第3章基因工程第2節(jié)第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建？

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？

科學(xué)家將蘇云金桿菌的“殺蟲(chóng)基因”——Bt抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉主要需要四個(gè)步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉從社會(huì)中來(lái)一、目的基因的篩選和獲取在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。目的基因“殺蟲(chóng)基因”—Bt抗蟲(chóng)蛋白基因目的基因（1）方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（如GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為科學(xué)家找到合適的目的基因提供更多機(jī)會(huì)和可能。（2）實(shí)例：蘇云金桿菌制成的生物殺蟲(chóng)劑廣泛用于防治棉花蟲(chóng)害；蘇云金桿菌的殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)；科學(xué)家不僅掌握了Bt基因的序列信息，對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲(chóng)蛋白也有較為深入的了解。因此，篩選Bt基因作為培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的目的基因。一、目的基因的篩選和獲取1篩選合適的目的基因（1）PCR：是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。一、目的基因的篩選和獲取2利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈。一、目的基因的篩選和獲取一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用90℃以上高溫DNA母鏈*4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物緩沖液（含Mg2+)提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開(kāi)DNA雙鏈（變性）催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶一、目的基因的篩選和獲取體外復(fù)制的引物一般為DNA單鏈（4）擴(kuò)增的過(guò)程①變性：當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈；②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；③延伸：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

如此重復(fù)循環(huán)多次，由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。一、目的基因的篩選和獲取一、目的基因的篩選和獲取

用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？

mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過(guò)程是：一、目的基因的篩選和獲取第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA。（1）構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。①基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因。提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)②部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)。提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時(shí)期的mRNA反（逆）轉(zhuǎn)錄酶單鏈互補(bǔ)DNADNA聚合酶雙鏈DNA片段與載體連接基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存cDNA文庫(kù)一、目的基因的篩選和獲取3獲取目的基因的其他方法真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因一、目的基因的篩選和獲取不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以一、目的基因的篩選和獲取（2）利用化學(xué)方法人工合成①需要儀器：DNA合成儀。②適用目的基因類(lèi)型：要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知；③不需要模板。一、目的基因的篩選和獲取讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1操作目的啟動(dòng)子（1）啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游（首端），緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類(lèi)需要的蛋白質(zhì)。有時(shí)為滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)。目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）2基因表達(dá)載體的構(gòu)成啟動(dòng)子（2）終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游（尾端），標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄的停止。目的基因限制酶切割位點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因終止子（3）標(biāo)記基因①作用：便于重組DNA分子的篩選。②常見(jiàn)類(lèi)型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。（4）目的基因：如Bt基因。（5）復(fù)制原點(diǎn)作用：使能完成自主復(fù)制。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）質(zhì)粒啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)限制酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)限制酶獲取目的基因連接酶重組DNA分子載體（質(zhì)粒）含有目的基因的DNA片段同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割帶有黏性末端（或平末端）的切口帶有相同黏性末端（或平末端）的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3基因表達(dá)載體的構(gòu)建將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡(jiǎn)便嗎？如果這么做，效果會(huì)怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

同一種限制酶切割獲得的目的基因和載