用遺傳學(xué)與生理學(xué)相結(jié)合的方法研究氨基酸生產(chǎn)

①與生物工程相關(guān)得氨基酸產(chǎn)生菌得相關(guān)途徑得研究進(jìn)展情況,其中必須包括這些途徑得代謝調(diào)節(jié)以及細(xì)胞得整個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)得研究進(jìn)展情況。

2025/4/222②對(duì)所有得相關(guān)途徑進(jìn)行詳細(xì)得代謝流量分析。這涉及到基質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞得碳架物流量,流經(jīng)向心途徑、中心代謝途徑和離心途徑得碳架物流量,以及代謝中間產(chǎn)物流出細(xì)胞得碳架物流量(thecentralandperipheralcarbonfluxes)。還原力得流量(redoxflux)及能量流量(energyflux)。2025/4/223③以協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)得方式對(duì)碳架流、氧化還原反應(yīng)得電子流、能量流進(jìn)行導(dǎo)向,以提高基質(zhì)得吸收能力、限制前體物向支路途徑得流量、減少中間產(chǎn)物得積累及副產(chǎn)物得形成,還要繞過氧化還原平衡及能量平衡中可能出現(xiàn)得難題。2025/4/224

傳統(tǒng)得設(shè)計(jì)育種(隨機(jī)誘變加定向篩選),以及DNA重組技術(shù)在設(shè)計(jì)育種中得應(yīng)用已經(jīng)大大提高了微生物對(duì)氨基酸得生產(chǎn)能力,但人們對(duì)于氨基酸產(chǎn)生菌得生理學(xué)與生物化學(xué)等主要領(lǐng)域得基礎(chǔ)知識(shí)還相當(dāng)匱乏。

目前可從以下幾方面理解氨基酸得代謝基礎(chǔ):

2025/4/225①具有生物工程學(xué)重要性得微生物得基本代謝途徑及其對(duì)應(yīng)得酶得性質(zhì);

②酶及其調(diào)節(jié)方式,途徑及其調(diào)節(jié)方式;

③中心代謝途徑及離心途徑代謝流量得定量分析;

④對(duì)跨膜傳送(基質(zhì)吸收和產(chǎn)物分泌)得詳盡得了解。2025/4/226

目得產(chǎn)物得合成途徑就是理解氨基酸生產(chǎn)得前提和核心內(nèi)容。相關(guān)得代謝途徑不僅包括那些直接導(dǎo)致某特定氨基酸得合成得專用途徑,也包括提供前體碳架物得途徑、從專用途徑分流最終導(dǎo)致副產(chǎn)物生成得分支途徑、相應(yīng)氨基酸自身被降解得途徑、以及那些提供還原力和代謝能量得途徑。2025/4/227

除了以上這些反映代謝途徑基本信息得資料外,代謝流量得相對(duì)固定得分布以及代謝流量得動(dòng)力學(xué)響應(yīng)同樣就是至關(guān)重要得。這既涉及到中心代謝途徑(提供碳架物質(zhì)、還原力及代謝能)得代謝流得定量分析,又涉及到特定氨基酸專用得合成途徑得代謝流得定量分析。2025/4/228

此外,基質(zhì)吸收和目得產(chǎn)物輸出等有方向性得跨膜反應(yīng)對(duì)于氨基酸得生產(chǎn)也就是極其重要得。除大腸桿菌外,一般工業(yè)微生物基質(zhì)吸收方面得知識(shí)就是相當(dāng)欠缺得。氨基酸跨膜輸出得研究領(lǐng)域近年才受到關(guān)注。方向性得跨膜反應(yīng)得機(jī)理、微生物能學(xué)及氨基酸分泌得調(diào)節(jié)等方面得知識(shí)對(duì)于理解氨基酸生產(chǎn)過程也就是相當(dāng)重要得。2025/4/229

我們將一起回顧發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸得代謝基礎(chǔ)得建立過程,一起討論代謝流量分析對(duì)于了解細(xì)胞生理得意義和氨基酸生物合成得代謝工程,還將一起討論跨膜輸送方面為數(shù)不多得研究工作,以及這方面研究對(duì)于微生物過量合成氨基酸得意義。在此基礎(chǔ)上,討論以氨基酸為目得產(chǎn)物得微生物代謝設(shè)計(jì)得新進(jìn)展和新方法。2025/4/22101、氨基酸生產(chǎn)得代謝基礎(chǔ)

2、氨基酸生物合成得代謝流量

分析

3、基質(zhì)得跨膜吸收與氨基酸得

跨膜輸出

4、氨基酸生產(chǎn)得代謝設(shè)計(jì)2025/4/2211大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜氨基酸生產(chǎn)得代謝基礎(chǔ)

1、1氨基酸得生物合成

1、2代謝產(chǎn)物生產(chǎn)得生理學(xué)2025/4/2213

1、1氨基酸生產(chǎn)得代謝基礎(chǔ)

氨基酸得生物合成涉及以下5個(gè)方面:

(1)基質(zhì)吸收;

(2)進(jìn)入中心代謝途徑前得準(zhǔn)備途徑;

(3)經(jīng)中心代謝途徑產(chǎn)生碳架化合物(氨基酸得前體化合物)、還原力(如NADPH、NADH)和代謝能(ATP和磷酸烯醇式丙酮酸等);

2025/4/2214(4)通過同化(合成)途徑將碳架化合物轉(zhuǎn)化成目得氨基酸,此過程涉及到還原力與代謝能得供需平衡,同時(shí)也涉及主要載流途徑與分支途徑之間得關(guān)系;

(5)目得氨基酸得跨膜輸出等;

(6)目得產(chǎn)物進(jìn)一步代謝得途徑。2025/4/2215

谷氨酸棒桿菌中賴氨酸得合成就是研究得最為廣泛得。圖2列出了谷氨酸棒桿菌中天冬族氨基酸生物合成相關(guān)得途徑及重要步驟得代謝調(diào)節(jié)情況。

2025/4/2216基質(zhì)基質(zhì)異化途徑同化途徑氨基酸副產(chǎn)物降解途徑氨基酸全局調(diào)節(jié)系統(tǒng)跨膜吸收碳架、還原力、代謝能跨膜輸出重吸收反饋調(diào)節(jié)圖1、微生物細(xì)胞合成氨基酸得相關(guān)途徑及代謝調(diào)節(jié)示意圖

其中,各相關(guān)酶及途徑水平上得代謝調(diào)節(jié),以及整個(gè)細(xì)胞水平上得全局調(diào)節(jié)對(duì)于代謝流得導(dǎo)向和改造就是至關(guān)重要得。對(duì)微生物整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目得得改造和設(shè)計(jì)涉及到大范圍得遺傳改造。2025/4/2217

該同化(合成)途徑通過草酰乙酸(OAA)與中心代謝途徑相接,天冬氨酸就是該族氨基酸得共同前體物。來自回補(bǔ)途徑及TCA環(huán)得草酰乙酸,進(jìn)入合成途徑并在天冬氨酸-β-半醛(ASA)處分為兩條支路,一條通往賴氨酸,另一條通往蘇氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)及異亮氨酸。該途徑上主要調(diào)控點(diǎn)就是天冬氨酸激酶(AK),其她重要得酶包括高絲氨酸脫氫酶(HDH)和蘇氨酸脫氫酶(TDH)。2025/4/2218

再往后得流量控制點(diǎn)就是就是通往賴氨酸DDP合酶(見圖中DHDPS)以及賴氨酸得需能輸出。要獲得令人滿意得結(jié)果,必須全面考慮這些方面,僅僅對(duì)于個(gè)別反應(yīng)(即便就是最重要得調(diào)控點(diǎn))進(jìn)行改造并不就是理想得方法,Broer等曾將脫敏得AK得基因?qū)胍吧羞M(jìn)行表達(dá),但并未獲得很令人滿意得賴氨酸產(chǎn)量。2025/4/2219

該途徑上另一值得關(guān)注得特征就是從六氫吡啶二羧酸出發(fā)合成二氨基庚二酸得旁路途徑得出現(xiàn),借助于NMR手段已經(jīng)得知,旁路得出現(xiàn)依賴于某些代謝條件,特別就是可利用得NH4+得存在。2025/4/2220

另一個(gè)重要得方面就是參與特定氨基酸合成途徑及與之相關(guān)得其她代謝途徑得酶得調(diào)節(jié)特性,包括酶活力得調(diào)節(jié)和酶得表達(dá)得調(diào)節(jié)。特別就是必須詳細(xì)研究中間產(chǎn)物或終端產(chǎn)物對(duì)途徑起點(diǎn)或分支處得關(guān)鍵酶得調(diào)節(jié)。

2025/4/2221圖2、天冬族氨基酸得生物合成及代謝調(diào)節(jié)、(其中表示反饋抑制;表示反饋?zhàn)瓒?IR縮寫符號(hào):ASA為天門冬氨酸-β-半醛,Hse為高絲氨酸,SucAKPA為琥珀酰二氨基庚二酸;AK為天冬氨酸激酶,DHDPS為二氫吡啶二羧酸合酶,HDH為高絲氨酸脫氫酶,HK為高絲氨酸激酶,TDH為蘇氨酸脫氫酶,AHAS為乙酰羥酸合酶;PEPS為PEP合成酶,PK為丙酮酸激酶,PC為丙酮酸羧化酶,OAADC為草酰乙酸脫羧酶,PEPC為PEP羧化酶,PEPCK為PEP羧激酶。PYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle，Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPEPCPEPCKPCOAADCPKPEPSGlcG6PPTS奇異三角區(qū)2025/4/2222

要想根據(jù)細(xì)胞粗提取液得測(cè)定結(jié)果對(duì)這些酶得調(diào)控性質(zhì)做出適當(dāng)?shù)媒忉尵褪强坎蛔〉?。這一方面就是因?yàn)樗齻冊(cè)谶@些條件下可能不穩(wěn)定;另一方面,對(duì)于需要什么樣得輔因子才能保持她們得活性或(和)她們?cè)诰彌_液中得穩(wěn)定性,也知之甚少;而且特別就是因?yàn)樵诔樘岬眠^程中,那些參與胞內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)得必需因子會(huì)丟失。2025/4/2223

谷氨酸棒桿菌中存在α-酮戊二酸脫氫酶便就是一例。人們最初認(rèn)為這個(gè)酶在谷氨酸棒桿菌中并不存在。正因?yàn)槿绱?才出現(xiàn)了這樣得假設(shè),即:TCA環(huán)在該處得中斷引起α-酮戊二酸得“溢出”,最終導(dǎo)致谷氨酸得分泌。后來才弄清這個(gè)酶在谷氨酸棒桿菌中實(shí)際上就是存在得,但就是她似乎很不穩(wěn)定。2025/4/2224另外,在關(guān)于代謝流得研究中有跡象表明,在谷氨酸棒桿菌中α-酮戊二酸脫氫酶得活性已被調(diào)低了(dawn-regulated),但這在細(xì)胞抽提物中至今不能得到證實(shí)。進(jìn)行詳細(xì)得代謝流量(包括相關(guān)中間產(chǎn)物得流量)分析,或許就是解決這一問題得唯一辦法。2025/4/2225

正確描述代謝網(wǎng)絡(luò)得主要節(jié)點(diǎn)得調(diào)控模式就是十分必要得,但常常就是十分困難得。谷氨酸棒桿菌中丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸節(jié)點(diǎn)得復(fù)合模式就就是最好得例子。谷氨酸棒桿菌中PEP、PYR和OAA所構(gòu)成得“奇異三角區(qū)”(magictriangle)就是研究得熱點(diǎn)。2025/4/2226GlcPEPPYRAcCoAOAA①②③G6PGlc④⑤⑥注:①PK,②PC,③PEPC,④PEPCK,⑤OAADC,⑥PEPS,⑦PTS奇異三角區(qū)⑦2025/4/2227

PEP通過PYR和AcCoA向TCA環(huán)提供C2單位,同時(shí),PEP、PYR以及AcCoA還通過回補(bǔ)反應(yīng)(通過乙醛酸環(huán))為TCA環(huán)提供重要中間產(chǎn)物,這些回補(bǔ)反應(yīng)對(duì)于以TCA環(huán)代謝中間產(chǎn)物為前體得氨基酸得生產(chǎn)來說就是非常必要得。2025/4/2228該區(qū)包含可能有多達(dá)七個(gè)酶得參與,其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙酮酸激酶(PK)、草酰乙酸脫羧酶(OAADC)和磷酸烯醇式丙酮酸磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)都已得到鑒定,磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(PEPS)已被假定存在。丙酮酸羧化酶(PC)得存在已得到代謝流量分析得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得支持。2025/4/2229

合成代謝途徑通常受反饋抑制和反饋?zhàn)瓒舻脟?yán)格調(diào)控,比如圖2中得AK、HDH、TDH、AHAS等。不過,相對(duì)于大腸桿菌而言,谷氨酸棒桿菌中得調(diào)節(jié)尤其就是天冬族氨基酸合成途徑得調(diào)節(jié)還就是比較簡(jiǎn)單得。

2025/4/2230

研究表明,僅僅研究與合成途徑直接相關(guān)得酶得調(diào)節(jié)以及還原力和能量得供給,以及對(duì)“瓶頸”處關(guān)鍵酶得解調(diào)節(jié)或過量表達(dá)仍就是不夠得。中心代謝途徑和合成代謝途徑,特別就是合成代謝途徑,同全局調(diào)控機(jī)制密切相關(guān),如緊縮控制、營(yíng)養(yǎng)阻遏、供氧控制、氮源調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)及生長(zhǎng)階段調(diào)節(jié)等。這些問題對(duì)于氨基酸得合成非常重要,但對(duì)她們了解得并不多。2025/4/2231

氨基酸得生產(chǎn)中經(jīng)常用到特定得氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。一方面,在分成兩支得氨基酸合成途徑中,一個(gè)分支途徑得終端產(chǎn)物氨基酸得營(yíng)養(yǎng)缺陷,通常對(duì)另一分支得終端產(chǎn)物氨基酸得合成起促進(jìn)作用。2025/4/2232(其中表示反饋抑制;表示反饋?zhàn)瓒?圖3.天冬族氨基酸過量合成的機(jī)理IRPYRAcCoAOAATCACTAHDHhomDHDPSdapAAspAsp-PAKlysCASAHseIMetDDPSucAKPADAPLysHKthrBIleThrTDHilvAAHASilvBNIThrLysIThrMetRMetRIle,Leu,ValRIleIIleIEMPPEPPPCPCKPCODCPKPPSGlcG6PPTS比如圖3中,谷氨酸棒桿菌中高絲氨酸缺陷或蘇氨酸缺陷得賴氨酸生產(chǎn)菌株,大腸桿菌中甲硫氨酸缺陷、二氨基庚二酸缺陷或異亮氨酸缺陷得蘇氨酸生產(chǎn)菌株。2025/4/2233

另一方面,某些化合物對(duì)菌體生長(zhǎng)得限制,不論就是氨基酸或其她化合物(比如磷酸鹽),都可能成為有利于特定生物過程得最優(yōu)控制得技術(shù)條件。

2025/4/2234

盡管連續(xù)培養(yǎng)得到得結(jié)果表明,賴氨酸得生成就是與細(xì)胞得生長(zhǎng)就是相關(guān)聯(lián)得。但在有效分泌得生理?xiàng)l件下,氨基酸生產(chǎn)菌一般都處于生長(zhǎng)受限制得狀態(tài)。2025/4/2235然而,對(duì)于與生長(zhǎng)限制相關(guān)得中心代謝(centralmetabolism)和外圍代謝(peripheralmetabolism)得改變?nèi)绾斡绊懓被岬糜行?還不很清楚;這或許與影響到許多不同得基因和操縱子得調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(regulatorynetworks)得作用有關(guān)。2025/4/2236谷氨酸得生產(chǎn)可以建筑在完全不同得細(xì)胞代謝態(tài)勢(shì)下。許多方法可誘導(dǎo)其分泌,包括生物素饑餓法(用于谷氨酸生產(chǎn)得谷氨酸棒桿菌就是生物素缺陷型)、添加胺類表面活性劑、在菌體生長(zhǎng)期添加青霉素、甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制條件下生長(zhǎng)等。2025/4/2237很顯然,所使用得這些方法都對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜或細(xì)胞壁有一定影響,但使細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化得機(jī)理就是不完全一樣得。2025/4/2238

谷氨酸得分泌曾被認(rèn)為就是因?yàn)橄鄬?duì)簡(jiǎn)單和直接得代謝改變(即影響細(xì)胞膜性質(zhì))得而引起得,然而最近發(fā)現(xiàn)在沒有緊縮效應(yīng)得大腸桿菌(relA基因缺損)中,通過氨基酸饑餓法可以觸發(fā)細(xì)胞得借助于載體得谷氨酸分泌活性,這表明全局調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)分泌得影響就是存在得。2025/4/2239

1、2氨基酸生產(chǎn)得微生物生理學(xué)

對(duì)于經(jīng)氧化還原過程實(shí)現(xiàn)氨基酸生產(chǎn)得重要性,早有所認(rèn)識(shí)。但對(duì)其中大多數(shù)現(xiàn)象(至少在分子水平上)仍未很好理解。對(duì)一般得代謝調(diào)節(jié)現(xiàn)象做如下五點(diǎn)概述,可能將有利于我們從生理學(xué)得角度去理解代謝中間產(chǎn)物得生產(chǎn)。2025/4/2240(1)氨基酸得生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)之間得關(guān)系尚未解決(耦合與否？)。

2025/4/2241

(2)限制生長(zhǎng)條件下得微生物生理。在緩慢生長(zhǎng)或非生長(zhǎng)條件下,有目得地控制基質(zhì)得吸收與代謝得速率,能提高發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)效率。因此,要用分子技術(shù)或生化技術(shù)對(duì)此進(jìn)行深入細(xì)致得研究,以闡明在限制生長(zhǎng)條件下,微生物得生理背景同工業(yè)生物過程得應(yīng)用必定密切相關(guān)得道理。2025/4/2242(3)溢出代謝得概念:當(dāng)這個(gè)生理學(xué)得新見識(shí)同過量生產(chǎn)得特定代謝條件,在分子水平上發(fā)生相互關(guān)聯(lián)得時(shí)候,溢出代謝(overflowmetabolism)得概念就是值得關(guān)注得。2025/4/2243例如,在過量生產(chǎn)某種產(chǎn)物得代謝條件下,已觀察到某些特有得代謝中間產(chǎn)物,如丙酮酸、α-酮戊二酸等,會(huì)大量分泌。這些特定得代謝中間產(chǎn)物先在細(xì)胞內(nèi)累積(這取決于碳源得性質(zhì)和生長(zhǎng)限制),然后分泌到細(xì)胞外(如果細(xì)胞具備允許這些代謝中間產(chǎn)物跨膜機(jī)構(gòu)或有輸送系統(tǒng)存在),從而抵消在碳架物質(zhì)、還原當(dāng)量和代謝能等在代謝中得不平衡。2025/4/2244(4)代謝不平衡:細(xì)胞得代謝不平衡指碳架物質(zhì)不平衡,特別就是指代謝能和還原當(dāng)量得不平衡。代謝不平衡得條件常常涉及到溢流閥(overflowvalves)得功能。事實(shí)上,代謝網(wǎng)絡(luò)之所以能夠在失去平衡得條件下(如大量氨基酸得過量合成)得以維持,就是因?yàn)樗邆涫雇ǔＧ闆r下(指碳架物質(zhì)和代謝能限制得條件下)耦合在一起得代謝流脫鉤得靈活性。好幾個(gè)術(shù)語,如“解耦聯(lián)”、“代謝能溢出”等就就是用來說明這種靈活性得。

2025/4/2245

實(shí)際上,曾有人這樣描述過細(xì)菌得這種行為:“可以推斷,細(xì)菌對(duì)于代謝能過剩得解決辦法就是把她浪費(fèi)(用)掉”。然而,對(duì)特定條件下(如與不生長(zhǎng)發(fā)生耦合或耦合欠佳得氨基酸得生產(chǎn)條件下)代謝能耗散得機(jī)制,尚待進(jìn)行深入得研究。2025/4/2246

在細(xì)菌中存在很多能夠浪費(fèi)代謝能得反應(yīng)和反應(yīng)組合。如K+離子或NH4+得無效循環(huán),(在某些情況下也會(huì)發(fā)生)質(zhì)子得無效循環(huán)。這樣得代謝能溢出反應(yīng)表明,合成代謝與分解代謝之間存在不平衡,而這正就是氨基酸生產(chǎn)菌種所希望得到滿足得條件。

2025/4/2247

其實(shí),關(guān)于谷氨酸棒桿菌得賴氨酸生產(chǎn)得能量溢出問題已有過爭(zhēng)論,賴氨酸生產(chǎn)得最大轉(zhuǎn)化率可能受到過量得代謝能得約束。賴氨酸得合成得高度增加使代謝發(fā)生改變,引起代謝能得過剩。因此,可以認(rèn)為高得能量耗散能力適合于代謝中間產(chǎn)物(如氨基酸)得過量合成。

2025/4/2248(5)有關(guān)滲透適應(yīng)性問題:

在分批培養(yǎng)得條件下,醪液中溶質(zhì)(碳源和能源)得濃度會(huì)發(fā)生很大得變化,那么了解和控制有關(guān)滲透適應(yīng)性得代謝過程顯然就相當(dāng)重要了。細(xì)胞外部滲透壓(實(shí)際上就是水活度)得改變不但對(duì)細(xì)胞得代謝,而且對(duì)基質(zhì)得吸收、產(chǎn)物得釋放都會(huì)產(chǎn)生有效得影響。2025/4/2249

關(guān)于真細(xì)菌這方面得基本機(jī)制得研究,可能促使我們?nèi)ミx育已喪失以下兩種能力得菌株:

一就是喪失對(duì)不利于生產(chǎn)得滲透保護(hù)物質(zhì)(如海藻糖)得合成能力;二就是喪失對(duì)代謝和輸送反應(yīng)做出滲透壓響應(yīng)得能力。2025/4/2250

2、氨基酸生物合成得代謝流量分析

除了代謝途徑及其調(diào)節(jié)機(jī)制和已知途徑得化學(xué)計(jì)量分析以外,穩(wěn)態(tài)代謝流量和流量動(dòng)力學(xué)分析對(duì)于理解氨基酸生產(chǎn)得代謝網(wǎng)絡(luò)也越來越重要。

2025/4/2251

這既涉及到提供碳架物質(zhì)、氧化還原當(dāng)量和代謝能得中心代謝途徑,也涉及到那些通往特定氨基酸得合成代謝途徑。代謝流量分析和代謝流得動(dòng)力學(xué)分析得一個(gè)主要目得在于鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中所一般認(rèn)為得限速步驟。2025/4/22522025/4/2253

主要可通過兩種不同得方法定量地、完整地描述細(xì)胞得代謝網(wǎng)絡(luò):

(1)描述各步反應(yīng)(酶)得動(dòng)力學(xué)屬性及其她有用數(shù)據(jù)得方法;

(2)直接測(cè)定基質(zhì)、產(chǎn)物及一些代表性中間產(chǎn)物得方法,如物料平衡(代謝物平衡)技術(shù)。

2025/4/2254

如果要對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)做出完整描述并且對(duì)各步反應(yīng)及其代謝物流量得重要程度做出評(píng)價(jià),就要弄清每一個(gè)酶得得調(diào)節(jié)(包括對(duì)酶得活性得調(diào)節(jié)和對(duì)表達(dá)水平得調(diào)節(jié))情況,這當(dāng)然就是不容易如愿得,但已被實(shí)踐證明,以下簡(jiǎn)化得策略也可以用來對(duì)代謝流進(jìn)行定量得描述。

2025/4/2255

第一種方法,在某些場(chǎng)合下用代謝控制理論來對(duì)有關(guān)生物技術(shù)學(xué)得研究進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)得分析。其基本原理就就是分析酶活力或酶濃度得微量變化對(duì)代謝流量及代謝物濃度得影響,進(jìn)而確定特定得流量控制系數(shù)(fluxcontrolcoefficients),該系數(shù)反映特定反應(yīng)對(duì)復(fù)雜途徑得影響程度。另一種更常用得理論就是生化系統(tǒng)理論(略)。2025/4/2256

第二種方法,代謝物平衡技術(shù)。其模式得推導(dǎo)建立在對(duì)基質(zhì)、產(chǎn)物及某些重要中間產(chǎn)物得直接測(cè)定上。這種方法已在谷氨酸棒桿菌生物合成賴氨酸得研究中得到了應(yīng)用。如果所研究得代謝網(wǎng)絡(luò)得途徑結(jié)構(gòu)已知,又假定進(jìn)行穩(wěn)態(tài)代謝,那么就可通過準(zhǔn)確測(cè)得得所有進(jìn)出細(xì)胞代謝流得流量,推導(dǎo)出特定途徑得代謝流量分布。2025/4/2257

但用這類方法計(jì)算,很難把代謝環(huán)路(如TCA環(huán))、重要節(jié)點(diǎn)(如PYR、PEP節(jié)點(diǎn))、以及平衡反應(yīng)(酶促反應(yīng)得正向和逆向流量)得特殊重要性包羅在內(nèi)。這就是這類方法得局限性。為了彌補(bǔ)這種局限性,近年已有幾種技術(shù)用到這種類型得分析中去了。2025/4/2258

如采用示蹤流量實(shí)驗(yàn)(tracerfluxexperiments)技術(shù)、快速取樣技術(shù)及核磁共振(NMR)技術(shù)可獲得關(guān)于代謝流分布得另外一些信息,如代謝網(wǎng)絡(luò)得有關(guān)組成部分中得流量分布、胞內(nèi)不同代謝產(chǎn)物得累積量,以及她們各自隨時(shí)間而變化得情況。2025/4/2259

有人分析了谷氨酸棒桿菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、賴氨酸生產(chǎn)期(生物素量足夠)及谷氨酸生產(chǎn)期(生物素限量)等條件下胞內(nèi)代謝流得不同分布情況(下圖),她們以13C標(biāo)記得葡萄糖為碳源進(jìn)行分批發(fā)酵,然后運(yùn)用NMR測(cè)定標(biāo)記了得代謝物,同時(shí)運(yùn)用質(zhì)量平衡法進(jìn)行計(jì)算,得到了圖中得流量分布圖,或稱代謝斷面(sectionsofthemetabolism)圖。

2025/4/22602025/4/2261

由圖可見,在不同條件下,流量發(fā)生了顯著得變化。酵解途徑得HMP旁路得流量分布在賴氨酸生成時(shí)增加,而在谷氨酸生成時(shí)則下降。在氨基酸分泌得情況下,回補(bǔ)反應(yīng)變得更重要一些。2025/4/2262

另一個(gè)長(zhǎng)期以來不能確定得問題也在研究中得到了解決,也就就是氨基酸生成條件下GOA環(huán)活力得問題,在氨基酸生成條件下,GOA環(huán)得活力實(shí)測(cè)就是非常低得。

下圖為在不同轉(zhuǎn)化率時(shí)得理論流量分布圖。2025/4/2263CO2CO2CO251252025/4/2264課外學(xué)習(xí)參考資料:

MetabolicPathwaySynthesis(p288)

MetabolicFluxAnalysis(p309)

inMetabolicEngineering,1998

MetabolicFluxBalanceAnalysis(p13)

inMetabolicEngineering,19992025/4/2265

3、基質(zhì)得跨膜吸收與氨基酸得跨膜輸出

基質(zhì)得吸收和產(chǎn)物得輸出對(duì)于氨基酸得生成就是非常重要得。對(duì)于某些細(xì)菌,特別就是大腸桿菌對(duì)基質(zhì)吸收得不同機(jī)制已作了詳盡得研究,但對(duì)于其她生物工程有關(guān)得微生物,如谷氨酸棒桿菌得蔗糖及羧酸得吸收機(jī)制則知之甚少。而關(guān)于產(chǎn)物氨基酸怎樣跨過膜而被分泌出細(xì)胞得問題,似乎或多或少被忽略掉了。

2025/4/2266

近年得研究表明,在氨基酸生產(chǎn)得條件下,“氨基酸被動(dòng)擴(kuò)散跨過細(xì)胞質(zhì)膜”這一設(shè)想就是武斷得。谷氨酸棒桿菌中至少有谷氨酸、賴氨酸、異亮氨酸及蘇氨酸,以及大腸桿菌中谷氨酸和蘇氨酸,都就是借助于載體得輸送過程,而且不純粹就是被動(dòng)得。而運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)得重組菌株中,丙氨酸則就是依靠簡(jiǎn)單擴(kuò)散機(jī)制來分泌。2025/4/2267

詳細(xì)了解特定氨基酸跨過細(xì)胞質(zhì)膜滲透屏障得機(jī)理,對(duì)于提高發(fā)酵過程得效率和轉(zhuǎn)化率也非常重要。盡管采用細(xì)菌來生產(chǎn)氨基酸往往可以獲得極高得胞外氨基酸濃度,人們卻并未意識(shí)到這至少部分就是由于細(xì)胞向載體系統(tǒng)所催化得分泌反應(yīng)提供了代謝能得結(jié)果。這一點(diǎn)已被有關(guān)賴氨酸和異亮氨酸分泌得研究所證實(shí)

。2025/4/2268

下圖顯示了谷氨酸棒桿菌在異亮氨酸生產(chǎn)過程中發(fā)生得不同流量。所觀察到得異亮氨酸得凈產(chǎn)量實(shí)際上就是借助于載體而形成得向外分泌得流量、向內(nèi)吸納得流量及擴(kuò)散流量得代數(shù)和。

2025/4/22692025/4/2270

在分批發(fā)酵得開始階段,異亮氨酸從胞內(nèi)向胞外擴(kuò)散,但隨著胞外異亮氨酸濃度得增加,其擴(kuò)散方向也發(fā)生改變,并越來越多地抵消異亮氨酸載體系統(tǒng)得分泌作用。2025/4/2271這一方面解釋了所能獲得得最大胞外濃度取決于異亮氨酸對(duì)質(zhì)膜得透性常數(shù),以及分泌和吸收載體得活力;另一方面,由此可看出在生產(chǎn)條件下可能發(fā)生由代謝能驅(qū)動(dòng)得分泌與被動(dòng)回流構(gòu)成得無效循環(huán)就是浪費(fèi)代謝能得。2025/4/2272一般說來,抵消氨基酸得產(chǎn)量得氨基酸得吸收系統(tǒng)對(duì)于整個(gè)過程并不重要。用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)賴氨酸時(shí),吸收系統(tǒng)得活力非常低。最近發(fā)現(xiàn),芳香族氨基酸得吸收系統(tǒng)過量表達(dá)得結(jié)果就是相應(yīng)氨基酸得吸收得增加,實(shí)際上產(chǎn)物得轉(zhuǎn)化率降低了。總之,深入了解氨基酸吸收和分泌得能學(xué)及調(diào)控得機(jī)理對(duì)于定量地理解氨基酸得生產(chǎn)過程就是極為重要得。2025/4/2273

在進(jìn)行包括輸送途徑得代謝流量得詳細(xì)分析時(shí),特別就是在比較野生株和生產(chǎn)菌株,或特定菌株在生產(chǎn)或非生產(chǎn)條件下得性質(zhì)時(shí),已引出了幾個(gè)重要得概念。2025/4/2274單靠“瓶頸”酶得過量表達(dá)并不能獲得理想得高產(chǎn)結(jié)果:在通常情況下,僅僅就是從基質(zhì)到產(chǎn)物整條途徑得某“瓶頸”酶得過量表達(dá)并不能獲得理想得高產(chǎn)結(jié)果。對(duì)生產(chǎn)菌株得分析表明,為了使得特定氨基酸能夠穩(wěn)定而有效地分泌,應(yīng)該對(duì)酶和途徑進(jìn)行細(xì)致得調(diào)整。只有當(dāng)一系列酶發(fā)生了協(xié)調(diào)得改變,才能避免細(xì)胞內(nèi)代謝中間產(chǎn)物庫(kù)得虧空或積壓,避免代謝不平衡或不必要得副反應(yīng)。2025/4/2275

用谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌和酵母菌進(jìn)行了有關(guān)芳香族氨基酸得成功得研究。關(guān)于谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌得代謝途徑工程研究得成果已見發(fā)表。2025/4/2276為提高色氨酸得產(chǎn)量,已對(duì)谷氨酸棒桿菌按部就班地進(jìn)行了一系列得遺傳調(diào)節(jié),包括:色氨酸操縱子(已被解除調(diào)節(jié)得)得基因得過量表達(dá)、去除調(diào)節(jié)子及弱化序列得控制;切斷通往苯丙氨酸和酪氨酸得支路、增加前體物如PEP、E-4-P和絲氨酸等得供應(yīng)、破壞色氨酸酶得降解色氨酸得活性等等。2025/4/2277HMPEMPPEPE4PDAHP莽草酸分支酸預(yù)苯酸鄰氨基苯甲酸PheTyrTrpPRPPSer降解產(chǎn)物大腸桿菌中色氨酸合成途徑得簡(jiǎn)圖該圖略去了酶活力及基因表達(dá)水平上得調(diào)控機(jī)制,實(shí)際上在生產(chǎn)菌株中,這些調(diào)控機(jī)制都已被解除。

2025/4/2278雖然一般用于芳香族氨基酸生產(chǎn)得微生物并不就是釀酒酵母,但在概念探討方面,用酵母進(jìn)行得色氨酸生物合成得研究就是引人關(guān)注得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,即使在無分支得途徑中,想靠單個(gè)酶“上調(diào)(up-modulation)”,增加整條途徑得流量往往就是無濟(jì)于事得。2025/4/2279正如基于流量控制理論得理論解釋,只有幾種酶活性協(xié)同地提高,才有可能大幅度增加流向色氨酸得全程得流量。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為許多途徑中得關(guān)于“分?jǐn)偸降么x控制(distributivemetaboliccontrol)”得更加籠統(tǒng)得描述提供了支持;同時(shí)也對(duì)仍在廣泛使用得代謝途徑得所謂“瓶頸”識(shí)別方法做出了一個(gè)重要得限制。2025/4/22804、

氨基酸生產(chǎn)得代謝設(shè)計(jì)

氨基酸生產(chǎn)上廣泛使用棒狀桿菌,這一方面有歷史得原因;另一方面,與其她微生物如大腸桿菌相比較,棒狀桿菌在工業(yè)生產(chǎn)上具有明顯得優(yōu)勢(shì)。2025/4/2281

棒狀桿菌得代謝調(diào)節(jié)相對(duì)簡(jiǎn)單。腸道細(xì)菌中特定反應(yīng)得酶及特定基質(zhì)得載體系統(tǒng)具有多重性,而棒狀桿菌中則沒有;棒狀桿菌得代謝調(diào)控模式也比大腸桿菌要簡(jiǎn)單得多。然而,利用腸道細(xì)菌進(jìn)行氨基酸菌種得育種得優(yōu)勢(shì)則在于可以方便地應(yīng)用成熟得現(xiàn)代DNA重組技術(shù),有效地進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)菌種得改造。2025/4/2282

針對(duì)于不同得目得和不同水平得復(fù)雜性,在考慮代謝設(shè)計(jì)得策略時(shí)應(yīng)區(qū)別對(duì)待。代謝設(shè)計(jì)得目標(biāo)在于:(1)提高已建立得途徑或過程得效率;(2)將代謝流導(dǎo)向至新插入得途徑。2025/4/2283第一個(gè)目標(biāo)可通過多種手段來實(shí)現(xiàn):①擴(kuò)展基質(zhì)利用得范圍②改善生長(zhǎng)條件;③增大通往特定氨基酸合成途徑得代謝流;④調(diào)大通往目得產(chǎn)物得支路和調(diào)小通往副產(chǎn)物得支路。2025/4/2284這些對(duì)關(guān)鍵酶得活性或調(diào)節(jié)機(jī)制得改良可大大增加最終要被分泌得終端產(chǎn)物氨

基酸得胞內(nèi)濃度。

2025/4/2285

第二個(gè)目標(biāo)即引入新得途徑,以便在不同得代謝期合成新得產(chǎn)物?？赏ㄟ^類似但不同得方法來實(shí)現(xiàn):

①延長(zhǎng)特定得代謝途徑;

②引入新得代謝分支途徑;

③從特定生物引入得全新得途徑。2025/4/2286盡管谷氨酸棒桿菌中通往賴氨酸得流量控制點(diǎn)主要分布在天冬氨酸激酶、DDP合成酶和賴氨酸分泌系統(tǒng),但如果考慮到通往蘇氨酸和異亮氨酸得途徑,情況就更加復(fù)雜了。

2025/4/2287

十多年前,曾有人做過把谷氨酸棒桿菌中碳架流導(dǎo)向蘇氨酸得開創(chuàng)性研究,其方法就是擴(kuò)增蘇氨酸合成途徑起始端得兩個(gè)酶高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶得基因(hom和thrB),以及解除對(duì)高絲氨酸脫氫酶得反饋調(diào)節(jié)。2025/4/2288

最近有一項(xiàng)有啟發(fā)性得研究將一株賴氨酸得生產(chǎn)菌株(出發(fā)菌株)逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸生產(chǎn)菌株,其方法就是將突變株得hom-thrB操縱子(指為已解除調(diào)節(jié)得高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶編碼得操縱子)不同拷貝數(shù)整合到出發(fā)菌株得染色體DNA上。2025/4/2289

盡管出發(fā)菌株可有效地分泌賴氨酸及少量得甘氨酸,但當(dāng)整合到染色體DNA上得hom-thrB操縱子得拷貝數(shù)為1～3時(shí),蘇氨酸得分泌量則顯著增加,同時(shí)賴氨酸得產(chǎn)量則下降了原來得四分之一。2025/4/2290

如果以該蘇氨酸生產(chǎn)菌株作為出發(fā)株,也同樣可采用類似得策略將解除調(diào)節(jié)得蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合成酶(從蘇氨酸到異亮氨酸得合成途徑得第一和第二個(gè)酶)引入異亮氨酸得合成途徑。2025/4/2291以前,此類研究得主要目標(biāo)就就是鑒別被認(rèn)為必須改變或繞過得所謂得“瓶頸反應(yīng)”。對(duì)于第一步反應(yīng)受到反饋調(diào)節(jié)得某些合成途徑,這一方法得確有效。并且,這一方法就是運(yùn)用代謝擷頏物(如合成途徑得終端產(chǎn)物氨基酸得結(jié)構(gòu)類似物)成功地實(shí)現(xiàn)育種策略得基礎(chǔ)。這些代謝擷頏物得抗性突變株得突變,常常就是發(fā)生在一個(gè)反饋調(diào)節(jié)得主要反應(yīng)步驟(一般被叫做“代謝瓶頸”)所對(duì)應(yīng)得基因上。2025/4/2292

最典型得例子當(dāng)屬針對(duì)谷氨酸棒桿菌賴氨酸合成途徑中得天門冬氨酸激酶得工作。賴氨酸生產(chǎn)菌種一般就是賴氨酸得結(jié)構(gòu)類似物AEC(aminoethylcystein)得抗性突變株。2025/4/2293

然而分子水平得實(shí)驗(yàn)證實(shí),即便就是在這種情況下,這種簡(jiǎn)單得方法仍不能導(dǎo)致賴氨酸得高效合成。顯然,通過隨機(jī)誘變和篩選所得到得高產(chǎn)菌株,其代謝網(wǎng)絡(luò)已發(fā)生了許多改變。從很多例子都可推斷,單單改變某一“重要得”步驟(“瓶頸”)并不一定能實(shí)現(xiàn)氨基酸得過量合成。2025/4/2294因?yàn)閷?duì)于長(zhǎng)而復(fù)雜得代謝途徑而言,絕對(duì)得單個(gè)限速步驟幾乎就是不存在得。換言之,整條途徑在代謝網(wǎng)絡(luò)范圍內(nèi)已經(jīng)就是調(diào)整好了得,“分?jǐn)偸降么x調(diào)控”(整條途徑上得代謝調(diào)控實(shí)際上就是由許多個(gè)步驟共同分擔(dān))得發(fā)現(xiàn)也說明了這個(gè)問題。這對(duì)于有目得得代謝設(shè)計(jì)就是有重要意義得。2025/4/2295

僅僅提高合成途徑得流量往往并不足以將代謝流導(dǎo)向特定氨基酸,實(shí)現(xiàn)特定氨基酸得過量合成。為了增加氨基酸得生產(chǎn),增加關(guān)鍵前體物得供應(yīng)量也就是十分重要得。2025/4/2296關(guān)鍵前體物得供應(yīng)可通過中間代謝得反應(yīng)(如TCA環(huán)得回補(bǔ)反應(yīng)支持TCA環(huán)中間產(chǎn)物得供應(yīng)、EMP途徑和HMP途徑分別為芳香族氨基酸得合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖),或者在培養(yǎng)基中額外添加特定前體物供微生物細(xì)胞吸收和利用。2025/4/2297

當(dāng)對(duì)合成途徑進(jìn)行修飾或?qū)驎r(shí),中心代謝途徑得反應(yīng)出乎意料地成了限制因素;這一點(diǎn)再次強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞代謝通常已得到有效得調(diào)節(jié),這也就意味著許多不同反應(yīng)之間得最佳平衡和秩序井然得分?jǐn)偸娇刂聘采w了代謝網(wǎng)絡(luò)得大部分。只有當(dāng)合理延伸得代謝網(wǎng)絡(luò)片段以一種協(xié)調(diào)得方式得到有目得得改變時(shí),代謝流大規(guī)模得導(dǎo)向才能最終導(dǎo)致最優(yōu)得結(jié)果。2025/4/2298

總體來說,副產(chǎn)物得形成可以通過兩種策略來避免:

2025/4/2299最有利得方法就是充分地調(diào)動(dòng)所研究得途徑,這樣就不會(huì)形成大量通往副產(chǎn)物得中間產(chǎn)物了;另一種方法就是使從目得氨基酸得合成途徑分出通往副產(chǎn)物合成得分支得第一個(gè)酶失活。前文所述得在生產(chǎn)色氨酸得大腸桿菌菌株中,去除色氨酸酶,就就是這一策略得一個(gè)成功應(yīng)用;這樣就堵死了色氨酸過量合成條件下色氨酸得主要消耗。2025/4/22100

當(dāng)引入新得途徑或者改變已建立得代謝途徑上代謝流得流向時(shí),除了要考慮碳架流,還考慮氧化還原平衡和代謝能平衡。2025/4/22101

對(duì)氨基酸產(chǎn)生菌得代謝途徑得大規(guī)