3植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)3.1培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù)3.2基本操作3.3離體培養(yǎng)體系的建立3.1培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù)成分母液配方pH值制備3.1.1基本成分水礦質(zhì)元素碳水化合物生理活性物質(zhì)生長調(diào)節(jié)劑附加物天然添加物1.水（H2O

）水：可靠的水質(zhì)是實(shí)驗(yàn)的保證可以使用以下裝置：水質(zhì)軟化裝置離子交換反向滲透蒸餾離子交換設(shè)備2.礦質(zhì)元素大量必需元素（加入mM量級(jí)）：氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫微量必需元素（加入μM量級(jí)）：鐵、錳、硼、鋅、銅、鉬其他：碘、鎳、鈷、鋁等3.碳水化合物作用：提供碳源、維持滲透壓。通常碳源用蔗糖，高壓滅菌后蔗糖大部分水解為葡萄糖和果糖。濃度范圍1～5%，但在幼胚、莖尖、花藥等培養(yǎng)時(shí)可達(dá)10％甚至更高。低濃度（1.5～2.5％）的糖有利于木質(zhì)部的生長；高濃度（3～4％）有利于韌皮部；4.生理活性物質(zhì)維生素肌醇氨基酸及其酰胺類單核苷酸維生素（0.1～10mg/L）作用：輔酶注意事項(xiàng)：易高溫降解，過濾滅菌。硫胺素（VB1）：全面促進(jìn)生長。吡哆醇（VB6）煙酸（VB3）VC：抗氧化劑，防止褐變。肌醇作用：幫助活性物質(zhì)發(fā)揮作用，使培養(yǎng)物快速生長，促進(jìn)胚狀體及芽的形成。一般用量：50～100mg/L。氨基酸及酰胺有機(jī)氮源、緩沖作用、調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡。甘氨酸：促進(jìn)離體根的生長。絲氨酸、谷氨酰胺：有利于花藥胚狀體或不定芽的分化。水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH）：氨基酸混合物。5.植物生長調(diào)節(jié)劑：目前公認(rèn)的已用于植物組織培養(yǎng)和生長操作的有六大類植物激素。它們是：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯和油菜素內(nèi)酯。此外還有一些具有植物激素特征的化合物。天然生長素在植物中發(fā)現(xiàn)的天然生長素主要是吲哚-3-乙酸（IAA）。在植物分生組織區(qū)濃度很高，與許多生理反應(yīng)有關(guān)。與植物組培有關(guān)的作用主要是在細(xì)胞分裂和有絲分裂過程。生長素的一個(gè)主要應(yīng)用是促進(jìn)生根，因此被廣泛用于切段的微繁和生根培養(yǎng)。然而，不可忽視它可抑制根的伸長。合成生長素：最廣泛使用的合成生長素：吲哚-3-丁酸IBA、α-萘乙酸（NAA）和2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）。通常與細(xì)胞分裂素聯(lián)用。這些生長素對(duì)光、溫的穩(wěn)定性高于IAA，可以經(jīng)高壓滅菌。其余較少用的生長素包括：2-萘氧乙酸（NOA）、4-氯苯氧乙酸（4-CPA）、2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）、2,4,5-三氯苯氧基乙酸（2,4,5-T）、3,6-二氯茴香酸(麥草畏)、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定）。細(xì)胞分裂素

細(xì)胞分裂素是腺嘌呤6位上的N被其他基團(tuán)取代的衍生物，與生長素共同作用促使植物細(xì)胞分裂。玉米素是最早被分離的細(xì)胞分裂素。呋喃甲基腺嘌呤和芐基腺嘌呤是最早合成的。細(xì)胞分裂素主要在植物的根部合成，運(yùn)輸?shù)角o干。在組織培養(yǎng)中對(duì)芽的形成和器官分化起主要作用。均二苯脲（DPU）從椰子汁中提取，具有類似細(xì)胞分裂素活性，常作為微繁的附加成分。常用的細(xì)胞分裂素：芐基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、激動(dòng)素（KT）。Thidiazuron（TDZ）已廣泛用于組織培養(yǎng)。TDZ抑制細(xì)胞分裂素氧化酶，從而降低細(xì)胞分裂素的新陳代謝，使得細(xì)胞分裂素在組培過程中維持較高的水平。

赤霉素赤霉素對(duì)熱敏感，因此在組培中不常用。使用時(shí)，在培養(yǎng)基高壓滅菌后，對(duì)它單獨(dú)過濾除菌。它們主要的作用是刺激植物亞頂端分生組織的擴(kuò)展生長。因此常用來刺激芽的伸長，如對(duì)矮稻的生物測(cè)定可明顯看到其作用。赤霉酸（GA3）是在組培中用得最多的赤霉素。脫落酸脫落酸（ABA）是植物生長的強(qiáng)有效的抑制劑。與其他生長因子相互起作用。在組培中廣泛用來促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)育為成熟的胚，并轉(zhuǎn)化為小植株。乙烯乙烯是氣態(tài)的，是一種揮發(fā)性的激素。要將這種激素降低到最小程度，培養(yǎng)容器大小，尺寸以及密閉方法就顯得非常重要。在過去的幾年發(fā)展了大量的植物生長調(diào)節(jié)劑。由于它們更強(qiáng)的活性、穩(wěn)定性以及低廉的價(jià)格，在植物組培中它們的用途也不斷地?cái)U(kuò)展。生長素/細(xì)胞分裂素相互作用

在Skoog和Miller工作的基礎(chǔ)上，已經(jīng)建立起很好的生長素－細(xì)胞分裂素比率關(guān)系，用于組培中決定芽和/或根的形成。細(xì)胞分裂素對(duì)生長素的濃度比值高時(shí)，傾向于形成芽，而生長素細(xì)胞分裂素的濃度比值高時(shí)，傾向于形成根。兩種激素的比值處于中間水平時(shí)增強(qiáng)愈傷組織的形成。6.附加物膠凝劑螯合劑滲透劑活性炭其他膠凝劑：瓊脂：從藻類中提取的天然產(chǎn)品，7～10g/L。瓊脂一般都含有雜質(zhì)，特別是鈣、鎂和微量元素，在營養(yǎng)研究時(shí)應(yīng)避免使用。Gelrite：一種吉蘭多糖（異多糖），是假單胞菌產(chǎn)生的胞外多糖，2.0～2.5g/L。不同品牌其物理化學(xué)特征不同螯合劑Chelates可與金屬陽離子（主要是鐵）形成復(fù)合物，使其溶解于溶液中。EDTA：乙二胺四乙酸EDDHA：乙二胺二鄰羥苯基大乙酸鐵鈉滲透劑Osmoticagents

組培培養(yǎng)基的滲透能力影響水和各種成分的可用性。蔗糖的濃度大于2%常常是由于其滲透效果而非作為碳源的作用。大多數(shù)情況下甘露醇僅作為有滲透效果的糖醇，而不參與代謝變化?；钚蕴緾harcoal（0.5～3％）使培養(yǎng)基變黑（根部環(huán)境）。吸附分子，特別是帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的植物生長調(diào)節(jié)劑?？赡芎写碳ひ蛩兀ㄈ缍喟罚Ｓ捎谖侥芰Φ牟煌?，活性炭的商標(biāo)很關(guān)鍵。在高壓滅菌前加入會(huì)降低培養(yǎng)基的pH值，使瓊脂不易凝固。7.天然添加物椰乳（CM）、水解酪蛋白（CH）、酵母提取液（YE）等。作用：提供天然微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑等。缺點(diǎn)：成分不確定，影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。3.1.2母液（貯備液）10倍、100倍或更高倍數(shù)，冰箱貯存。貯備液Ⅰ：大量元素20倍貯備液Ⅱ：微量元素200倍貯備液Ⅲ：鐵鹽200倍貯備液Ⅳ：有機(jī)物質(zhì)（除了蔗糖）200倍各種激素貯備液分別配制：0.1mg/L或1mg/L注意事項(xiàng)：各種藥品要充分溶解后才能混合?；旌蠒r(shí)要注意先后順序，避免相互結(jié)合生成沉淀。鐵鹽單獨(dú)配制，一般用硫酸亞鐵和EDTA-Na2通過加熱形成穩(wěn)定的螯合鐵貯存。生長素類先用少量95％乙醇或1mol/LNaOH加熱助溶后，用水定容。細(xì)胞分裂素類先用少量1mol/L鹽酸溶解，再用水定容。3.1.3配方基本培養(yǎng)基：MS、B5、White等。激素配比：主要是生長素和細(xì)胞分裂素的比例。如：MS+BA2+NAA0.1~0.23.1.4pH值一般5.6～6.0。高壓滅菌后稍有下降，所以滅菌前要略調(diào)高。大于6.0，培養(yǎng)基變硬；低于5.0，瓊脂凝固不好。一般用1mol/L的鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。培養(yǎng)階段pH值會(huì)改變

3.1.5培養(yǎng)基制備加一定量水，依次加入需要量的母液。加入需要量的蔗糖，溶解，定容。調(diào)節(jié)pH值。加入需要量的瓊脂，加熱溶解（要不斷攪拌）。分裝：在瓊脂未凝時(shí)（40℃左右凝固）分裝，量一般為容器的1/4～1/3，注意不要沾到容器口。封口。滅菌。存放。注意事項(xiàng)：不能高壓滅菌的物質(zhì)，在滅菌后溫度下降但瓊脂尚未凝固時(shí)，在無菌條件下，用過濾除菌法加入。配好的培養(yǎng)基一般應(yīng)在兩周內(nèi)用完。3.2離體培養(yǎng)體系的建立3.2.1外植體的選擇和處理3.2.2培養(yǎng)條件3.2.1外植體外植體（explant）從需要培養(yǎng)的母株分離的一小塊植物材料。接種體（inoculum）已經(jīng)培養(yǎng)的植物材料用于繼代培養(yǎng)。地上部比地下部清潔。外植體越小，克服特殊植物病理問題（如病毒、支原體、細(xì)菌）的機(jī)會(huì)越大，但同時(shí)也降低了存活率。內(nèi)部的組織比外部的不易受到污染。不同外植體反應(yīng)不總是相同。外植體的選擇2.外植體的滅菌根據(jù)培養(yǎng)容器大小將材料切割成適當(dāng)大小；流水（自來水）沖洗植物表面；在酒精中晃動(dòng)幾秒鐘；HgCL2（0.1～1%）＋吐溫（潤濕劑）2滴/100ml：3～5min；用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗；商業(yè)漂白劑7~15%＋吐溫2滴/100ml：10～30min；再用經(jīng)過高壓滅菌的蒸餾水沖洗幾次。注釋自來水：除去塵土，清潔劑去掉表面垢污。酒精：70%酒精使蛋白質(zhì)失活。95%有時(shí)被用來溶解外植體表面的臘質(zhì)層。

NaOCl（商業(yè)漂白劑）或Ca(OCl)2：活性在于Cl-和其他氧化反應(yīng)。

HgCl2活性在于Cl-和使蛋白質(zhì)失活的重金屬。潤濕劑（例如：吐溫20或80）可以加到上述溶液中。*汞對(duì)環(huán)境是有毒的，因此汞溶液使用后收集到一個(gè)大的容器中。在溶液中加入氨水，汞可以沉淀。蘭花花枝的無菌消毒3.2.2培養(yǎng)條件溫度光照濕度氣相條件溫度事實(shí)上要對(duì)每種特定的植物甚至每一特定階段調(diào)整最優(yōu)化的溫度。對(duì)大多數(shù)植物日間培養(yǎng)室的溫度調(diào)節(jié)點(diǎn)在22±2°C。夜間的溫度通常要低幾度。容器內(nèi)的溫度要比室溫高（可達(dá)5°C）。培養(yǎng)室的一個(gè)主要的問題是維持始終如一的溫度。保障措施：需要安裝一個(gè)很大的自動(dòng)調(diào)溫器，當(dāng)溫度太高時(shí)可以關(guān)掉燈光光通常用熒光燈，在架子上平行安放。大多數(shù)情況是裝在培養(yǎng)室的外面，以避免熱。以下的光參數(shù)是重要的：光周期和光強(qiáng)光周期大多數(shù)情況光周期不是最重要的。通常是16小時(shí)光照。為了節(jié)省能源和降低安裝費(fèi)培養(yǎng)室內(nèi)不同架子上的燈不必同時(shí)打開。光強(qiáng)適當(dāng)?shù)墓饷芏仁?0μmolm-2s-1，這一光強(qiáng)下為混合培養(yǎng)類型。自養(yǎng)型組培則需要達(dá)到250μmolm-2s-1。依據(jù)不同類型的容器，容器內(nèi)的光強(qiáng)或多或少被減弱。PARPhotosyntheticactiveradiationPAR＝每秒每平方米波長在400~700nm之間的光子摩爾數(shù)

LUX是一個(gè)不太合適的單位，因?yàn)樗谌搜鄣拿舾行怨庾V

光譜是光形態(tài)建成的因素（植株高度以及葉片伸展）重要的比率：藍(lán)光/紅光，紅光/紅外光譜因燈不同而不同濕度Humidity

培養(yǎng)室的相對(duì)濕度（RH）通常不控制。標(biāo)準(zhǔn)容器其頂部空間水蒸氣飽和。容器內(nèi)的RH可以通過不同的裝置控制通風(fēng)，底部冷卻，瓊脂濃度。容器氣體組分在組培容器中頂部空間的成分組成與溫室空氣有顯著的區(qū)別，見下表：其他揮發(fā)性氣體含量微小。componentgreenhouseenvironmentcontainer

atmosphereO222%aslowas4%N277%upto87%CO2

365-1000ppmupto20%water

vapour60-85%±100%ethylene5ppb-100ppb>2ppm頂部空間氣體成分對(duì)植物生長發(fā)育的影響：矮化或白化玻璃化軟腐自養(yǎng)/混合營養(yǎng)乙烯傷害矮化或白化有限的氣體交換對(duì)組培的效應(yīng)組培容器盡可能密閉，以防止污染。然而，在一個(gè)完全密閉的容器中可能出現(xiàn)氣體的堆積，對(duì)植物生長造成不利，如產(chǎn)量減少、白化病或壞疽。Fig.1:growthreductionFig.2Albinism玻璃化Hyperhydricity玻璃化是在植物組培過程中的一種生理混亂現(xiàn)象。程度有低高之分。程度低的話在培養(yǎng)初期不會(huì)遇到大的問題。但程度高的話在培養(yǎng)的各個(gè)階段都有可能遇到嚴(yán)重的問題。玻璃化癥狀玻璃化的癥狀通常不易用肉眼觀察到。植物易感或培養(yǎng)條件非常不利則會(huì)出現(xiàn)可見的癥狀。培養(yǎng)條件非常不利的例子：細(xì)胞分裂素濃度過高水分含量過高容器過于密實(shí)膠凝劑濃度過低產(chǎn)生原因原因是多方面的。然而許多因素只是當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)的條件沒有達(dá)到最優(yōu)化時(shí)表現(xiàn)誘導(dǎo)或激發(fā)玻璃化。下列可以作為考慮的因素：外植體：種類，栽培變種；繼代間隔時(shí)間；繼代次數(shù)；切割方法；在培養(yǎng)基上的放置情況。

培養(yǎng)基：凝膠的濃度和類型；有無液體層；細(xì)胞分裂素的種類及水平；鹽濃度。容器：氣體組成和氣體濃度。

環(huán)境：溫度；光強(qiáng)和光質(zhì)，濕度；空氣流動(dòng)補(bǔ)救方法培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基用較高濃度的凝膠固化，也可以使用有較高凝固能力的凝膠劑；降低細(xì)胞分裂素的濃度。容器特征：不太密實(shí)的裝置，比如氣透性膜