：酶標(biāo)儀、

去離子水等；（5）提供的材料和試劑：酶標(biāo)板、樣本稀釋液、洗滌緩沖液、底物、

終止液、質(zhì)控樣品等；（6）溶液配制方法；（7）樣品前處理方法；（8）詳細(xì)的檢

測(cè)步驟或操作指南；（9）結(jié)果判定；（10）分析質(zhì)量參數(shù)：靈敏度、檢測(cè)范圍、回

收率、精密度、特異性；（11）保存條件和有效期。

根據(jù)上述ELISA試劑盒說(shuō)明書，ELISA試劑盒的檢測(cè)指標(biāo)主要包括標(biāo)準(zhǔn)曲線線

性、靈敏度、精密度、回收率、特異性；另外為保證食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)工作科

學(xué)合理、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，我國(guó)于2017年發(fā)布了《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》，除

靈敏度、特異性外，參比方法的一致性分析也作為其中一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)?；厥章室约?/p>

與參比方法的一致性均屬于定量方法的正確度指標(biāo)。因此，本文件中的ELISA試劑盒

的檢測(cè)指標(biāo)為：曲線線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性，其中與參考方法的

一致性包含在正確度指標(biāo)中。

3、檢測(cè)過程

3.1檢測(cè)樣本的選擇和制備

檢測(cè)樣本需使用盲樣進(jìn)行，檢測(cè)用盲樣涉及空白、陰性、陽(yáng)性樣品，其中空白

或陰性樣本為與待測(cè)物具有同源性和同質(zhì)性但不含有或方法學(xué)靈敏度未能檢出待分

析物的樣品，陽(yáng)性樣本為在陰性樣品中添加待分析物的方式制備或自身含有待分析

物的實(shí)際樣品。這些樣本均需選擇適宜的儀器檢測(cè)方法測(cè)定樣品中的目標(biāo)分析物含

量，可使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、參考物質(zhì)或質(zhì)量控制品進(jìn)行溯源參考，測(cè)定完成后的各

類樣品應(yīng)進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)處理，形成盲樣，可自行制備。應(yīng)符合以下要求：

（1）陰性樣品與待分析樣品應(yīng)來(lái)源于同一物種，并具有相似的結(jié)構(gòu)特性，包

括不含有或方法學(xué)未能檢出目標(biāo)分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標(biāo)分析物

結(jié)果類似物質(zhì)（易產(chǎn)生交叉反應(yīng)）的樣品，按酶聯(lián)免疫試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行前

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處理。

（2）陽(yáng)性樣品為通過在陰性樣品中添加目標(biāo)分析物所制備的樣品，按酶聯(lián)免疫

試劑盒說(shuō)明書的步驟進(jìn)行前處理。

（3）陰性樣品和陽(yáng)性樣品應(yīng)具有基質(zhì)符合性，以及與實(shí)際樣品所含除目標(biāo)分析

物外其他成分的相似性，重點(diǎn)考慮典型樣品基質(zhì)或相似基質(zhì)，綜合考慮蛋白、脂肪、

水分、糖分、高聚物或多聚體物質(zhì)、色澤、酸堿性等影響檢測(cè)的組分進(jìn)行區(qū)分選擇。

（4）對(duì)于多種目標(biāo)分析物的檢測(cè)，盡可能對(duì)全部目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測(cè)，若因客

觀條件限制不能檢測(cè)全部目標(biāo)分析物，宜對(duì)所有目標(biāo)分析物進(jìn)行分類（如結(jié)構(gòu)類似

程度、危害程度等），每一類至少選擇一種目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測(cè)。

3.2試劑準(zhǔn)備

ELISA試驗(yàn)的原材料主要有抗原、抗體以及酶標(biāo)抗體等生物活性物質(zhì)，故市場(chǎng)

上的大部分ELISA試劑盒的儲(chǔ)存條件為2-8℃。溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因

素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑包括檢測(cè)樣本，

從冷藏環(huán)境中取出，放置15-30分鐘平衡至室溫，以避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而

導(dǎo)致ELISA檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。

部分標(biāo)準(zhǔn)品如腫瘤壞死因子超家族15等蛋白類需要保存在-20℃，恢復(fù)室溫后，

還需要采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，進(jìn)行梯度稀釋，配制成系列測(cè)定使用的濃度，未用完的標(biāo)

準(zhǔn)品應(yīng)按照一次用量分裝后，將其放在-20℃貯存，一次性使用，避免反復(fù)凍融。

抗體工作液需要按照一次計(jì)算所需使用的量，采用抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用

現(xiàn)配；酶結(jié)合物工作液用酶結(jié)合物稀釋液進(jìn)行稀釋配制；洗滌液通常需要用蒸餾水

進(jìn)行稀釋。

3.3操作準(zhǔn)備

按照3.2中準(zhǔn)備工作配制好各種溶液，根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)量、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的數(shù)量

決定所需的酶標(biāo)板板條數(shù)，并增加空白對(duì)照孔；分別將樣本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加

入相應(yīng)孔中（零孔中只加樣本稀釋液），然后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書，依次進(jìn)行孵

育、洗板、顯色、終止、測(cè)試等步驟進(jìn)行操作。為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，每個(gè)樣

本及標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定2次或3次，并記錄實(shí)際加樣情況。

此外，一般ELISA試劑盒中有以下操作要點(diǎn)提示：（1）配制各種試劑時(shí)要充分

混勻，以避免加樣時(shí)加入大量氣泡，產(chǎn)生加樣誤差；（2）為避免交叉污染，在加入

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不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、不同樣品、不同試劑時(shí)及時(shí)更換吸頭；（3）在每次孵育前需使

用新封板膠紙封住反應(yīng)孔；（4）顯色劑在添加之前，應(yīng)確保無(wú)色，不能使用已經(jīng)變

色的顯色溶液；（5）每次檢測(cè)均需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品待測(cè)因子的含量，適當(dāng)

稀釋或濃縮樣本，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行規(guī)范操作，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4結(jié)果計(jì)算

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA試劑盒定量分析的結(jié)果計(jì)算是建立在標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上。已知系列標(biāo)準(zhǔn)品

的濃度以及對(duì)應(yīng)濃度下酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度值，通過曲線擬合得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲

線，外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計(jì)算樣品中目標(biāo)物的濃度。

在ELISA檢測(cè)中允許使用四種模型繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）線性圖的一個(gè)坐標(biāo)軸表

示抗原的濃度，另一個(gè)表示讀數(shù)。R2值在此通常用于確定擬合，數(shù)值大于0.99表

示擬合非常好。然而，線性圖往往會(huì)壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點(diǎn)，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不準(zhǔn)；

（2）半對(duì)數(shù)圖即將濃度值取對(duì)數(shù)值，然后再和對(duì)應(yīng)的OD值進(jìn)行直線回歸，理想的

狀態(tài)下，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)中是一條直線，常用于濃度隨著OD值的增加或者減低呈對(duì)數(shù)

增加或者減少的情況，即濃度的變化比OD值的變化更為劇烈。在ELISA實(shí)驗(yàn)中較常

用（有很多用EXCEL畫圖時(shí)，也常使用半對(duì)數(shù)），擬合函數(shù)方程式為：y=alg(x)+b，

半對(duì)數(shù)圖可以幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對(duì)數(shù)圖使用濃度的對(duì)數(shù)與讀數(shù)的

關(guān)系。這種方法通常會(huì)得到數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更均勻的s形曲線。（3）對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)圖即log-log

擬合回歸方程，與半對(duì)數(shù)相似，只是將OD值和對(duì)應(yīng)的濃度值均取對(duì)數(shù)，然后再進(jìn)行

直線回歸，擬合函數(shù)方程式為：lg(y)=alg(x)+b；該擬合可以為低到中濃度范圍提

供良好的線性，但范圍的高端則容易失去線性。（4）log—logit直線圖擬合，可用于

競(jìng)爭(zhēng)法。Logit變換源于數(shù)學(xué)中的Logistic曲線，在ELISA中，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)物為0

時(shí)結(jié)合率為100%，如果某一濃度下結(jié)合率為B，B=OD/OD0，在對(duì)B進(jìn)行Logit變

換：y=ln[B/(1-B)]，之后y與濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，即：y=a+blg(x)，擬合函數(shù)

方程式為：lg(y)=alg(x)+b就得到了Logit-log直線回歸模型，這個(gè)模型一般適用

于競(jìng)爭(zhēng)法的擬合，所以擬合時(shí)要求只有少有一個(gè)零濃度測(cè)試的OD值，并且此值為整

個(gè)反應(yīng)的最大值(也就是我們常說(shuō)的至少要做一個(gè)空白對(duì)照)。（5）四參數(shù)擬合回歸

不僅限于競(jìng)爭(zhēng)法,實(shí)際上夾心法也可以用它。根據(jù)情況,可能是一個(gè)單調(diào)上升的類似

指數(shù),對(duì)數(shù),或雙曲線的曲線,也可能是一個(gè)單調(diào)下降的上述曲線,還可以是一條S

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形曲線。它要求X值不能小于0（因?yàn)橹笖?shù)是實(shí)數(shù),故有此要求）。在很多情況

下它都可以擬合ELISA的反應(yīng)曲線,也是目前國(guó)際上最流行的免疫檢測(cè)擬合方式。

較其他擬合方式，四參數(shù)擬合對(duì)曲線的全部都有較好的適用性，因此在本標(biāo)準(zhǔn)中推

薦使用。

根據(jù)GBT32465-2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》和GB/T

27147-2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》，校正標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度應(yīng)均勻

布置6個(gè)及以上，每個(gè)濃度測(cè)定次數(shù)不少于2次，最好是3次或更多，對(duì)于準(zhǔn)確定量的

方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99。采用ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定，得

到對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，采

用軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合，四參數(shù)方程的擬合函數(shù)表達(dá)式為：

………………….（1）

在這個(gè)方程中，“a”和“d”分別表示吸光度的最大值和最小值，代表S型曲線

的上漸近線。“c”為吸光度增長(zhǎng)速度開始發(fā)生變化的濃度值，即半效反應(yīng)濃度，表

示拐點(diǎn)即曲線的中點(diǎn)，“b”為吸光度增加速率參數(shù)，相當(dāng)于曲線在“c”處的斜率。

根據(jù)這個(gè)方程，我們現(xiàn)在可以反算出一個(gè)樣本的未知濃度。

隨著計(jì)算機(jī)軟件的不斷發(fā)展，采取合適的匹配的軟件來(lái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行四參數(shù)擬合變

得更為重要。如大多數(shù)的中高端酶標(biāo)儀都會(huì)配備帶有數(shù)據(jù)收集和處理軟件，如

SoftmaxPro，只需編制好相應(yīng)的模板，即可自動(dòng)獲得擬合圖和計(jì)算結(jié)果，更新版的

軟件還可以完成平行性檢驗(yàn)等更高階的功能。但這些相應(yīng)軟件的授權(quán)需要購(gòu)買，且

價(jià)格較高。因此，在日常數(shù)據(jù)的處理中，也會(huì)使用一些統(tǒng)計(jì)軟件如Origin、GraphPad

Prism來(lái)進(jìn)行四參數(shù)擬合，但這些軟件不具備常用的96孔板布局功能，需要前期在

Excel中計(jì)算吸光度平均值、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品濃度等，因此在使用上是存在一定的

限制。

而在定量分析中，可以推薦使用國(guó)產(chǎn)分享軟件mELISA進(jìn)行處理，其具有96孔板

的排布方式，對(duì)于含量計(jì)算、平行樣變異系數(shù)計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和質(zhì)控樣品回收

率計(jì)算都有著極好的效果。另外一些國(guó)產(chǎn)的免費(fèi)軟件也可以實(shí)現(xiàn)四參數(shù)擬合和計(jì)算

功能，如ELISACalc，但其也需要前期在Excel中進(jìn)行平均值計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度設(shè)

置等工作。但這些軟件在應(yīng)用于通過多條曲線比較（如EC50比較來(lái)計(jì)算相對(duì)活性等）

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的工作中操作較為繁瑣。

3.4.2數(shù)據(jù)計(jì)算

由未知樣的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線可換算得出相應(yīng)的濃度。如果樣本的吸光度值超

出標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)稀釋樣本以獲得精確結(jié)果。在分析數(shù)據(jù)時(shí)，樣

本實(shí)際濃度應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的濃度乘以稀釋倍數(shù)。

3.4.3靈敏度

GB/T27147-2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中定義3.16種指

出靈敏度是測(cè)量系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)被測(cè)量的量值變化所得的商。靈敏度可表

示為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），LOD是指由給定測(cè)量程序獲得的測(cè)得的量

值，其對(duì)物質(zhì)種不存在某種成分的誤判概率為β，對(duì)物質(zhì)中存在某種成分誤判概率為

α，國(guó)際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦α和β的默認(rèn)值為0.05，檢出限往往分為方

法檢出限和儀器檢出限。LOQ是指分析方法可定量測(cè)定樣品中待測(cè)組分的最低濃度

或最低量，應(yīng)滿足一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。與LOD相類似，LOQ也可以分為

兩個(gè)部分，儀器定量限和方法定量限，該指標(biāo)體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量

檢測(cè)能力，以保證含量很少的成分能夠被準(zhǔn)確測(cè)出。LOQ的確定主要從其可信性考

慮，通常建議將空白值加上10倍的重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為L(zhǎng)OQ，也可以3倍的LOD或高于

方法確認(rèn)中使用最低加標(biāo)量的50%作為L(zhǎng)OQ，如為增加數(shù)據(jù)的可信性，也可用10倍

的LOD來(lái)表示。特定的基質(zhì)和方法，其LOQ可能在不同實(shí)驗(yàn)室之間或在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)

室內(nèi)由于使用不同設(shè)備、技術(shù)和試劑而有差異。

檢測(cè)限的計(jì)算和表達(dá)方法較多，包括空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、信噪比法、逐步稀釋法、

儀器靈敏度法、方法分辨率法、檢測(cè)能力計(jì)算法等，同一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)不同的檢出限

表達(dá)結(jié)果差異可能會(huì)達(dá)到幾個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)大多數(shù)市售ELISA試劑盒說(shuō)明書，ELISA

定量分析方法通常采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評(píng)估檢出限，即通過分析大量的樣品空白或

加入最低可接受濃度的樣品空白來(lái)確定LOD，獨(dú)立測(cè)試的次數(shù)應(yīng)不少于10次，通過

標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測(cè)結(jié)果的平均值（x0）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）。試劑盒的檢出限確證，

可用95.4%可信限計(jì)算。結(jié)合ELISA試劑盒說(shuō)明書描述，對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，分

別以x0-2s和x0-10s表示LOD和LOQ；對(duì)于夾心ELISA試劑盒，分別以x0+2s和

x0+10s表示LOD和LOQ。由于每一品種中的關(guān)鍵試劑抗原、抗體或標(biāo)記物的不同，

在產(chǎn)品的開發(fā)測(cè)試中加以優(yōu)化，其具體檢測(cè)試劑盒的靈敏度會(huì)有不同。本標(biāo)準(zhǔn)通過

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計(jì)算10份空白基質(zhì)測(cè)定均值加減2倍（或3倍）標(biāo)準(zhǔn)差表述，以此數(shù)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的濃度，確認(rèn)大于或等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低濃度，即為L(zhǎng)OD（LOQ）。

3.4.4精密度

根據(jù)GB/T6379.1-2004/ISO5725-1:1994《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精

密度）第1部分：總則與定義》，精密度通常是指在規(guī)定條件下互相獨(dú)立的測(cè)試結(jié)果

之間的一致程度，表示測(cè)量的重復(fù)性和再現(xiàn)性，是保證準(zhǔn)確度的先決條件，但是高

的精密度不一定能保證高的準(zhǔn)確度。檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)中，用標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)表示測(cè)定

的精密度。變異系數(shù)（CV）被定義為標(biāo)準(zhǔn)差與其均值的比值，以百分?jǐn)?shù)表示，變異

系數(shù)越大的樣本，其測(cè)定值的精密度越低。依據(jù)測(cè)定值與分析的關(guān)系，精密度可分

為批內(nèi)精密度和批間精密度，分別以批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)表示。批內(nèi)變異

系數(shù)指同一次分析中同一樣品平行測(cè)定值的重復(fù)性，批間變異系數(shù)指同一樣品在不

同批次分析中測(cè)定值的再現(xiàn)性。因此精密度是考察試劑盒對(duì)同一樣本重復(fù)測(cè)定時(shí)能

否得到相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的指標(biāo)，是評(píng)價(jià)試劑盒質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。批內(nèi)精密度是指

在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作員使用相同的設(shè)備（在同一塊微孔板上），按相同的測(cè)

試方法，在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一被測(cè)對(duì)象相互獨(dú)立測(cè)定結(jié)果間的一致程度。批間精密度

是指在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同的操作員使用不同的設(shè)備，按相同的測(cè)試方法，對(duì)同一

被測(cè)對(duì)象進(jìn)行獨(dú)立測(cè)定結(jié)果間的一致程度；批間精密度包含內(nèi)容有：同一試劑盒，

不同批次之間；同一試劑盒，同一批次，不同實(shí)驗(yàn)室之間；同一試劑盒，同一批次，

同一實(shí)驗(yàn)室，不同操作者之間；同一試劑盒，同一批次，同一操作者，有效期內(nèi)不

同時(shí)間之間等的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果。

根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》，對(duì)于食品中的禁

用物質(zhì)，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低限進(jìn)

行三水平試驗(yàn)；對(duì)于已制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在法測(cè)定低限、MRL、選一合適

點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；對(duì)于未制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測(cè)定低限、常見限量

指標(biāo)、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)。重復(fù)測(cè)定次數(shù)至少為6。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變異系數(shù)

參考范圍見表1。

表1.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)

13

被測(cè)組分含量實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV）/%

0.1μg/kg43

1μg/kg30

10μg/kg21

100μg/kg15

1mg/kg11

10mg/kg7.5

100mg/kg5.3

1000mg/kg3.8

1%2.7

10%2.0

100%1.3

GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑盒》規(guī)定臨床化學(xué)體外診斷試劑盒規(guī)

定批間差和批內(nèi)差應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的要求。北京市食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的

《化學(xué)發(fā)光免疫類體外診斷試劑（盒）產(chǎn)品技術(shù)審評(píng)規(guī)范》（2017版）中，（1）重

復(fù)性：用控制物質(zhì)或人源樣本（高、低濃度）測(cè)試試劑（盒），重復(fù)測(cè)試至少10次

（n≥10），分別計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)不大于

10%。（2）批間差：用三個(gè)不同批號(hào)試劑（盒），對(duì)不同濃度的樣本分別重復(fù)測(cè)定

10次，計(jì)算每份樣本10次測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)不大于15%。

綜上，本標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定對(duì)ELISA試劑盒的精密度的要求如下：使用同一批次的試劑

盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平陽(yáng)性樣本重復(fù)測(cè)定10次，按照下列公式計(jì)算得到批

內(nèi)變異系數(shù)。使用不同批次的同一試劑盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平陽(yáng)性樣本重

復(fù)測(cè)定10次，按照下列公式計(jì)算得到批間變異系數(shù)。

CV=S/×100%……..…………(2)

式中：

CV—變異系數(shù)；

s—標(biāo)準(zhǔn)偏差；

—10次重復(fù)測(cè)定的平均值。

14

3.4.5正確度

測(cè)量結(jié)果的正確度用于表述無(wú)窮多次重復(fù)性測(cè)定結(jié)果的平均值與參考值之間的

接近程度，正確度差意味著存在系統(tǒng)誤差，通常用偏差表示。而測(cè)量結(jié)果的偏差則

通過回收試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。

評(píng)估正確度的樣品應(yīng)盡可能包括天然存在樣品、含有殘留物質(zhì)或受污染的樣品進(jìn)

行回收率測(cè)定。最理想的偏差評(píng)估是利用樣品的基質(zhì)匹配且濃度相近的有證標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)（CRMs）進(jìn)行測(cè)試，如果合適的CRMs無(wú)法獲得，也可采用分析參考物質(zhì)（RM）

來(lái)進(jìn)行評(píng)估；特別是對(duì)于目標(biāo)分析物以結(jié)合態(tài)形式存在待測(cè)物中（如克倫特羅與動(dòng)

物基體結(jié)合）。對(duì)于穩(wěn)定性高且以原藥自身形式存在的目標(biāo)分析物，也可通過在已

確認(rèn)的空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品。若無(wú)法獲得空白樣品，也可向含有痕量分析物的樣

品中加入標(biāo)樣，亦可通過加標(biāo)樣品前后之差進(jìn)行計(jì)算。

根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》，控制樣品中被

測(cè)組分的含量應(yīng)盡量與被測(cè)樣品相近，若被測(cè)樣品為未檢出，則控制樣品中被測(cè)組

分的含量應(yīng)在方法測(cè)定低限附近。測(cè)定結(jié)果的回收率應(yīng)符合以下要求：（1）對(duì)于食

品中的禁用物質(zhì)，回收率應(yīng)在方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低

限進(jìn)行三水平試驗(yàn)；（2）對(duì)于已制定最高殘留限量（MRL）的，回收率應(yīng)在法測(cè)定

低限、MRL、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；（3）對(duì)于未制定MRL的，回收率應(yīng)在方

法測(cè)定低限、常見限量指標(biāo)、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)。回收率的參考范圍見表1。

另外，在《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中指出實(shí)驗(yàn)中測(cè)試樣品的“測(cè)試水平

一般應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)方法檢出水平（或者標(biāo)準(zhǔn)限量值）的0.5、1、2倍水平或者其他可檢

測(cè)區(qū)分的水平（不少于3個(gè)）；或者方法標(biāo)稱檢出限0.5、1、2倍水平或者其他可檢測(cè)

區(qū)分的水平（不少于3個(gè)）”。由此可知，回收率的測(cè)試水平應(yīng)至少包含低、中、高

三個(gè)濃度水平。

表2.回收率范圍

濃度水平范圍回收率范圍

mg/kg%

>10095-105

1-10090-110

0.1-180-110

<0.160-120

綜上，本標(biāo)準(zhǔn)文本中分為與參比方法一致性、采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、以及回收率三

15

部分進(jìn)行評(píng)估。分別如下表述。

（1）與參比方法的一致性

采用試劑盒與已知的國(guó)際或國(guó)家認(rèn)可的參考方法對(duì)同一份樣本進(jìn)行至少6次的

測(cè)試，按GB/T4889中的F檢驗(yàn)和T-檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

首先按照公式（3）進(jìn)行F檢驗(yàn)，考察酶聯(lián)免疫試劑盒與已知的國(guó)際或國(guó)家認(rèn)可

的參考方法所取得的兩組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差是否一致；若不一致，說(shuō)明兩組方法檢測(cè)

結(jié)果不一致；若一致，再按照公式（4）采用配對(duì)T檢驗(yàn)，考察兩組數(shù)據(jù)的平均值是

否存在顯著性差異，若不存在顯著性差異，說(shuō)明兩種方法測(cè)定結(jié)構(gòu)具有較好的一致

性。

……..………………..(3)

式中：

S大—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差大的數(shù)值；

S小—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差小的數(shù)值；

……..………………..(4)

式中：

x1—第1組測(cè)定結(jié)果的平均值；

x2—第2組測(cè)定結(jié)果的平均值；

s—兩組等精度測(cè)定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n1—第1組測(cè)定的平行測(cè)定次數(shù)；

n2—第2組測(cè)定的平行測(cè)定次數(shù)。

其中，兩組等精度測(cè)定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s按公式（5）算：

…….…(5)

式中：

s1—第1組測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

s2—第2組測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

（2）采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

對(duì)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行6次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算6次重復(fù)檢測(cè)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和

變異系數(shù)，按照公式（6）計(jì)算正確度。

16

正確度（%）=檢測(cè)值/認(rèn)定值×100…………………(6)

（3）回收率

選用試劑盒適用的每種基體，添加低、中、高3個(gè)濃度水平的目標(biāo)分析物，每個(gè)

水平至少測(cè)定6次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的平均值與理論值的偏差。3個(gè)濃度水平偏差的參

考范圍見表2。

3.4.6特異性

特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一地測(cè)

定分析物的能力。ELISA試劑盒的檢測(cè)是基于抗原抗體的反應(yīng)進(jìn)行的。由于被測(cè)樣本

中存在的某些與待測(cè)抗原/抗體有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)或抗原表位的分子，如易共存的其他

抗原抗體、某些激素、易使用的藥物等，可能與試劑中的單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)

而影響檢測(cè)結(jié)果，因此，特異性也是ELISA試劑盒必不可少的檢測(cè)指標(biāo)。

特異性一般用交叉反應(yīng)率表示。對(duì)于夾心ELISA的檢測(cè)，交叉反應(yīng)率一般是指一

定濃度的結(jié)構(gòu)類似物在該試劑盒上的測(cè)定結(jié)果（物質(zhì)的量）與該類似物的量的比值

的百分率，比如1000pmol/L的結(jié)構(gòu)類似物，在某試劑盒上的測(cè)定結(jié)果是5pmol/L，

其交叉反應(yīng)率為5除以1000再乘以100%，即0.5%。其特異性包括種屬特異性和方法

特異性，種屬特異性指ELISA試劑盒中的抗體只對(duì)某一物種的組織、細(xì)胞、血清、體

液、或分泌物發(fā)生特異反應(yīng)的特性，而對(duì)其他種屬動(dòng)物的蛋白均不發(fā)生反應(yīng)，如人

源p21ELISA試劑盒與鼠源p21的交叉反應(yīng)率應(yīng)小于3%，

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的檢測(cè)，通常采用競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)測(cè)定，按照3.4.1，用不同濃度

的結(jié)構(gòu)類似物和標(biāo)準(zhǔn)品分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算得到相應(yīng)的IC50（半數(shù)抑制濃度），

按照公式（3）計(jì)算交叉反應(yīng)率。

CR=…………(3)

式中：

CR—交叉反應(yīng)率，%；

EC50—半數(shù)抑制濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

六應(yīng)用試驗(yàn)

選取不同類型的ELISA試劑盒，按方法可為間接法和夾心法，按檢測(cè)化合物種類

可分小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。分別選取卡那霉素ELISA試劑盒和牛乳鐵蛋白ELISA

試劑盒，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作（附件3和附件4），對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、靈

17

敏度、精密度、正確度、特異性等檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行考察，以證明該標(biāo)準(zhǔn)草案適用于酶

聯(lián)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)。

1、小分子化合物應(yīng)用示例卡那霉素ELISA試劑盒

所有試驗(yàn)按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作，所有試驗(yàn)方案按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

按照卡那霉素說(shuō)明書，將6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，各平行測(cè)定3次，得到表3。

表3.卡那霉素試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

ng/mL123平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

01.3731.2581.2831.3050.061

0.51.0891.0120.8830.9950.104

1.50.7930.6870.7990.7600.063

4.50.5540.5570.5900.5670.020

13.50.4210.4060.3680.3980.027

40.50.2770.2660.2510.2640.013

使用origin軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic四參數(shù)曲線擬合，得到如下標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2.卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）檢出限和定量限

市場(chǎng)上購(gòu)買奶粉樣本，并經(jīng)LC-MS/MS鑒定為氨基糖苷類（卡那霉素、新霉素、

潮霉素B和慶大霉素）陰性樣本，詳細(xì)測(cè)定結(jié)果見附件5。

將空白奶粉樣本按照ELISA說(shuō)明書的操作程序，平行測(cè)定10次，分別計(jì)算平均值

和標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差即為檢出限，平均值加10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差即為定

18

量限。具體數(shù)據(jù)如表4所示。

表4.卡那霉素試劑盒的檢出限和定量限

乘以30倍

由標(biāo)曲得到得到奶粉中

的計(jì)算濃度KAN的濃平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差檢出限定量限

測(cè)定次數(shù)吸光值（ng/mL）度（μg/kg）（μg/kg）（μg/kg）(μg/kg)(μg/kg)

10.9570.51615.466

20.9530.55016.489

30.9590.51715.507

40.9520.54816.431

50.9570.52115.644

16.0220.44117.3520.43

60.9560.52315.704

70.9510.53416.025

80.9600.52915.885

90.9500.55116.543

100.9530.55116.529

（3）精密度

選取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品的添加濃度分別為25、50、150μg/kg。

A.批內(nèi)精密度

在同一測(cè)定中，平行測(cè)定10次，分別計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及變異系數(shù)。如

表5所示。

表5.卡那霉素試劑盒的批內(nèi)精密度

添加濃度12345平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

（μg/kg）（μg/kg）（μg/kg）變異系數(shù)(%)

20.9727.2625.7820.5925.02

24.703.06412.40

2524.7528.1529.5522.8922.03

43.4756.3051.4250.2447.59

49.855.29310.62

5047.7042.3858.6446.9253.85

141.21149.83149.94169.09145.29

152.259.5196.25

150145.68153.67143.84166.72157.28

B.批間精密度

在三次測(cè)試中，每次測(cè)試3個(gè)平行，分別計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及變異系數(shù)。

如表6所示。

表6.卡那霉素試劑盒的批間精密度

添加濃度平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

123

(μg/kg)(μg/kgL)(μg/kg)變異系數(shù)(%)

2527.5030.4024.0924.893.3613.48

19

21.9725.6226.44

26.7820.6320.53

43.4756.3051.42

54.3553.8847.8550.535.8311.54

5044.8843.5059.13

141.21149.83149.94

156.64149.81155.19155.7011.517.39

150174.48174.57149.59

（4）正確度

通過添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度測(cè)試，卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品的添加濃度分別為10、50、

150μg/kg，平行測(cè)定10次，分別計(jì)算平均值和回收率。具體數(shù)據(jù)見表7。

表7.卡那霉素試劑盒的正確度測(cè)試

添加濃度12345平均值

（μg/kg）（μg/kg）回收率(%)

20.9727.2625.7820.5925.02

24.7098.80

2524.7528.1529.5522.8922.03

43.4756.3051.4250.2447.59

49.8599.70

5047.7042.3858.6446.9253.85

141.21149.83149.94169.09145.29

152.25101.50

150145.68153.67143.84166.72157.28

（5）特異性

選取氨基糖苷類抗生素包括鏈霉素、潮霉素B、新霉素和慶大霉素，按照公式

（3）計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果表8所示。

表8.卡那霉素試劑盒的特異性

化合物IC50（ng/mL）CR，%

卡那霉素2.23100

潮霉素B>1000<0.5

新霉素>1000<0.5

慶大霉素>1000<0.5

2、大分子化合物應(yīng)用示例牛乳鐵蛋白ELISA試劑盒

所有試驗(yàn)按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作，所有試驗(yàn)方案按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書，配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，

具體如表9所示。

表9.乳鐵蛋白試劑盒的標(biāo)曲線性

20

標(biāo)準(zhǔn)品濃度

123平均值（ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)偏差

（ng/mL）

00.1390.1360.1310.1350.004

6.250.2860.3640.3910.3470.055

12.50.4960.4880.4670.4840.015

250.9080.9430.8590.9030.042

501.5621.5791.5371.5590.021

1002.1612.2522.2852.2330.064

2002.6382.6762.6082.6410.034

使用origin軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic四參數(shù)曲線擬合，得到如下標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

圖3.乳鐵蛋白試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）檢出限和定量限

乳鐵蛋白是母乳的核心免疫蛋白，人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0~3.0mg/L，是牛

乳中的10倍（牛乳中含量為0.02~0.35mg/mL）。為提高嬰幼兒的免疫力，市場(chǎng)上的

配方奶粉大多有乳鐵蛋白的添加，經(jīng)調(diào)查可知絕大部分品牌奶粉的乳鐵蛋白含量在

30~50mg/100g，美贊臣的藍(lán)臻系列中乳鐵蛋白含量明顯要高出其他的8-10倍。另外，

皇家美素佳兒的乳鐵蛋白含量與藍(lán)臻相當(dāng)。

由圖3標(biāo)曲可知，該試劑盒的檢測(cè)靈敏度（EC20）為22.05ng/mL。一般全脂奶粉

和水的比例大約是1:6兌成純牛奶，經(jīng)過換算可知，乳粉中乳鐵蛋白的檢測(cè)范圍約為

6.17~69.43mg/100g。故在實(shí)際乳粉需要稀釋至少2倍進(jìn)行檢測(cè)。

在中國(guó)乳品工業(yè)2019年第47卷第4期《不同類型熱處理方式對(duì)牛乳品質(zhì)的影響》

中顯示，巴氏殺菌中乳鐵蛋白含量最低為12mg/L、最高為38mg/L，即巴氏殺菌乳中

21

乳鐵蛋白含量約為1.2~3.8mg/100g，故巴氏殺菌乳可用作乳鐵蛋白的空白樣本，考察

乳粉樣本的檢出限和定量限，具體測(cè)定結(jié)果見表10。

表10.乳粉樣本中乳鐵蛋白的檢出限和定量限

根據(jù)標(biāo)曲計(jì)

測(cè)定次算濃度稀釋400倍平均值標(biāo)準(zhǔn)偏檢出限定量限

數(shù)吸光值（ng/mL）（ug/mL）（ug/mL）差（ug/mL）（ug/mL）

10.2886.5802.63

20.2846.4382.58

30.2846.4432.58

40.2826.3872.55

50.2936.7382.70

60.2886.5702.63

70.2916.6782.67

80.29