體外單倍體誘導(dǎo)與單倍體育種第13章

提要體外誘導(dǎo)方法單倍體育種技術(shù)花藥培養(yǎng)花粉培養(yǎng)

體外單倍體誘導(dǎo)體外單倍體誘導(dǎo)：通常是指利用離體培養(yǎng)花藥或小孢子的方法，誘導(dǎo)形成單倍體植株花粉植株的形態(tài)發(fā)生：愈傷組織型類胚體型混合型

體外單倍體誘導(dǎo)單倍體育種：將具有單套染色體的單倍體植物，經(jīng)人工染色體加倍，使其成為純和二倍體，從中篩選出優(yōu)良個(gè)體，直接繁育成新品種；或選出具有單一優(yōu)良性狀的個(gè)體，作為雜交育種的原始材料。

單倍體育種優(yōu)點(diǎn)：可以控制雜種分離，縮短育種周期；排除顯、隱性基因的干擾，提高選擇效率；加速自交系育成；進(jìn)行誘變育種，對(duì)栽培品種進(jìn)行純化復(fù)壯。獲得單倍體植物的重要途徑：花藥、花粉培養(yǎng)植物小孢子發(fā)育過(guò)程花粉粒形成：初期花藥（原表皮和其內(nèi)的有分裂能力的細(xì)胞構(gòu)成）

四角隅處出現(xiàn)孢原細(xì)胞

分裂

四棱形花藥

孢原細(xì)胞平周分裂

外層周緣細(xì)胞+原表皮

花粉囊壁

內(nèi)層造孢細(xì)胞

分裂

花粉母細(xì)胞

減數(shù)分裂

花粉粒

植物小孢子發(fā)育過(guò)程植物小孢子發(fā)育過(guò)程花粉粒的發(fā)育

未成熟花粉粒（小孢子）有絲分裂

營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞（大）

生殖細(xì)胞（紡錘形）分裂

2個(gè)精子（雄配子）3-細(xì)胞型花粉粒：生殖細(xì)胞在花粉粒中進(jìn)行分裂，成熟花粉有3個(gè)細(xì)胞2-細(xì)胞型花粉粒：生殖細(xì)胞在花粉管中進(jìn)行分裂，成熟花粉只有2個(gè)細(xì)胞開(kāi)花時(shí)，花粉粒成熟，花藥裂開(kāi)植物小孢子發(fā)育過(guò)程花藥和花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)：將成熟或未成熟的花藥從母體植株上取下，在無(wú)菌條件下，生長(zhǎng)發(fā)育的技術(shù)。花藥再生植株的方式：器官再生胚狀體再生胚狀體再生特點(diǎn)：兩極性與外植體的維管束無(wú)直接聯(lián)系花藥和花粉培養(yǎng)花粉培養(yǎng)：把花粉從花藥中分離出來(lái)，以單個(gè)花粉粒作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。裸子植物的花藥培養(yǎng)麻黃、銀杏、紫杉、榧等被子植物的花藥培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)法甘藍(lán)、甘藍(lán)芥藍(lán)雜種看護(hù)培養(yǎng)法番茄植板培養(yǎng)法水稻、煙草看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）Muir等1953年設(shè)計(jì)。小孢子母細(xì)胞培養(yǎng)小孢子母細(xì)胞培養(yǎng)主要用于研究減數(shù)分裂和花粉發(fā)育花藥與花粉培養(yǎng)方法材料的選擇材料的預(yù)處理培養(yǎng)基接種與再生植株的培育材料的選擇1．材料的遺傳差異母本材料的遺傳背景對(duì)花藥培養(yǎng)的成敗有決定性的影響不同物種之間花藥培養(yǎng)的反應(yīng)存在很大差異同一屬內(nèi)不同種或品種之間也存在誘導(dǎo)性的差異母本材料的基因型是影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因素一般情況下雜種比純種容易誘導(dǎo)材料的選擇２．母本生理狀態(tài)的影響母本的生理狀態(tài)直接影響花藥培養(yǎng)早期花蕾花藥中花粉生活力高，誘導(dǎo)效果好健壯母本花粉植株誘導(dǎo)率顯著高于弱株和衰老株母本的氮素營(yíng)養(yǎng)水平是另一個(gè)重要的影響因素植株長(zhǎng)期處于氮饑餓狀態(tài)有利于提高花粉誘導(dǎo)力花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期的光周期、溫度、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)對(duì)小孢子全能性也許會(huì)有明顯的作用材料的選擇3．花粉發(fā)育時(shí)期第一期四分體時(shí)期、第二期單核期（小孢子）第三期雙核期和三核期對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，單核中期和晚期是誘導(dǎo)花粉胚或花粉愈傷組織的最佳，尤其是單核靠邊期是花粉誘導(dǎo)的關(guān)鍵時(shí)期不同植物的花粉對(duì)離體培養(yǎng)有其特定的、最敏感的發(fā)育時(shí)期，大多數(shù)植物，單核期的花粉比較容易培養(yǎng)成功材料的預(yù)處理常用的預(yù)處理方法有：低溫處理離心激光照射乙烯利預(yù)處理低溫處理低溫預(yù)處理能明顯提高花粉胚的誘導(dǎo)率各種材料在進(jìn)行低溫預(yù)處理時(shí)應(yīng)保持較高濕度，防止材料失水低溫提高花粉誘導(dǎo)率的機(jī)制：低溫可以改變花粉粒第一次有絲分裂的紡錘體的取向；保持花粉的活力，使其不致在數(shù)天內(nèi)死亡高溫處理游離小孢子對(duì)高溫的預(yù)培養(yǎng)敏感期是培養(yǎng)的最初24-48h離心處理離心對(duì)花粉誘導(dǎo)的作用機(jī)理尚不清楚可能是離心能使花粉孤立化也可能是離心改變了花粉的軸向，有利于花粉的均等分裂激光照射

激光能促進(jìn)花粉愈傷組織的芽分化乙烯利處理能促使花粉細(xì)胞核分裂；能促進(jìn)花粉愈傷組織得到形成甘露醇處理甘露醇預(yù)培養(yǎng)對(duì)小麥游離小孢子有促進(jìn)作用。碳饑餓是啟動(dòng)雄核發(fā)育的重要因素培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基的組成對(duì)花藥培養(yǎng)有明顯的影響常用的花粉培養(yǎng)基本培養(yǎng)基有MS、Nitsch、B5、BN、MB、N6、H、Miller等。禾本科植物常用N6培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基楊屬較適合的是H培養(yǎng)基比較廣泛采用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基馬鈴薯培養(yǎng)基是一種以馬鈴薯提取物為主要成分的培養(yǎng)基，對(duì)小麥、水稻花粉愈傷組織誘導(dǎo)有利改良的馬鈴薯培養(yǎng)基可用于小麥的花粉愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基碳源蔗糖是常用的碳源，蔗糖的濃度對(duì)培養(yǎng)結(jié)果有重要影響，較高的濃度有利于提高花粉愈傷組織誘導(dǎo)效率，同時(shí)抑制花藥體細(xì)胞的增殖。不同材料要求的蔗糖濃度差異較大培養(yǎng)基激素大多數(shù)植物的花粉必須在含有適當(dāng)外源激素的培養(yǎng)基上才能誘導(dǎo)出愈傷組織或胚狀體在脫分化培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的作用非常重要，一般使用較高濃度的生長(zhǎng)素和少量的細(xì)胞分裂素在分化培養(yǎng)基中，細(xì)胞分裂素是主要的誘導(dǎo)激素，一般也配合使用生長(zhǎng)素培養(yǎng)基附加成分某些有機(jī)附加物對(duì)花粉愈傷組織的生長(zhǎng)是非常有益的水解酪蛋白、水解乳蛋白、酵母提取物、肌醇等培養(yǎng)基條件培養(yǎng)基利用組織培養(yǎng)物產(chǎn)生分泌物進(jìn)入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基條件化經(jīng)過(guò)條件化的培養(yǎng)基可以促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的分裂和分化接種和再生植株的培養(yǎng)材料的滅菌處理：漂白粉水溶液的上清液浸泡安替福民溶液浸泡升汞浸泡無(wú)菌水沖洗超凈臺(tái)取花藥、接種接種和再生植株的培養(yǎng)培養(yǎng)條件對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，較高的溫度有利于愈傷組織形成。一般溫度控制在28-30℃接種和再生植株的培養(yǎng)花粉植株的培育在產(chǎn)生花粉胚的情況下，小植株直接從花藥囊中長(zhǎng)出來(lái)花粉愈傷組織需要在分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生芽和不定根接種和再生植株的培養(yǎng)花粉植株的鑒定形態(tài)鑒定細(xì)胞學(xué)鑒定雜交鑒定分子標(biāo)記鑒定接種和再生植株的培養(yǎng)單倍體植物的染色體加倍常用的是化學(xué)誘變法常用的誘變劑有秋水仙素等具體方法：小苗浸泡法生長(zhǎng)錐處理法