細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

（本科生用）

目錄

第一部分實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度..............................1

學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則................................................1

實(shí)驗(yàn)室安全管理制度..........................................1

第二部分細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)室技術(shù).....................3

一、清洗與包裝.............................................3

二、消毒滅菌................................................5

三、無菌操作................................................9

四、實(shí)驗(yàn)室維持.............................................10

第三部分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目...................................12

實(shí)驗(yàn)一、動(dòng)物細(xì)胞工程常用培養(yǎng)液配制與檢測(cè)................12

實(shí)驗(yàn)二、小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)

與結(jié)構(gòu)觀察.......................................17

實(shí)驗(yàn)三、小鼠輸卵管卵母細(xì)胞采集與結(jié)構(gòu)觀察................20

實(shí)驗(yàn)四、小鼠超數(shù)排卵及附植前不同發(fā)育階段胚胎采集與結(jié)構(gòu)觀察

..................................................................................................25

實(shí)驗(yàn)五、小鼠組織細(xì)胞原代培養(yǎng)............................29

實(shí)驗(yàn)六、小鼠組織細(xì)胞傳代培養(yǎng).............................32

實(shí)驗(yàn)七小鼠胎兒成纖維細(xì)胞活性檢測(cè).......................34

實(shí)驗(yàn)八、體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定........................36

實(shí)驗(yàn)九、小鼠卵母細(xì)胞體外受精.............................39

實(shí)驗(yàn)十小鼠胚胎體外培養(yǎng)41

實(shí)驗(yàn)十一植物培養(yǎng)基的配制...............................43

實(shí)驗(yàn)十二植物材料的初代培養(yǎng).............................48

實(shí)驗(yàn)十三花粉發(fā)育時(shí)期的鑒定.............................51

實(shí)驗(yàn)十四植物離體培養(yǎng)物的形態(tài)觀察.......................54

實(shí)驗(yàn)十五植物莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)、胚胎及花器官的剝離與觀察......56

實(shí)驗(yàn)十六植物離體根與植物細(xì)胞的液體培養(yǎng)................60

實(shí)驗(yàn)十七植物離體培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)............64

實(shí)驗(yàn)十八植物原生質(zhì)體的分離、純化與培養(yǎng)..................67

實(shí)驗(yàn)十九植物花藥的離體培養(yǎng).............................70

第四部分部分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目流程簡(jiǎn)圖......................72

常用培養(yǎng)液配制與檢測(cè)......................................72

小鼠精子采集與結(jié)構(gòu)觀察....................................73

小鼠超數(shù)排卵、卵母細(xì)胞及附植前胚胎結(jié)構(gòu)觀察................74

小鼠體外受精與胚胎體外培養(yǎng)...............................75

小鼠胎兒成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)......................76

細(xì)胞活性檢測(cè)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定...............................76

第五部分附錄：實(shí)驗(yàn)小鼠的特性及飼養(yǎng)管理............77

一、小鼠的生物學(xué)特性......................................77

二、小鼠的習(xí)性.............................................78

三、小鼠生殖系統(tǒng)解剖.......................................78

四、小鼠的生殖生理學(xué)特點(diǎn)...................................80

五、小鼠的飼養(yǎng)管理.........................................83

ii

第一部分實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度

學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則

一、實(shí)驗(yàn)前必須預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)教材，明確實(shí)驗(yàn)原理、目的、要求、方法及步

驟，熟悉所用儀器設(shè)備的性能及操作規(guī)程，作好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度，衣著及所攜帶物品

符合實(shí)驗(yàn)要求，按規(guī)定位置就位。

三、保持室內(nèi)安靜、整潔，不隨地吐痰，不亂扔紙屑、亂倒廢物及實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)生的廢料，不高聲喧嘩，嚴(yán)肅自律，不影響他人實(shí)驗(yàn)。

四、實(shí)驗(yàn)時(shí)要遵從老師指導(dǎo)，遵守操作規(guī)程，認(rèn)真操作，仔細(xì)觀察，積

極思考，努力培養(yǎng)自己分析問題和解決問題的能力。

五、如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，不抄襲他人實(shí)驗(yàn)記錄，做完實(shí)

驗(yàn)認(rèn)真復(fù)查，如有錯(cuò)漏，及時(shí)更正或補(bǔ)做。

六、要愛護(hù)儀器設(shè)備，節(jié)約水、電、試劑、藥品和器材。凡損壞或丟失

儀器、材料、工具等，均應(yīng)及時(shí)報(bào)告并登記，按規(guī)定處理。

七、實(shí)驗(yàn)結(jié)束要整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，收拾實(shí)驗(yàn)儀器、器材，打掃衛(wèi)生。離開

實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要注意切斷電源、水源、氣源，經(jīng)許可方可離開。

八、按時(shí)完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，認(rèn)真做好實(shí)驗(yàn)后的復(fù)習(xí)和總結(jié)，真正掌握所學(xué)

知識(shí)。

實(shí)驗(yàn)室安全管理制度

一、實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有實(shí)驗(yàn)人員及學(xué)生進(jìn)行安全教育，牢固樹立安全意識(shí)。

根據(jù)本室設(shè)備、環(huán)境及實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，制定防火、防爆、防盜、防事故等方面安

全管理措施，嚴(yán)格執(zhí)行。

二、儀器室、重點(diǎn)要害部位及使用、存放易燃、易爆物及危險(xiǎn)品的場(chǎng)所

要重點(diǎn)防護(hù)，安全措施到位，必要時(shí)設(shè)置安全監(jiān)控預(yù)警系統(tǒng)。

三、從事生物安全相關(guān)的實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)格按照國(guó)家的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，在實(shí)驗(yàn)

中嚴(yán)格控制，防止病原微生物及其污染物的擴(kuò)散，嚴(yán)格制定人員及環(huán)境保護(hù)

措施，并定期檢查，出現(xiàn)問題及時(shí)上報(bào)上級(jí)主管部門。

四、室內(nèi)水電、管線設(shè)施必須按要求裝配，不準(zhǔn)亂接亂拉，隨意拆裝、

改線。各類在用設(shè)備應(yīng)保持完好安全狀態(tài)，有溝、坑、井、臺(tái)、洞的地方，

應(yīng)設(shè)蓋板、護(hù)欄、警示牌。

五、實(shí)驗(yàn)室必須配備符合規(guī)定的消防器材，放置于明顯位置，專人負(fù)責(zé)

管理，定期檢查，確保有效可用。

六、實(shí)驗(yàn)室鑰匙有專人管理，不得私自配備或轉(zhuǎn)借他人。工作人員離開

實(shí)驗(yàn)室前，必須關(guān)好門、窗、水、電、氣等，保管好貴重物品。節(jié)假日前，

要對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行全面安全檢查，假期有值班，假后復(fù)查，確保安全。

七、各實(shí)驗(yàn)室要定期進(jìn)行安全檢查，發(fā)現(xiàn)不安全隱患，及時(shí)排除；不能

自行排除的，報(bào)告有關(guān)部門處理。如發(fā)生事故，應(yīng)及時(shí)采取措施，如實(shí)報(bào)告

案情。凡隱瞞不報(bào)，造成重大損失的，將追究其責(zé)任。

2

第二部分細(xì)胞工程基本實(shí)驗(yàn)室技術(shù)

細(xì)胞工程操作是基于無菌條件下進(jìn)行的，需要建立一套滿足無菌操作技術(shù)

和無菌培養(yǎng)的環(huán)境?？梢酝ㄟ^無菌操作過程獲得動(dòng)物組織、器官和細(xì)胞等無菌

培養(yǎng)物，并在適宜環(huán)境條件下生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖。動(dòng)物配子及胚胎的體外操作

也需要在相當(dāng)嚴(yán)格的無菌條件下進(jìn)行，才能獲得諸如胚胎移植、胚胎體外生產(chǎn)、

克隆動(dòng)物等胚胎工程研究和應(yīng)用的成功。

細(xì)胞工程的操作對(duì)象，對(duì)操作器具帶來的毒性非常敏感，體外培養(yǎng)中任何

與培養(yǎng)物相接觸的有害物質(zhì)都會(huì)影響培養(yǎng)物的體外生長(zhǎng)和增殖，諸如微生物、

細(xì)胞碎片以及非營(yíng)養(yǎng)性化學(xué)物質(zhì)等都可能干擾正常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)工作開始

之前，對(duì)實(shí)驗(yàn)室所使用的培養(yǎng)器具進(jìn)行徹底清洗、滅菌，清除可能殘存的細(xì)胞

毒性物質(zhì)；即使不進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物操作器械、物品，也應(yīng)按照這些要求清

洗，消毒、滅菌。動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室基本操作技術(shù)主要包括清洗、消毒滅菌、

無菌操作及實(shí)驗(yàn)室維持等基本環(huán)節(jié)。該項(xiàng)操作技術(shù)雖然簡(jiǎn)單，但要求仔細(xì)耐心。

它對(duì)保證實(shí)驗(yàn)的成功十分重要。所以，應(yīng)力求通過各項(xiàng)操作步驟，使實(shí)驗(yàn)物品

保持無菌狀態(tài)，滿足實(shí)驗(yàn)最基本要求。

一、清洗與包裝

（一）物品清洗

新的或用后的各種器皿，包括玻璃器皿、塑料器皿、金屬器械、除菌濾器

等都應(yīng)嚴(yán)格清洗。

新購(gòu)置的玻璃器皿，常有游離堿性物質(zhì)，并附有一些對(duì)細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)有

害的物質(zhì)，如有害金屬及灰塵等，因此，新的玻璃器皿在使用前應(yīng)徹底清洗并

經(jīng)過一定的化學(xué)處理。村先在清水中沖洗，晾十水分后在洗液中浸泡過夜，再

經(jīng)流水沖洗6小時(shí)以上c必要時(shí)，還需經(jīng)1%鹽酸溶液浸泡數(shù)小時(shí)，再用流水沖

洗數(shù)小時(shí)，經(jīng)蒸儲(chǔ)水漂洗3次以上，最后用重蒸餛水或去離子水漂洗2次，60℃

烘干備用。已用過的玻漓器皿用洗滌劑刷洗，刷洗時(shí)用力要輕，防止損傷器皿

表面或造成劃痕，或用超聲波清洗儀清洗，清洗后用流水沖洗數(shù)小時(shí)，經(jīng)蒸儲(chǔ)

水漂洗3次以上，最后用多重蒸播水或去離子水漂洗2次，烘干備用。

新的已滅菌的塑料器皿打開即可以使用。己用過的塑料器皿應(yīng)先用清水充

3

分浸泡，或超聲波清洗儀清洗，沖洗干凈，再用2%NaOH溶液浸泡過夜，流水

沖洗數(shù)小時(shí)，然后用1%稀鹽酸浸泡數(shù)小時(shí)，流水沖洗數(shù)小時(shí)，最后用蒸儲(chǔ)水漂

洗3次，多重蒸儲(chǔ)水或去離子水漂洗2次，晾干后備用。

新的金屬器皿用熱洗滌劑溶液洗凈，再用清水沖洗，擦干即可。

培養(yǎng)器皿已受微生物污染時(shí)，先用高壓蒸汽滅菌后清洗。需重復(fù)使用的除

菌濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，硫酸抽濾清洗，再用清水沖洗，之后用蒸

儲(chǔ)水連續(xù)抽濾沖洗，最后用多重蒸儲(chǔ)水連續(xù)抽濾沖洗，烘干備用。

應(yīng)以耐酸、耐熱、開口較大的容器盛裝洗液?？筛鶕?jù)需要選用不同強(qiáng)度的

洗液（表2—1）,配制洗液的方法是：①按照上述配方，將需要量的重銘酸鉀和

蒸儲(chǔ)水加到選用的容器內(nèi)；②向容器內(nèi)緩慢、分次加入濃硫酸（工業(yè)硫酸即可），

輕輕攪拌溶液，以加快散熱及促進(jìn)重輅酸鉀溶解。加入濃硫酸時(shí)切勿過急，以

免液體驟熱，發(fā)生危險(xiǎn)；③自然冷卻。

表2-1洗液配方

成分強(qiáng)酸溶液次強(qiáng)酸溶液弱酸溶液常用配方

重銘酸鉀（g）60100501(X)

濃硫酸（mL）800200100200

蒸儲(chǔ)水（mL）20010001000800

新配制的洗液呈棕紅色。配制和使用洗液時(shí)，操作者須戴耐酸手套。浸酸

的器具一定要晾干，以免將水分帶入洗液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后

取出器皿時(shí)，須小心操作，防止液體濺出，傷及操作者皮膚或衣服。將器皿從

洗液中取出時(shí)，應(yīng)滴干洗液。當(dāng)洗液的顏色變暗、發(fā)綠或渾濁時(shí)，說明已使用

過久，效力降低，應(yīng)重新配制。

（二）清洗后物品的包裝

洗凈烘（晾）干的物品應(yīng)及時(shí)包裝，以備消毒滅菌。包裝的物品也便于消毒滅

菌和貯存，同時(shí)可防止消毒滅菌后再受污染。包裝常用硫酸紙、牛皮紙、紗布、

棉布、錫箔紙、鋁盒、飯盒、專用金屬消毒筒等。包裝的方式根據(jù)消毒滅菌的

方法而有所不同。

對(duì)于體積較大的器皿（如大燒杯、燒瓶等）及濾器等容器，可采用局部包裝的

方法。把開口部分用硫酸紙及牛皮紙或棉布等兩層緊密包裝，包好后用棉線繩扎

緊。對(duì)于較小的器川I，如培養(yǎng)川I、玻璃吸管、注射器、膠塞等可以用硫酸紙及牛

4

皮紙等兩層整體包裝；金屬器械、棉塞等可以先裝入鋁盒、飯盒或消毒筒中，然

后用棉布全部包裹起來；手術(shù)器械、手套、工作衣等可以用布直接包裹。一般全

包裝物品體積不能過大，可以用線繩捆扎，但不可太緊。放有物品的鋁盒、飯盒

或消毒筒等的底部和四周需要有多處通氣孔，盒蓋或筒蓋不宜過緊。多個(gè)相同容

器不易辨別時(shí)，應(yīng)分別注明內(nèi)裝用品的名稱，每一容器內(nèi)的用品不宜放置過多、

過密。注射器的針筒和針芯要分開并一起包裝。吸管包裝盒的底部墊一些脫脂棉

或軟紙、紗布，管口放入少許脫脂棉或紗布，包裝松緊適宜，以免吸管頭被撞斷。

二、消毒滅菌

嚴(yán)格的消毒滅菌對(duì)細(xì)胞與胚胎工程研究與應(yīng)用工作極為重要，直接影響著整

個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。

（一）消毒滅菌方法

目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法（如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過

濾除菌法、射線殺菌法等）和化學(xué)方法（消毒劑、抗生素）兩大類。

1.干熱滅菌法

是利用恒溫干燥箱內(nèi)120°C?150（的高熱，并保持90?120min,殺死細(xì)菌

和芽抱，達(dá)到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進(jìn)行滅

菌，且不易被高溫?fù)p壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。

用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌

的方法之一，在進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)工作時(shí)，常須利用工作臺(tái)面上的酒精燈火

焰對(duì)金屬器具及玻璃器皿口緣進(jìn)行補(bǔ)充滅菌。

2.濕熱滅菌法

壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在

蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物

死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸儲(chǔ)水、棉塞、紙和某

些培養(yǎng)液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調(diào)整為1.0?1.1kg/cn?,維持

20?30min即可達(dá)到滅菌效果。飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度見表2—2。

3.射線滅菌法

利用紫外線燈進(jìn)行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以

殺滅多種微生物。紫外線的作用機(jī)制是通過對(duì)微生物的核酸及蛋白質(zhì)等的破壞作

5

用而使其滅活。適合于實(shí)驗(yàn)室空氣、地面、操作臺(tái)面滅菌。滅菌時(shí)間為30min。

用紫外線殺菌時(shí)應(yīng)注意，不能邊照射邊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，因?yàn)樽贤饩€不僅對(duì)人體皮

膚有傷害，而且對(duì)培養(yǎng)物及一些試劑等也會(huì)產(chǎn)生不良影響。

表2-2飽和蒸汽壓力與其對(duì)應(yīng)的溫度

飽和蒸汽壓力溫度飽和蒸汽壓力溫度

kg/cm1b/in2(℃)kg/cm1b/in2(℃)

0.001001.05515121.0

0.1412103.61.12516122.()

0.2814106.91.26618124.1

0.4426109.81.40620126.0

0.5638112.61.54322127.8

0.70310115.21.68124129.6

0.84412117.630134.5

0.98414119.950147.6

(引自周維燕,1999)

4.過濾除菌法

是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細(xì)菌等微生物

顆粒阻留，從而達(dá)到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發(fā)生分解、變性

而失效的試劑、醐液、血清、培養(yǎng)液等。目前\常用微孔濾膜金屬濾器或塑料

濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細(xì)菌濾器、濾球負(fù)壓過濾除菌。濾膜孔徑應(yīng)在0.22?

0.45岬范圍內(nèi)或用更小的細(xì)菌濾膜，溶液通過濾膜后，細(xì)菌和胞子等因大于濾

膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細(xì)菌透過c

5.化學(xué)消毒劑消毒法

用于那些不能利用物理方法進(jìn)行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、

某些實(shí)驗(yàn)器皿等。常用的化學(xué)消毒劑包括甲醛、高鎰酸鉀、70%?75%乙醇、過

氯乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環(huán)氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%?

75%乙醇、0.1%?0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的滅

菌；利用甲醛加高鋅酸鉀［(2mL甲醛+1g高鋅酸鉀)/m3］或乙二醇(6mL/n?)等加

熱熏蒸法進(jìn)行無菌室和培養(yǎng)室的消毒。在使用時(shí)應(yīng)注意安全，特別是用在皮膚

或?qū)嶒?yàn)材料上的消毒劑，須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時(shí)間，才能達(dá)到

安全和滅菌的目的。

6.抗生素抑菌法

6

主要用于培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段以及作為微生

物污染不嚴(yán)重時(shí)的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。

（二）不同種類物品及培養(yǎng)物的消毒滅菌方法

1.無菌操作室滅菌

培養(yǎng)材料進(jìn)行培養(yǎng)、觀察或更換培養(yǎng)液時(shí)，必須從各方面防止任何污染物

進(jìn)入培養(yǎng)液或容器，所以無菌操作室的滅菌是至關(guān)重要的。由于無菌操作室的

污染來源主要是空氣中的細(xì)菌和真菌徇子，因此長(zhǎng)期停用后的無菌操作室應(yīng)進(jìn)

行熏蒸滅菌，熏蒸是用高鎰酸鉀+甲醛［（2mL甲醛+1g高鎰酸鉀）/n?］進(jìn)行無菌室

的滅菌。經(jīng)常使用的無菌操作室，在每次使用前都應(yīng)進(jìn)行地面衛(wèi)生清潔，并用

紫外線燈照射30min,進(jìn)行空氣滅菌。對(duì)超凈工作臺(tái)，每次操作前用紫外燈照

射30min,然后用70%?75%酒精擦拭。

2.培養(yǎng)液滅菌

培養(yǎng)液在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應(yīng)立即滅菌，或在24小時(shí)內(nèi)完

成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養(yǎng)物操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌。或?qū)?/p>

培養(yǎng)液中耐熱組分先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經(jīng)過過濾除菌的不

耐熱溶液，混勻后分裝備用。

使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時(shí)，將分裝好的培養(yǎng)液放入底部有一定量（淹沒

加熱管）涼水的高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，增壓至0.35?0.4kg/cn?時(shí)排凈滅菌器內(nèi)冷

空氣，以便使蒸汽能到達(dá)各個(gè)消毒部位，保證消毒滅菌徹底。然后繼續(xù)加壓加

熱，當(dāng)壓力表讀數(shù)達(dá)到1.0T.1kg/cn?為12FC,保持15?20min即可。由于消

毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長(zhǎng)的消毒滅菌時(shí)

間是必須的。在121（的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細(xì)菌及高度耐熱的芽泡

桿菌，因此許多培養(yǎng)液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0?1.1kg/cm\121℃o

消毒滅菌時(shí)間與需要消毒滅菌的培養(yǎng)液量密切相關(guān)（表2-3）,時(shí)間不足達(dá)不到滅

菌效果，時(shí)間過長(zhǎng)培養(yǎng)液內(nèi)的一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培養(yǎng)液成分。消毒

滅菌結(jié)束后，關(guān)閉熱源，只有當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力降為零時(shí)才能打開放氣閥，排除

剩余蒸汽，取出培養(yǎng)液。不可在壓力較高時(shí)打開放氣閥，引起減壓沸騰，使容

器中液體溢出。

培養(yǎng)液組成中如含有遇熱易分解的物質(zhì)，則需用過濾方法消毒滅菌。首先

對(duì)培養(yǎng)液中耐熱組分進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場(chǎng)所，固體培養(yǎng)液在40℃

7

左右瓊脂即將凝結(jié)前，加入經(jīng)過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。液

體培養(yǎng)液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時(shí)，使用孔徑為0.22?

0.45國(guó)力或更小的細(xì)菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進(jìn)行，所用

器皿均應(yīng)進(jìn)行高壓消毒滅菌，溫度不應(yīng)超過12PC。

表2-3培養(yǎng)液高壓蒸汽滅菌所必需的最少時(shí)間

容器容積在12『C下所需的容器容積在12PC下所需的

(mL)最少消毒滅菌時(shí)間(min)(mL)最少消毒滅菌時(shí)間(min)

20?5015100030

7520150035

250?50025200040

(引自李浚明，1992)

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌

玻璃器皿可進(jìn)行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后最好及時(shí)烘干

水分。對(duì)不能進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無菌

操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)"用紫外線重復(fù)殺菌。實(shí)驗(yàn)室還可以用環(huán)氧乙烷滅菌袋

對(duì)塑料器皿進(jìn)行消毒，消毒后的器皿要充分散氣2?4h后才可使用。無菌操作

所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75%酒精浸泡，然后在

無菌操作臺(tái)面上晾干的同時(shí)再用紫外線重復(fù)殺菌；在使用期間可多次對(duì)其進(jìn)行

酒精燈火焰灼燒滅菌。常用消毒劑消毒滅菌效果比較見表2-4o

表2-4常用消毒劑消毒滅菌效果比較表

消毒劑使用濃度(％)去除的難易消毒時(shí)間(min)效果

次氯酸鈣9-10易5?3()很好

次氯酸鈉2易5?30很好

漂白粉飽和溶液易5?30很好

濱水1?2易2?10很好

過氧化氫10?12最易5?15好

升汞().1?1較難2?1()最好

酒精70?75易0.2-2好

抗菌素4~5(mg/L)中30?60較好

硝酸銀1較難5?30好

(引自曹孜義，1999)

4.培養(yǎng)材料的消毒滅菌

采自動(dòng)物機(jī)體的實(shí)驗(yàn)材料，攜帶著微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消

8

毒滅菌，對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以淘汰。從動(dòng)物機(jī)體采集的某些

組織塊，須用消毒劑進(jìn)行浸泡處理，進(jìn)行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫

（10%?12%,浸泡5?15min）、過氧乙酸（0.05%,浸泡30s~lmin）、酒精

（70%?75%,浸泡2min）。動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)中常用物品的消毒滅菌方法選

擇見表2-5o

表2-5動(dòng)物細(xì)胞與胚胎工程實(shí)驗(yàn)中常用物品的消毒滅菌方法選擇

消毒滅菌物品壓力蒸汽干熱過濾紫外線化學(xué)氣體化學(xué)消毒劑

培養(yǎng)室、工作臺(tái)+++

玻璃制品++

金屬器械+十+

塑料制品++

橡膠制品+++

培養(yǎng)液+4-

棉、布類十+

培養(yǎng)物+

三、無菌操作

（-）無菌操作前的準(zhǔn)備工作

培養(yǎng)材料接種時(shí)的無菌操作過程除上述各項(xiàng)消毒滅菌操作外，還需完成以

下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養(yǎng)材料。

工作人員無菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對(duì)手臂

消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進(jìn)入無菌操作區(qū)。

如進(jìn)入層流操作室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)完成緩沖準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)的淋浴、一次更換滅菌

衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護(hù)衣帽、手套、拖鞋等；再在風(fēng)淋區(qū)

進(jìn)行無菌風(fēng)淋后方可進(jìn)入層流操作室。進(jìn)入無菌操作區(qū)后，再用70%?75%的

灑精擦拭雙手和前臂，完成無菌操作準(zhǔn)備工作.

用70%?75%酒精擦洗工作臺(tái)面后，將已消毒滅菌的實(shí)驗(yàn)用品取出，并將

操作器械放置在無菌器械支架上，然后開始實(shí)驗(yàn)操作。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，對(duì)

所有操作器械每次使用后都要進(jìn)行滅菌，常采用酒精燈火焰灼燒滅菌。

（二）無菌操作步驟

準(zhǔn)備工作完成后，對(duì)來自于自然生長(zhǎng)條件下的外植體，按上述培養(yǎng)材料消

9

毒方法滅菌后取出，放入己滅菌的培養(yǎng)皿中，然后置超凈工作臺(tái)酒精燈火焰下

方，用滅菌剪刀等器械進(jìn)行適當(dāng)分離、切割或其它處理后備用。在酒精燈火焰

處將培養(yǎng)容器的瓶塞（蓋）輕輕打開，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用躡子將培養(yǎng)材料

置入培養(yǎng)液上，將鐐子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精燈上灼燒后放回支架，然

后迅速灼燎瓶塞（蓋）數(shù)秒后塞回瓶口。對(duì)繼代培養(yǎng)材料的無菌操作，需在燈焰處

打開瓶塞（蓋），繼代材料為液體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)直接用滅菌吸管吸取培養(yǎng)細(xì)胞液放入

新培養(yǎng)液中；繼代材料為固體培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)用滅菌鏡子挑取適量材料置新培養(yǎng)液

上；繼代材料為其他組織時(shí)，用滅菌剪刀或其他器械進(jìn)行培養(yǎng)材料適當(dāng)切割后,

用滅菌鐐子將其置于新培養(yǎng)液上（中），然后迅速灼燎瓶塞（蓋）數(shù)秒后塞回瓶口。

（三）污染源及其表現(xiàn)特征

當(dāng)培養(yǎng)材料、轉(zhuǎn)接器皿、無菌操作環(huán)境等消毒滅菌不徹底時(shí)，培養(yǎng)材料則

攜帶有微生物（microorganism）,當(dāng)其被轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液上時(shí)，微生物繁

殖迅速，出現(xiàn)各種污染菌斑。微生物生長(zhǎng)時(shí)分泌出對(duì)動(dòng)物組織有毒的代謝廢物,

致使培養(yǎng)材料死亡或失去使用價(jià)值。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料附近出現(xiàn)黏液或

混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡沫，這是細(xì)菌性污染。在細(xì)菌性污染中，特別要注

意一種呈乳白色的芽抱桿菌污染，它可出現(xiàn)在培養(yǎng)液表面，或呈滴形云霧狀存

在于培養(yǎng)液內(nèi)，若出現(xiàn)應(yīng)嚴(yán)格滅菌。而培養(yǎng)液表面出現(xiàn)的黃色、白色、黑色等

不同顏色的霉菌，這是真菌性污染c

四、實(shí)驗(yàn)室維持

實(shí)驗(yàn)室的日常維持是動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室所必須進(jìn)行的。在實(shí)驗(yàn)室工作的

每一位研究人員都應(yīng)該被安排在一定范圍內(nèi)承擔(dān)實(shí)驗(yàn)室維持工作任務(wù)，以便使

實(shí)驗(yàn)室保持在一個(gè)好的工作狀態(tài)和工作秩序。首先，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)該保持

實(shí)驗(yàn)室的整潔、干凈和整齊，一旦混亂就容易造成污染隱患。一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的維

持工作最好是有常用實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)人員共同承擔(dān)，給每個(gè)人指定如離心機(jī)、抽

屜、培養(yǎng)箱等實(shí)驗(yàn)區(qū)域的維持任務(wù)。如果有很多人在實(shí)驗(yàn)室工作，更有效的方

法是列出值日表，明確每個(gè)人的任務(wù)。

（一）實(shí)驗(yàn)室日維持任務(wù)

進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作的所有人員，在每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作的前、后，用適當(dāng)?shù)南?/p>

1()

毒劑，如70%乙醇進(jìn)行擦拭。廢物容器和廢液體應(yīng)帶出細(xì)胞培養(yǎng)室，并在每天

工作完成后將其清除。如果有任何污染培養(yǎng)物需要廢棄，應(yīng)立刻從培養(yǎng)室移出，

并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理。按照生物安全條例，細(xì)胞培養(yǎng)廢物應(yīng)作為生物危害

處理，含有細(xì)胞的干廢物應(yīng)放置在生物安全袋并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌處理，液體

廢物應(yīng)使用或消毒劑進(jìn)行消毒處理。如果任何液體灑在了儀器、垃圾或地板上,

應(yīng)立即進(jìn)行清潔并立即消毒。每次使用前后應(yīng)進(jìn)行紫外線殺菌處理，但不要通

宵開啟送風(fēng)設(shè)備和殺菌燈。每天工作結(jié)束后，關(guān)閉顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及其他

應(yīng)該關(guān)閉的儀器設(shè)備。檢查培養(yǎng)箱的溫度和CS指示。最后離開的人員應(yīng)重新

檢查一遍上述工作是否完成。

（二）實(shí)驗(yàn)室周維持任務(wù)

每周應(yīng)該檢查一次所有液氮儲(chǔ)存罐的液氮面高度。檢查培養(yǎng)箱濕度盤的水

量。補(bǔ)充無菌貯藏柜的物品。無血清培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)及時(shí)訂購(gòu)生長(zhǎng)因子、激素及其

他所需的化學(xué)試劑，最好在冰箱或冷藏柜外面貼上這些化學(xué)物的列表。

（三）實(shí)驗(yàn)室月維持任務(wù)

實(shí)驗(yàn)室月維持任務(wù)很少經(jīng)常進(jìn)行，但至少應(yīng)該定期進(jìn)行一次。每月應(yīng)進(jìn)行

一次室內(nèi)清潔，包括地板及天花等，要求用新的抹布和新鮮溶液進(jìn)行地板清潔。

拆解培養(yǎng)箱，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)室部件進(jìn)行消毒；進(jìn)行培養(yǎng)箱溫度和CO2水平的校正,

如果具有自動(dòng)調(diào)零功能，至少應(yīng)1年1次，最好半年1次。進(jìn)行工作臺(tái)面的清

洗和徹底消毒。檢查所有移液管的精確度。檢查細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，檢查清潔純水器

或更換過濾單位。清潔離心機(jī)、冷凍儀。檢查棄除過期液體。仔細(xì)檢查冰箱貯

存液體有無霉菌生長(zhǎng)。清潔、檢查和整理顯微鏡。

II

第三部分實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

實(shí)驗(yàn)一動(dòng)物細(xì)胞工程常用培養(yǎng)液配制與檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生掌握動(dòng)物細(xì)胞工程液體配制的準(zhǔn)備工作，學(xué)習(xí)干熱滅菌和

高壓蒸汽滅菌的程序和方法；掌握常用操作液及基礎(chǔ)培養(yǎng)液的基本配制和質(zhì)量

檢測(cè)方法；為動(dòng)物組織、細(xì)胞、配子和胚胎的操作做好基礎(chǔ)準(zhǔn)備。

二、實(shí)驗(yàn)原理

動(dòng)物細(xì)胞工程的主要操作對(duì)象是離體條件下動(dòng)物有機(jī)體的各部分組織、器

官或細(xì)胞，這些用來進(jìn)行離體培養(yǎng)的組織或器官稱為外植體；動(dòng)物胚胎工程的

主要操作對(duì)象是配子和胚胎。要滿足操作對(duì)象在離體條件下正常生存和生長(zhǎng)發(fā)

育，就必須為其提供適宜生長(zhǎng)發(fā)育的良好營(yíng)養(yǎng)條件，即培養(yǎng)液條件。動(dòng)物的細(xì)

胞、組織、配子或胚胎在營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育等多方面相比較，存在著諸多差

異，營(yíng)養(yǎng)需求也不盡相同。所以在進(jìn)行動(dòng)物組織、細(xì)胞及配子、胚胎的離體操

作或培養(yǎng)時(shí)，需要配制不同的操作液或培養(yǎng)液。因此，了解培養(yǎng)液的組成與掌

握其配制方法是動(dòng)物細(xì)胞工程研究與實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本任務(wù)。

由于動(dòng)物細(xì)胞工程操作對(duì)象的特點(diǎn)，常用操作液及培養(yǎng)液一般配制為液體

狀態(tài)。操作液及培養(yǎng)液中一些成分在溶液中不穩(wěn)定，配制時(shí)一般先將液體的最

基本成分配成基礎(chǔ)液，使用前將這些成分作為添加成分加入基礎(chǔ)液最終配制成

操作液及培養(yǎng)液，不同的培養(yǎng)液及不同的實(shí)驗(yàn)室在添加這些成分時(shí)采用的方式

有所不同。

動(dòng)物細(xì)胞工程的操作是基于無菌條件下進(jìn)行的，需要建立一套滿足無菌操

作技術(shù)和無菌培養(yǎng)的環(huán)境，配制無菌的液體為最基本的條件。而液體在制備過

程中往往帶有各種雜菌，配制成液體后應(yīng)立即滅菌，或在24h內(nèi)完成滅菌工序。

由于動(dòng)物細(xì)胞工程操作液和培養(yǎng)液組成成分中常含有遇熱易分解的物質(zhì)，所以

多采用過濾方法除去操作液和培養(yǎng)液中的細(xì)菌，并在過濾除菌時(shí)完成分裝。

為了檢驗(yàn)配制的液體是否仍有細(xì)菌污染，配制成的液體應(yīng)間隔一定時(shí)間進(jìn)

行檢查，如顏色是否變化、是否發(fā)生渾濁以及是否有菌落出現(xiàn)等，如有必要可

12

進(jìn)行培養(yǎng)檢查。

三、實(shí)驗(yàn)材料和用具

教材或講義中實(shí)驗(yàn)室配置部分已涉及到的不需要專門準(zhǔn)備的固定儀器設(shè)備

和物品不再列出，在此列出需要在本實(shí)驗(yàn)前檢查、調(diào)試、準(zhǔn)備的儀器設(shè)備、器

械物品、藥品、試劑。

實(shí)驗(yàn)者用品：工作服，帽子，口罩，拖鞋，把皂，手消毒桶及消毒液，75%

乙醇，酒精噴壺。

清洗用品：洗滌劑，水桶，水盆，瓶刷，試管刷，超聲波清洗儀，蒸鐳水

（一蒸水和二蒸水），塑料籃或不銹鋼籃，控水架，干燥箱。

消毒、滅菌用品：電爐，高壓蒸汽滅菌器，鼓風(fēng)干燥箱，紗布，棉布，牛

皮紙，硫酸紙，棉繩，鋁盒，飯盒，酒精燈，火柴，酒精棉球°

液體配制用品：超凈工作臺(tái)，精密電子天平，藥匙，稱量紙，燒杯（HMOmL、

500mL.100mL）,放水瓶，四蒸水或超純水，玻璃棒，吸水紙，滴瓶，滴管，

量筒，注射器，移液器，移液器吸頭，吸頭盒，移液器架，漏斗，容量瓶（1000

mL、500mL.100mL）,蒸饋水（三蒸水或四蒸水）或超純水，磁力攪拌器，

酸度計(jì)及精密pH試紙，針頭濾器及濾膜，玻璃瓶，瓶塞，封口膜，標(biāo)簽紙，剪

刀，膠布，記號(hào)筆。

藥品、試劑：1mol/LNaOH,1mol/LHCl,本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)各液體配方成分。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）液體配制的準(zhǔn)備

1.儀器設(shè)備的檢查調(diào)試

液體配制涉及的儀器設(shè)備，如高壓蒸汽滅菌器、鼓風(fēng)干燥箱、精密電子天

平、超凈工作臺(tái)等，在使用前按照說明書，在工作狀態(tài)下進(jìn)行檢查、調(diào)試。

2.物品洗滌及消毒滅菌

按照第二部分介紹的清洗程序，將與液體及其成分接觸的物品清洗干凈、

蒸儲(chǔ)水漂洗后，60c烘干。用于藥品試劑溶解、混合、定容的器皿即可使用。

用于液體無菌處理和分裝的器皿及物品進(jìn)行包裝，耐高溫的器皿及物品采用恒

溫鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干熱滅菌；不耐高溫的物品采用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱滅

13

菌，濕熱滅菌的物品應(yīng)再烘干。

(二)常用操作液及培養(yǎng)液的配制

以實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中常用的操作液和培養(yǎng)液為例，介紹液體配制方法。

1.無Ca*、無Mg-磷酸鹽緩沖液[PBS(-)]

無Ca"、無Mg"磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS)常用作細(xì)胞培

養(yǎng)的操作液。配制方法為，稱量NaCl10.0g,KC10.25g,Na2HPO4-12H2O1.44

g,KH2PO40.25g,四蒸水500mL,燒杯內(nèi)磁力攪拌充分溶解，1000mL容量

瓶定容，分裝，15磅高壓蒸汽滅菌30min,4℃冰箱保存。

2.0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液

胰蛋白酶0.25g,EDTA0.04g,PBS(?)液100mL,燒杯內(nèi)磁力攪拌充分溶

解，0.22um濾膜正壓過濾，4mL/瓶分裝，-20C冰箱保存。

3.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液

DMEM液(dulbicco,sminimalessentialmedium)主要用于細(xì)胞培養(yǎng)。稱量高糖

DMEM粉13.4g,NaHCCh3.7g,分別加四蒸水300mL,磁力攪拌充分溶解，

再將NaHCCh溶液緩慢加入DMEM液中，1000mL容量瓶定容，調(diào)pH7.2,加

血清110mL,80U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，0.22um濾膜正壓過濾，

分裝，4℃冰箱保存。

4.改良杜氏磷酸鹽緩沖液(mPBS)

改良杜氏磷酸鹽緩沖液(modifiedphoaphatebuffersolution,mPBS)俵3—

1)常用作胚胎回收的操作液(沖卵液)。配制過程：

表37改良杜氏磷酸鹽緩沖液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.44136.898000

KC174.652.68200

Na.HPO,141.968.091150

KH2P(X136.091.47200

A液前萄糖180.165.561000

丙酎酸鈉110.050.3336

青霉素70

鏈霉素50

牛血清白蛋白3000

B液CaCL110.990.90100

C液MgCL.6H：0203.310.49100

14

①分別制備A、B、C三種溶液，三蒸水量加至最終量的80%,置冰箱冷藏

室中冷卻后依次混合，可防止沉淀，然后用容量瓶定容至1000mLo為了指示

pH值，可加入酚紅，但它不是PBS的成分，一般加1.0%(g/mL)溶液L0mL/L。

②用0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHC1調(diào)整pH至7.1?7.2(如蒸儲(chǔ)水新鮮，

稱量準(zhǔn)確無誤，配成后pH即為7.1?7.2,不必調(diào)整。實(shí)際應(yīng)用時(shí);若pH不準(zhǔn),

也可能是蒸偏水、試劑或稱量準(zhǔn)確性問題)。使?jié)B透壓穩(wěn)定在約290毫摩爾滲透

壓濃度(mOsm)。

③如試劑含結(jié)晶水量與配方不符，應(yīng)按分子量換算。對(duì)易吸潮的試劑，要

在配制前烘烤干燥。烘干溫度要查閱化學(xué)手冊(cè)，以不使試劑分解或損失分子中

的結(jié)晶水為原則。

④用G6濾器抽濾除菌，或用針頭濾器安裝濾膜后正壓過濾除菌。

⑤在制備過程中，特別是過濾、分裝時(shí)要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。配制好

的液體分裝密封后，標(biāo)明配制日期。4c冰箱中可保存1?4個(gè)月。不可在冰箱

冷凍室或低溫冰箱中保存，否則會(huì)有鹽類結(jié)晶析出。

⑥臨用前按需要量加入牛血清白蛋白或滅活的胎犢血清、新生犢牛血清。

一般在沖卵液中加入血清的濃度為2%?5%。為了使用方便，可在過濾前加入

血清，然后再過濾分裝。血清滅活可除去血清中的毒胚因子，滅活方法是把血

清在56℃下維持30111畝。

5.CZB液

CZB液為ChatotCL,ZiomekCA和BavisterBD于1989年發(fā)表的專為克服小

鼠胚胎體外培養(yǎng)中2.細(xì)胞阻滯的培養(yǎng)液，并以三人的名字縮寫簡(jiǎn)稱為CZB液。

其基本組成成分見表3-2。其特點(diǎn)是在早期卵裂階段不使用可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育延

遲和發(fā)育阻滯的葡萄糖，而使用谷氨酰胺克服小鼠胚胎的2-細(xì)胞阻滯。但早期

胚胎發(fā)育到后期，需要在含5.56mmol/L濃度葡萄糖的CZB液中培養(yǎng)48h,可

很好地支持桑甚胚發(fā)育到囊胚。近年來，CZB液及其改良液體常被用于小鼠胚

胎體外操作和培養(yǎng)的液體。

6.KSOM液

KSOM液最早為L(zhǎng)awitts和Biggers(1991,1992)發(fā)表的SOM液(simplex

optimizedmedium),可支持受精卵克服2-細(xì)胞阻滯。后來，SOM液的NaCl和

KC1濃度被提高后(Lawilts和Biggers1991,Erbachetal1994),新的液體被稱為

KSOMoKSOM液培養(yǎng)小鼠胚胎時(shí)，有較高的細(xì)胞體外培養(yǎng)分裂率，囊胚發(fā)育

15

率較高。KSOM液的基本組成成分見表3-3。

表3-2CZB液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.4481.624769.88

KC174.654.83360.56

KH.PO.136.091.18160.58

CaCVCaCL.2H20110.99/147.021.71186.9/251.4

MgSOi/MgSO4.7H2O120.37/246.471.18142.04/290.33

NallCO,84.0125.122110.33

乳酸鈉112.0731.33507.79

丙酮酸鈉110.050.2729.71

谷氨酰胺146.15L0（4-細(xì)胞前）146.15

葡萄糖180.165.56(4-細(xì)胞后)1001.69

EDTA（二鈉鹽）336.210.1136.98

牛血清白蛋白4000

青霉素70

鏈霉素50

酚紅10

表3-3KSOM液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.4495.75592.7

KC174.652.48185.13

KH2P0」136.090.3547.63

MgSO>/MgSO,.7H2O120.37/246.470.2024.07/49.3

NallCO584.0125.02100.25

CaCl2/CaCl2.2H2110.99/147.021.71186.9/251.4

乳酸鈉112.0710.01120.7/60%,1870

丙酮酸鈉110.050.2022.01

葡萄糖180.160.2036.03

EDTA（二鈉鹽）336.210.013.36

牛血清白蛋白2000

青霉素60

鏈霉素50

酚紅10(1mL,1%)

16

CZB液及KSOM液的配制方法：用四蒸水或超純水溶解NaCKK。、

KH2Po4、NaHCOs.乳酸鈉等基本成分及丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素等

添加成分，共同組成A液；CaCb和MgSO4.7H2O分別溶解，為B、C液。將三

種液體在4℃冰箱降溫后混合，以防止沉淀，混合后用蒸鐳水定容。之后加入酚

紅(1%…L/mL,加入量1000|iL/L),觀察顏色并用精密試紙和儀器測(cè)定pH值,

并用0.2mol/LHC1或0.2mol/LNaOH調(diào)pH到7.3±0.1。用濾器進(jìn)行細(xì)菌過濾,

分裝備用。谷氨酰胺、葡萄糖則先配成高濃度的母液，臨用時(shí)將母液加入培養(yǎng)

液而達(dá)到最終濃度；血清或BSA則分成小包裝，在臨用時(shí)加入培養(yǎng)液，血清終

濃度一般為10%?20%(V/V),BSA終濃度一般為4000mg/L。使用時(shí)按所需濃

度加入血清、BSA和谷氨酰胺后，用0.22um的濾膜再次進(jìn)行細(xì)菌過濾。另外

需要注意的是，將BSA加入培養(yǎng)液時(shí)勿攪拌或劇烈晃動(dòng)，以免產(chǎn)生大量泡沫，

應(yīng)將所需量BSA撒在液體表面，待其自溶或輕輕晃動(dòng)溶解。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題

1.詳細(xì)描述自己在實(shí)驗(yàn)中配制液體的程序即方法，并思考下面的問題。

2.動(dòng)物細(xì)胞工程所用操作液及培養(yǎng)液為何常用過濾除菌法除去細(xì)菌。

3.液體配制時(shí)為何要將組分分類溶解，然后混合？

4.培養(yǎng)液中的一些組分為何在使用前才能加入培養(yǎng)液？

實(shí)驗(yàn)二小鼠睪丸、附睪及輸精管精子

采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)與結(jié)構(gòu)觀ZJ\

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生掌握小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血球計(jì)

數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)的方法；通過睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能

力檢測(cè)，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在附睪內(nèi)成熟的過程；掌握精子抹片方法；

掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體結(jié)構(gòu)觀察的方法，認(rèn)識(shí)精子的正常結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

17

哺乳動(dòng)物的精子形成后必須經(jīng)過在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方

面的變化而最終達(dá)到成熟后，才能獲得向前運(yùn)動(dòng)的能力，這種向前運(yùn)動(dòng)是精子

受精能力的重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物精子包括頭部和尾部二個(gè)主要部分，頸部介于

頭部和尾部之間，形成頭部和尾部的連接。精子頭部主要包括由核組成，頭部

前端是頂體，頂體包圍核的前端形成帽狀。精子頸部變細(xì)并形成頭部和尾部的

連接。尾部是精子的運(yùn)動(dòng)器官，可以分為中段、主段和末段。

三、實(shí)驗(yàn)材料和用具

實(shí)驗(yàn)人員用品，清洗用品和消毒、滅菌用品見實(shí)驗(yàn)一。

精子采集與計(jì)數(shù)用品：隔水式恒溫培養(yǎng)箱，CZB液，KSOM液，注射器，

器械盤，銀子，手術(shù)剪，眼科剪，眼科鍛，眼科異物針，表玻皿，5mL試管，

體視顯微鏡，生物顯微鏡，擦鏡紙，恒溫水浴鍋，血球計(jì)數(shù)板.

精子結(jié)構(gòu)觀察用品：吸水紙，滴瓶，滴管，載玻片，蓋玻片，剪刀，膠布,

記號(hào)筆。

操作液體：0.5%龍膽紫酒精；精子固定液（福爾馬林磷酸鹽緩沖液）；姬姆薩

液（原液，使用時(shí)以1：9的比例用磷酸鹽緩沖液配成工作液）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇60日齡以上，體重達(dá)到35g的體成熟昆白系公鼠。

四、實(shí)驗(yàn)方法

（一）精子采集

左手捏小鼠尾部，右手

持鑲子，或以圖3.1所示方

法，以頸部脫臼法處死實(shí)驗(yàn)

鼠。仰臥,用用75%酒精棉

球消毒腹部開口部位被毛

及皮膚。剪開腹壁，暴露生圖3-1頸部脫臼法迅速處死小鼠的方法

（引自A.納吉等,2003）

殖系統(tǒng)（圖3-2A,B,圖

5-1,）。無菌采取分離睪丸、附睪及輸精管。在含培養(yǎng)液的表玻皿中，用眼科剪

除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球

混入液體妨礙精子觀察C

18

將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪再分離為睪丸、附睪

尾及附帶的小段輸精管、其余部分的輸精管三部分，棄去附睪頭。采集睪丸精

子時(shí)，將睪丸橫切為若干段或組織塊，放在表面皿中，力口1mL培養(yǎng)液，用眼科

鐐子輕輕擠壓睪丸組織塊,把精子擠入培養(yǎng)液中,去掉組織塊。于37℃、5%CCh、

飽和濕度條件下孵育20min,使精子自行散開。采集附睪尾精子時(shí)，將其剪成

幾段，用眼科鏡子輕輕擠壓附睪和輸精管，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉附睪和

輸精管。于37℃、5%CCh、飽和濕度條件下孵育20min,使精子自行散開。采

集輸精管精子時(shí)，由于小鼠輸精管非常細(xì)，不能直接沖洗管腔，將輸精管放入

含有1mL培養(yǎng)液的表面皿內(nèi)，在立體顯微鏡下，用一支眼科用異物針固定輸精

管，用另一支異物針向相反方向縱向撕開輸精管，精子會(huì)浮游到稀釋液中。將

大塊輸精管組織撥開，用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2mL具塞試管中暫

存。

（二）精子運(yùn)動(dòng)能力檢查

用滴管吸取精液，放于血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室與蓋玻片接觸處，使精液自然

流入計(jì)數(shù)室中。計(jì)數(shù)中間5個(gè)中方格（對(duì)角5個(gè)或四角及中間）內(nèi)80個(gè)小方格的

精子數(shù)，計(jì)數(shù)值為X。計(jì)算時(shí)，先計(jì)數(shù)死精子的X1值，將計(jì)數(shù)板置于50c水浴

鍋中的搪瓷盤中，在50℃條件下lOmin殺死精子,計(jì)數(shù)總精子數(shù)X2值,（X2~X1）/X2

為精子運(yùn)動(dòng)能力°計(jì)數(shù)對(duì)每份精子用二個(gè)計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)二次.取平均值C

（三）精子整體結(jié)構(gòu)觀察

取1小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉的形式制成抹片。用0.5%龍

膽紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數(shù)為結(jié)構(gòu)正常

的精子，部分為畸形精子，如頭部畸形（如頭部巨大、瘦小、細(xì)長(zhǎng)、圓形、輪廓

不明顯、皺縮、缺損、雙頭等），頸部畸形（頸部膨大、纖細(xì)、屈折、不全、雙頸

等），尾部中段畸形（膨大、纖細(xì)、彎曲、屈折、不全、雙體等），尾部主段畸形（彎

曲、屈折、回旋、短小、長(zhǎng)大、雙尾等）分類計(jì)數(shù)。有的精子尾部發(fā)育未完成，

為未成熟精子，可視為畸形精子。

（四）精子頂體結(jié)構(gòu)觀察

精液抹片自然干燥2?20min,以1?2mL的福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定

15min,水洗后自然干燥。用姬姆薩工作液染色90min,水洗，風(fēng)干。置于1000

19

倍顯微鏡下用油鏡觀察、計(jì)數(shù)頂體異常精子。鏡下可觀察到大多數(shù)精子頂體結(jié)

構(gòu)正常，部分精子頂體異常，精子頂體異常主要表現(xiàn)為腫脹、缺損、部分或完

全脫落。

五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題

1.詳細(xì)描述自己在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運(yùn)動(dòng)能

力檢測(cè)及結(jié)構(gòu)觀察的程序和方法。

2.雄性小鼠的生殖器官主要由哪幾部分組成？

3.我們?yōu)楹我M(jìn)行睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)，從中能驗(yàn)證什

么基礎(chǔ)理論問題？

4.繪制小鼠精子結(jié)構(gòu)圖。

5.從外觀卜看小鼠精子由哪幾部分組成，你都觀察到了哪幾種畸形結(jié)構(gòu)，

將典型的畸形結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖示。

6.試述精子頂體的重要性，你都觀察到了哪兒種頂體異常情況。

實(shí)驗(yàn)三小鼠輸卵管卵母細(xì)胞采集與結(jié)構(gòu)觀ZJX

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

初步認(rèn)識(shí)小鼠的雌性生殖器官結(jié)構(gòu)組成及其位置，認(rèn)識(shí)卵巢、輸卵管、子

宮等生殖器官；學(xué)會(huì)輸卵管壺腹部采集卵母細(xì)胞的方法，能在卵母細(xì)胞采集液

體中檢出卵母細(xì)胞，初步認(rèn)識(shí)小鼠的卵母細(xì)胞內(nèi)部及外部結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

哺乳動(dòng)物的卵子發(fā)生在卵巢的卵泡內(nèi)進(jìn)行。在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育階段，初

級(jí)卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂（germinalvesiclebreakdown,GVBD）現(xiàn)象，并完成第

一次成熟分裂（減數(shù)分裂，以同源染色體分離為特征），并排出第一極體。一般認(rèn)

為，GVBD的發(fā)生和第一極體的排出是卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志。之后，次級(jí)卵

母細(xì)胞進(jìn)行第二次成熟分裂（一般為有絲分裂，以染色單體分離為特征），并停滯

在第二次成熟分裂中期。在這期間，完成胞質(zhì)的最后成熟。這時(shí)，卵泡發(fā)育成

2()

熟，將處于第二次成熟分裂中期的卵母細(xì)胞連同周圍的卵丘細(xì)胞隨著卵泡液排

出。排出的卵母細(xì)胞經(jīng)過輸卵管漏斗部進(jìn)入輸卵管，運(yùn)行到受精部位輸卵管膨

大部（壺腹部）。卵母細(xì)胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接著

形成一個(gè)已受精的合子并放出一個(gè)小的第二極體。

三、實(shí)驗(yàn)材料和用具

實(shí)驗(yàn)人員用品，清洗用品和消毒、滅菌用品見實(shí)驗(yàn)一。

激素分裝與稀釋用品：微量電子天平，藥勺，青霉素瓶，膠布，記號(hào)筆，

生理鹽水。

超數(shù)排卵用品：注射器（1mL）,針頭（5號(hào)半），孕馬血清促性腺素（PMSG）,

人絨毛膜促性腺素（hCG）,酒精棉球，鏡子。

卵母細(xì)胞采集及觀察用品：體視顯微鏡，擦鏡紙，恒溫水浴鍋，隔水式恒

溫培養(yǎng)箱，器械盤，手術(shù)剪，手術(shù)鏡子，眼科剪，眼科鏡子，眼科異物針，表

面皿，卵母細(xì)胞吸管及膠頭，檢卵杯，酒精棉球，吸管，注射器（2mL,5mL）,

針頭，針頭盒，胚胎回收操作液（mPBS）,酒精燈。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及準(zhǔn)備：昆白系小鼠。為了獲得較多的卵母細(xì)胞，需要對(duì)母鼠進(jìn)

行超數(shù)排卵處理。一般情況下，達(dá)到性成熟的小鼠在超排時(shí)排卵數(shù)多于成年鼠,

故常使用剛達(dá)到性成熟的青年母鼠進(jìn)行超排。一般選擇6周齡左右，體重22?

25g青年小鼠。從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)購(gòu)得的小鼠，需要在光控周期條件下飼養(yǎng)5?

7天，調(diào)節(jié)其生理周期，使其進(jìn)入發(fā)情期。一般采用光照14h、黑喑10h的光

照周期。輸精管結(jié)扎公鼠的準(zhǔn)備過程為，選擇60日齡以上的公鼠。于實(shí)驗(yàn)前兩

周對(duì)公