基因工程基本操作過程2025/3/24一、查找序列及引物設計二、抽提質粒及電泳檢測三、感受態(tài)細胞制備及基因的導入四、篩選陽性克隆及DNA測序五、誘導表達一查找目的基因及引物設計一、查找目的基因（從NCBI上查到的大腸桿菌NEO基因）2025/3/24二、pet-22b質粒分析2025/3/24比較理想的酶切位點有：BamHl、EcoRl、Sacl、Sall、Hindlll、Notl、Xhol、Eagl、Aval等9種2025/3/24引物設計（Oligo）2025/3/242025/3/24二聚體分析2025/3/24組成與Tm2025/3/24錯誤引發(fā)位點2025/3/24PCR2025/3/24限制性酶切位點分析2025/3/24雙酶切質粒、PCR并電泳檢測溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使DNA進入細菌細胞中2、取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)2h以上，至對數中期這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。05倍菌液體積的預冷CaCl2溶液。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序不同菌種，離心的轉速和時間可以酌情更改。將分離出的質粒進行酶切，酶切后如果導入質粒為成功將目的基因接入的質粒，則應該為兩個基因片段。2、取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)2h以上，至對數中期由于內切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。目的基因上只有一種酶(EcoRl)的限制性酶切位點，所以我們排除他，選擇了BamHI和HindIII兩種酶2025/3/24BamHI

上游引物CGGATCC

ATGTCCAAAATCGTAAAAATCATCGGTTTATGCCTGGCCTTTGATCTCTTTA

AAGCTT

下游引物

HindIII2025/3/24三抽提質粒并電泳檢測質粒抽提方法即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒1、去除RNA去除RNA相對比較簡單，首先是使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。經過RNase消化后，RNA變得比較小了，其殘留對酶切反應幾乎沒有影響。如果要徹底去除殘留得RNA，則需要更煩瑣的操作2025/3/242、質粒與細菌基因組分開基本上是采用兩種辦法：一是利用酶/弱去污劑部分裂解細菌，在抽提時只讓質粒從細菌中釋放出來，而不讓基因組DNA從細菌中出來，從而將質粒和基因組DNA分開；二是利用NaOH/SDS完全裂解細菌，讓質粒和細菌基因組DNA都從細菌中出來，再利用質粒和基因組DNA在變性/復性過程中的不同表現(xiàn)，將質粒與基因組DNA分開。3、去除蛋白質及其他雜志基本上是與去除細菌基因組同時實現(xiàn)的。但是，依據不同的細菌，不同的培養(yǎng)條件，以及操作時的精細程度等，雜質的殘留量會不同。所以，通常需要使用苯酚做更進一步的純化。經過上面的處理，沉淀下來的質?；旧峡梢杂糜诿盖辛?025/3/24將外源基因導入載體PCR后電泳檢測回收緩沖液以及更換Buffer電泳檢測2025/3/24雙酶切質粒、PCR并電泳檢測一、雙酶切雙酶切反應(DoubleDigests)的分類：1、同步雙酶切：同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內切酶在不同緩沖液中的活性見《內切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可根據每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應調整酶量和反應時間。

2、分步酶切：如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應。3、使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切：使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切也不復雜。在大多數情況下，采用標準緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進行酶切。這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。通過《內切酶在不同緩沖液里的活性表》可查看第二種酶在特殊緩沖液相應鹽濃度下的作用活性。2025/3/24二、PCR擴增質粒①變性溫度與時間變性充分：變性溫度越高，時間越長變性就越充分。變性溫度、時間要適應：溫度過高、時間過長又會影響TaqDNA聚合酶的活性，變性溫度90-95℃為宜。②退火溫度與時間：復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好，升高復性溫度可以增加非特異性結合，大多數PCR反應的復性溫度在35－70℃,一般低于引物Tm值的5℃左右。復性時間并不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。③延伸溫度與時間：引物延伸溫度一般為72℃。延伸時間：72℃時，核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S，這取決于緩沖體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。然而，延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。2025/3/24三、瓊脂糖凝膠電泳原理在pH8.0（堿性）的環(huán)境中DNA的磷酸基團解離，使DNA在該環(huán)境中帶負電荷，在電場中向正極方向泳動，因為各種DNA分子的電荷數、分子量、構象不同，它們在通過凝膠立體網格時所受的動力和阻力不同，所以泳動的速度有差異，以此達到分離的目的。DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結合，在紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光?；厥召|粒更換Buffer并電泳檢測2025/3/24DNA測序：是對DNA

分子的一級結構的分析。2、取50ul過夜培養(yǎng)物接入3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)2h以上，至對數中期轉接完成后，置于37℃，220r/min培養(yǎng)1小時左右。2、化學方法：氯化鈣制備法、氯化鋰制備法基本上是采用兩種辦法：一是利用酶/弱去污劑部分裂解細菌，在抽提時只讓質粒從細菌中釋放出來，而不讓基因組DNA從細菌中出來，從而將質粒和基因組DNA分開；要有足夠的空間提供溶氧。第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。由于內切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應時，反應速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應時間。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。2、化學方法：氯化鈣制備法、氯化鋰制備法能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。2、化學方法：氯化鈣制備法、氯化鋰制備法檢測OD600值，一般在冰上將定容好的細胞以200μl/支分裝到預冷的EP管中，將EP管插入冰中。檢測分三種，首先是通過對標記基因的檢測，通常用DNA分子雜交技術，來檢驗標記基因（目的基因）是否成功的導入受體細胞。2、化學方法：氯化鈣制備法、氯化鋰制備法選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。四，酶連（目的基因與載體的連接）第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；（E·coliDNA連接酶，來源于大腸桿菌，可用于連接粘性末端；T4DNA連接酶，來源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低。）第二種方法是，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。粘性末端DNA片段的連接DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發(fā)生連接作用，形成重組的DNA分子。平末端DNA片段的連接常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。2025/3/24四感受態(tài)細胞制備及基因導入制備感受態(tài)的方法1、電擊法2、化學方法：氯化鈣制備法、氯化鋰制備法氯化鈣制備法：原理：在CaCl2溶液中，細胞會發(fā)生膨脹，Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區(qū)域，誘導細胞成為感受態(tài)細胞儀器及設備高速冷凍離心機、超凈臺、冰盒、冰若干等。離心杯、移液器、吸嘴、EP管、自封袋等。培養(yǎng)基及試劑液體LB培養(yǎng)基、無抗平板、Amp平板、帶Amp抗性的質粒、100mMCaCl2溶液（含15%甘油）2025/3/241、準備工作所有使用的移液器、吸嘴、離心杯、EP管以及裝培養(yǎng)基的容器最好是專用。洗滌容器時用水清洗干凈，盡量不要用洗滌劑（洗滌劑一般含有表面活性劑而表面活性劑對感受態(tài)影響很大）離心杯、EP管滅菌后置于-20℃預冷備用。自封袋寫上感受態(tài)名稱、批號。2、劃板從-80℃冰柜中，取出一支凍存菌株，于事先照過紫外的超凈臺中，用無菌的接種環(huán)輕輕蘸取菌種后，在無抗平板上劃線，并將菌種迅速放回-80℃保存。在劃線板上做好相應標記，于37℃培養(yǎng)16-20小時。2025/3/243、接種在照過紫外的超凈臺中，用灼燒并冷卻后的鑷子夾住一個20μl槍頭（或者滅過菌的牙簽），挑取單克隆，放入裝有LB的試管中，將試管置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)10-12小時4、轉接將過夜菌按比例轉接至準備好的液體培養(yǎng)基中。一般轉接菌液與培養(yǎng)基體積比例不得大于１:１０，即轉接菌液:培養(yǎng)基體積≦１:１０培養(yǎng)基體積與三角瓶體積比不得小于１:５，即

培養(yǎng)基體積:三角瓶體積≧１:５要有足夠的空間提供溶氧。2025/3/24

轉接完成后，置于37℃，220r/min培養(yǎng)1小時左右。檢測OD600值，一般

OD600值不要超過0.6，也不要低于0.2。

OD值是一個重要的參數，當OD600值大于一定值時，菌體不會保持對數生長。同時，OD值大時菌體總量達，所以需要在這兩個方面的影響中找到一個平衡點。不同的菌種所對應的值不一樣注：劃板、接種為了防止意外發(fā)生最好多劃一塊平板和多接一根試管，劃板、接種、轉接均要嚴格按照無菌操作2025/3/245、離心將達到濃度的菌液在超凈臺中轉移到事先于-20℃預冷的離心杯中。將裝有菌液的離心杯置于冰上10min，使菌液迅速冷卻取出冷卻后的離心杯，配平后對稱放入冷凍離心機，4000r/min，4℃，離心15min。此時可以將CaCl2溶液放入-20℃預冷（CaCl2溶液不要放太早，否則會凍住，冷凍結晶后的CaCl2溶液最好棄去）。不同菌種，離心的轉速和時間可以酌情更改。離心結束后，小心倒去上清，加入0.2倍菌液體積的預冷CaCl2溶液。充分懸浮細胞。配平后對稱放入冷凍離心機，4000r/min，4℃，離心15min，充分除去上清，加入0.05倍菌液體積的預冷CaCl2溶液。充分懸浮細胞。冰浴30min2025/3/246、分裝在冰上將定容好的細胞以200μl/支分裝到預冷的EP管中，將EP管插入冰中。分裝完成后裝入對應的自封袋，立即放入-80℃?zhèn)溆谩?、檢測（轉化）、轉化的原理溶液中的鈣離子和細菌細胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，在42度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜扯開孔道，使DNA進入細菌細胞中8、檢測結果評判正常情況：轉入質粒的平板和陽性對照長菌，陰性對照不長菌。若陽性對照不長菌，說明細胞已經死亡；陰性對照長菌，說明已經被污染。應棄去整批感受態(tài)。若對照組正常，轉入質粒的平板不長菌，應重新再做轉化，設如同前一次的對照組。2025/3/24四篩選陽性克隆及DNA測序一、篩選轉化子1、菌落PCR：是直接以轉化菌的單個克隆為模板，通過特異性引物或通用引物對插入載體的目的基因快速擴增，用于鑒定和篩選陽性轉化菌的技術。一般重組子克隆的PCR反應條帶比較亮且寬，形狀較規(guī)則，而假陽性和假陰性的PCR條帶，多數不太亮，條帶細而且不規(guī)則，有時拖尾2025/3/242、標記基因檢測標記基因的作用在于便于檢測目的基因的情況。因為標記基因和目的基因同位于運載體上，要導入都導入，要表達則都會表達。一般標記基因的DNA序列是已知的，若選用抗氨芐青霉素基因，則可在目的基因導入后用氨芐青霉素來處理受體細胞，若無異常，則抗氨芐青霉素已合成，說明基因已得到表達。檢測分三種，首先是通過對標記基因的檢測，通常用DNA分子雜交技術，來檢驗標記基因（目的基因）是否成功的導入受體細胞。或者用DNA分子雜交技術，來看目的基因導入后是否成功轉錄出信使RNA。最后可以用抗原-抗體檢驗，來驗證導入基因是否成功表達2025/3/24二、酶切、抽質粒1、質粒的抽提可通過外部條件的驟變、高壓、酶解、超聲破碎等方法使感受態(tài)細胞。再通過高速離心，將質粒從破碎的細胞懸浮液中篩選出。2、質粒的酶切電泳將分離出的質粒進行酶切，酶切后如果導入質粒為成功將目的基因接入的質粒，則應該為兩個基因片段。進行瓊脂凝膠電泳檢測酶切后片段。2025/3/24電泳后凝膠圖片實驗成功情況下電泳條帶顯示應該為兩條清晰且含其它雜質的條帶2025/3/24三、DNA測序獲得目的細胞DNA測序：是對DNA

分子的一級結構的分析。其基本原理是DNA

的復制反應體系中需要存在DNA

聚合酶、DNA

模板、寡核苷酸引物和