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DB1302唐 山 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB1302/T353—2013平菇原生質(zhì)體脫毒技術(shù)規(guī)程2013-07-01發(fā)布 2013-08-01實(shí)施唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB1302/T349—2013DB1302/T349—2013II前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由唐山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：唐山師范學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：范永山、張運(yùn)峰、張淑紅、李小六。DB1302/T349—2013DB1302/T349—2013PAGEPAGE1平菇原生質(zhì)體脫毒技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了平菇原生質(zhì)體脫毒的實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體再生、鑒定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于平菇菌種的原生質(zhì)體脫毒。規(guī)范性引用文件GB/T6682-2008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T12728-2006 食用菌術(shù)語GB19172-2003 平菇菌種GB/T27405-2008 NY/T528-2010 食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1743-2009 食用菌菌種真實(shí)性鑒定RAPD法NY/T1845-2010 食用菌菌種區(qū)別性鑒定 拮抗反JJG552-1988 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板試行檢定規(guī)程DB1302/T306-2011無公害平菇栽培技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義GB/T12728-2006中確定的及下列術(shù)語和定義適用于本文件。平菇指層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬的主要品種。初始菌株保存于PDA斜面或其它適合培養(yǎng)基內(nèi)的平菇帶毒菌株。平菇病毒病病原和癥狀見附錄A。原生質(zhì)體脫去細(xì)胞壁的植物、真菌或細(xì)菌細(xì)胞。穩(wěn)滲劑用于維持原生質(zhì)體形狀和功能的滲透壓穩(wěn)定劑。再生菌株指原生質(zhì)體經(jīng)過培養(yǎng)獲得的單菌落。脫毒菌株經(jīng)過栽培試驗(yàn)，無病毒感染癥狀的優(yōu)良再生菌株。實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室要求實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范應(yīng)符合GB/T27405-2008的規(guī)定。儀器和設(shè)備超凈工作臺(tái)：無菌風(fēng)的純度≤0.5/皿?時(shí)(φ90mm121℃。25℃～50℃。10℃～500～200rpm。400試劑應(yīng)使用分析純?cè)噭疄镚B/T6682-2008規(guī)定的水。穩(wěn)滲劑0.6moL（pH7.012120n。細(xì)胞壁降解酶walme。培養(yǎng)基PD稱取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L沸水中煮20min，然后用三層紗布過濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20g，定容至1L。在高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。PDA在1LPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g15mn12℃滅菌20in。PSA稱取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L穩(wěn)滲劑中煮20min，然后用三層紗布過濾，201L15g15min12120min。原生質(zhì)體制備菌絲體活化在超凈工作臺(tái)中用接種針挑取少許初始菌株的菌絲，接種于PDA平板表面，25℃培養(yǎng)5d～7d。搖瓶培養(yǎng)3～550mLPD培養(yǎng)基的搖瓶中，25℃、180rpm5d。破碎菌絲體PD培養(yǎng)基中挑取菌絲球置于重量為G1的1.5mL10000rpm5minG2G=G1-G2（G=0.1g左右。用玻璃棒（6mm）將菌絲球搗碎。酶解0.02g1mL0.22μm（現(xiàn)配現(xiàn)用352.5h30min顛倒混勻一次。原生質(zhì)體分離利用300目細(xì)胞篩過濾酶解產(chǎn)物，獲得含有原生質(zhì)體的濾液。原生質(zhì)體觀察和計(jì)數(shù)利用光學(xué)顯微鏡觀察原生質(zhì)體。按照J(rèn)JG552-1988的要求進(jìn)行原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。原生質(zhì)體再生1.0×105個(gè)0.5mL/皿均勻涂PSA再生培養(yǎng)基上，25℃靜置培養(yǎng)，直到平板上長(zhǎng)出菌落。PDA鑒定再生菌株的真實(shí)性鑒定拮抗反應(yīng)鑒定PDANY/T1845-2010的要求進(jìn)行拮抗反應(yīng)試驗(yàn)。選擇無拮抗反應(yīng)的再生菌株進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。遺傳學(xué)鑒定NY/T1743-2009RAPD指紋圖譜的再生菌株進(jìn)行以下鑒定。脫毒菌株的鑒定按照DB1302/T306-2011進(jìn)行出菇試驗(yàn)，觀察無病毒感染癥狀，獲得脫毒菌株。按照NY/T528-2010進(jìn)行菌種生產(chǎn)，脫毒菌種應(yīng)符合GB19172-2003的規(guī)定。附錄A(資料性附錄)平菇病毒病病原和癥狀病原糙皮側(cè)耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）糙皮側(cè)耳等面體病毒（oystermushroomisometricvirus，OMIV）糙皮側(cè)耳病毒-I（Pleurotusostreatusvirus-I，POV-I）糙皮側(cè)耳病毒-SN（Pleurotusostreatusvirus-SN，POV-SN）癥狀菌絲體感染病毒后多表現(xiàn)于生長(zhǎng)速度變緩，菌落邊緣不整齊。子實(shí)體感染病毒后常見以下癥狀：菌蓋邊緣呈波