Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14試驗(yàn)試劑、儀器設(shè)備及耗材 15培育工藝技術(shù)流程 26安全評(píng)估 37隔離措施 48應(yīng)急措施 59監(jiān)督評(píng)估 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由合肥神筆生物科技有限公司提出。本文件由中國商品學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位：合肥神筆生物科技有限公司。本文件主要起草人：。自發(fā)光植物培育工藝技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了自發(fā)光植物培育工藝的試驗(yàn)試劑、儀器設(shè)備及耗材、培育工藝技術(shù)流程、安全評(píng)估、隔離措施、應(yīng)急措施、監(jiān)督評(píng)估。本文件適用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育以Hisps、Cph、H3h、Luz基因?yàn)榛A(chǔ)的自發(fā)光植物。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

自發(fā)光植物Self-luminousplants通過基因工程手段，將特定的發(fā)光基因?qū)胫参锘蚪M，使其在無需外源添加發(fā)光底物的情況下，能在黑暗環(huán)境中自發(fā)產(chǎn)生可見熒光的植物。

載體vector用于攜帶目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞的工具，如雙元表達(dá)載體pCAMBIA2300，其包含啟動(dòng)子、終止子、抗性基因和多克隆位點(diǎn)等元件。

目的基因targetgene用于構(gòu)建自發(fā)光植物的Hisps、Cph、H3h、Luz基因，來源于南比新假革耳，在真菌生物發(fā)光系統(tǒng)中參與熒光素合成與發(fā)光過程。試驗(yàn)試劑、儀器設(shè)備及耗材試劑試驗(yàn)試劑包括：物激素類：IAA、GA3、IBA、6-BA、2,4-D、KT、NAA、CK等；抗生素類：硫酸卡那霉素、利福平、頭孢霉素、羧芐青霉素、除草劑Bar、氨芐青霉素鈉等；培養(yǎng)基：固體MS（不含蔗糖和瓊脂）、蔗糖、瓊脂、植物凝膠、葡萄糖、活性炭、酵母提取物、胰蛋白胨（OXOID）、氯化鈉等；其它藥劑：噻苯隆、次氯酸鈉、乙酰丁香酮、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、過氧化氫、二甲基亞砜、丙三醇等。試劑盒植物總RNA抽提純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等。菌株及引物大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌LBA4404、Hisps、Cph、H3h、Luz克隆引物、pCAMBIA2300載體、CaMV35S擴(kuò)增引物。儀器設(shè)備萬分之一電子天平、恒溫水浴鍋、冰箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、核酸蛋白測(cè)定儀、光照培養(yǎng)箱、NanoDrop2000分光光度計(jì)、渦旋振蕩儀、恒溫?fù)u床、紫外分光光度計(jì)、pH計(jì)、超低溫冰箱、小型高速離心機(jī)、高速離心機(jī)、磁力攪拌器、制冰機(jī)、超純水機(jī)等。耗材組培瓶、不同規(guī)格一次性培養(yǎng)皿、玻璃培養(yǎng)皿、封口膜、皮筋、無紡布、燒杯、量筒、玻璃棒、涂布棒、稱量紙、濾紙、鑷子、剪刀、酒精燈、不同規(guī)格離心管、不同規(guī)格錐形瓶、廣口瓶、噴壺、離心管架等。培育工藝技術(shù)流程目的基因克隆以目的基因片段mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，特異性引物引導(dǎo)DNA聚合酶在體外快速復(fù)制特定的DNA片段合成新的DNA鏈。在基因克隆過程中確保目的基因序列的完整性和準(zhǔn)確性，輔助元件和抗性基因篩選滿足高效表達(dá)的基本要求。載體構(gòu)建原則構(gòu)建載體要遵循分子生物學(xué)基本原則，確?；虿迦胛稽c(diǎn)的正確性；同時(shí)選擇適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)記，滿足后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化和陽性鑒定；在構(gòu)建載體時(shí)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)粒純化和驗(yàn)證階段。目的片段的連接與轉(zhuǎn)化使用限制酶對(duì)載體進(jìn)行雙酶切，將膠回收的目的基因片段通過同源重組法連接到經(jīng)過雙酶切的載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，并挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，選取片段大小正確的單克隆菌落進(jìn)行搖菌，后將該菌液送至通用生物公司測(cè)序。重組質(zhì)粒的提取將測(cè)序結(jié)果正確的200μl菌液置于40ml含有卡那霉素抗性（Kan）的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)，按質(zhì)粒DNA小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并使用濃度儀檢測(cè)其濃度和純度。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌選取濃度和純度高的質(zhì)粒，按說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)中，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定單克隆菌落條帶大小正確的菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果正確的菌落即為陽性重組質(zhì)粒。植物組培體系建立選取不同觀賞植物的莖、葉、花等器官作為外植體，采用70%～75%酒精消毒、滅菌水沖洗、0.1%次氯酸鈉或0.1%生汞處理、無菌水沖洗的脫毒方法。脫毒后的外植體接種于不同培養(yǎng)基，通過正交試驗(yàn)建立組培苗再生體系，獲取無菌組培苗。自發(fā)光植物遺傳轉(zhuǎn)化菌種活化將含質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404在LB固體培養(yǎng)基（含50mg/LKm和50mg/LRif）劃線或均勻涂抹后，28℃培養(yǎng)2d。用槍頭或圓頭牙簽挑取平板上生長(zhǎng)良好的單克隆菌落，放入50mL液體LB（含50mg/LKm和50mg/LRif）培養(yǎng)基中，28℃、220rpm在搖床中振蕩培養(yǎng)至OD600值0.4～0.8。常溫下，5000rmp離心8min后倒掉上清液，在無菌濾紙上倒扣離心管，將上清液去除。用MS液體將菌液的沉淀懸浮，懸浮后活化培養(yǎng)1h。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化以無菌組培苗為受體，預(yù)培養(yǎng)后放入農(nóng)桿菌侵染液侵染10～20min，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基2～3d，再轉(zhuǎn)接至篩選培養(yǎng)基，使傷口與培養(yǎng)基充分接觸，光照培養(yǎng)，間隔15～25d更換一次培養(yǎng)基，長(zhǎng)出再生苗后壯苗生根。組培苗及侵染條件為25℃±2℃，pH5.8～6.2，光照強(qiáng)度800～1200lx，光照周期16h光照8h黑暗。陽性克隆鑒定對(duì)侵染后的再生苗單株取樣，采用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株葉片的DNA，通過PCR檢測(cè)和表型鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。陽性植株收獲后種植得T1代，以此類推獲得T2代純系植株，同時(shí)進(jìn)行分子檢測(cè)驗(yàn)證目標(biāo)基因整合與表達(dá)。培養(yǎng)與再生根據(jù)培養(yǎng)階段和材料種類優(yōu)化培養(yǎng)基，對(duì)再生轉(zhuǎn)基因植株繼代擴(kuò)繁，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，保障植株正常生長(zhǎng)。遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)對(duì)再生植株組培苗進(jìn)行分子檢測(cè)、發(fā)光強(qiáng)度定量分析和多代遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，評(píng)估目標(biāo)基因的穩(wěn)定遺傳情況。田間試驗(yàn)及質(zhì)量控制轉(zhuǎn)基因材料用專用種子袋和穴盤包裝，標(biāo)簽明確。選擇肥沃、排水好、無污染土地作為試驗(yàn)區(qū)，人工點(diǎn)播種植。生長(zhǎng)期間統(tǒng)一科學(xué)管理，定點(diǎn)定量施肥澆水，防蟲防病，剔除弱苗。4月下旬用樂果防治蚜蟲。收獲時(shí)人工統(tǒng)一收獲，種子冷庫保存，殘留部分整地做堆肥。試驗(yàn)遵循法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)植株性狀和環(huán)境適應(yīng)性，統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。功能鑒定陽性植株應(yīng)具備自發(fā)光特性，在夜晚自發(fā)熒光，具備較高觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。安全評(píng)估轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)目的基因表達(dá)無特異性，所用啟動(dòng)子和終止子通用，載體無致病性。轉(zhuǎn)基因植物遺傳性狀穩(wěn)定，與受體植物相比，適應(yīng)性、致病性等特征未改變，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)無影響，不改變土壤微生物群落，可以確保生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與可持續(xù)性。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)基因植物不應(yīng)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，不改變土壤微生物群落。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況、發(fā)光時(shí)長(zhǎng)、發(fā)光強(qiáng)度等多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，確保與非轉(zhuǎn)基因植株在安全性能上無顯著差異，確保對(duì)人體健康無潛在風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)遵循相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行自發(fā)光轉(zhuǎn)基因植物的申報(bào)、審批流程。通過公開透明的監(jiān)督評(píng)估過程，增加公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的了解，提高其對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的信任度。實(shí)驗(yàn)室安全儀器設(shè)備安全實(shí)驗(yàn)室應(yīng)防火防爆、規(guī)范使用酒精燈、保障用電安全、遠(yuǎn)離火源及電源、保持消防通道暢通、定期檢驗(yàn)儀器、規(guī)范操作高溫、高速旋轉(zhuǎn)設(shè)備。高速旋轉(zhuǎn)儀器設(shè)備應(yīng)保證配平，通風(fēng)柜使用前應(yīng)進(jìn)行檢查，在距離通風(fēng)柜內(nèi)至少15cm的地方進(jìn)行作。應(yīng)注意無菌操作間和紫外燈使用安全。藥品試劑安全防毒：實(shí)驗(yàn)前應(yīng)了解藥品毒性及防護(hù)措施；在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行有毒氣體操作；劇毒藥品應(yīng)妥善保管，避免與皮膚接觸。防爆：使用可燃性氣體時(shí)，應(yīng)防止氣體逸出，避免明火，室內(nèi)通風(fēng)應(yīng)良好；部分藥品受震和受熱易引起爆炸，應(yīng)小心使用；不應(yīng)將強(qiáng)氧化劑和強(qiáng)還原劑存放一起；進(jìn)行容易引起爆炸的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)有防爆措施。防火：有機(jī)溶劑使用時(shí)避免明火、電火花和靜電放電，應(yīng)及時(shí)回收處理，防止自燃。部分物質(zhì)在空氣中易氧化自燃，應(yīng)隔絕空氣保存。防灼傷：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化劑、冰醋酸等會(huì)腐蝕皮膚，液氧、液氮等低溫會(huì)灼傷皮膚，不應(yīng)隨意混合、加熱。試驗(yàn)地安全監(jiān)控環(huán)境監(jiān)控溫度與濕度監(jiān)控：使用溫濕度傳感器對(duì)試驗(yàn)地的溫度和濕度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。根據(jù)研究需求設(shè)定適宜的溫濕度范圍，并確保環(huán)境控制系統(tǒng)能夠穩(wěn)定維持這些條件。光照監(jiān)控：使用光照傳感器測(cè)量試驗(yàn)地的光照強(qiáng)度和光照周期。根據(jù)植物的生長(zhǎng)需求和研究目的，調(diào)整光照條件以提供最佳的光照環(huán)境。空氣質(zhì)量監(jiān)控：使用空氣懸浮微生物采樣器或空氣質(zhì)量檢測(cè)儀對(duì)試驗(yàn)地的空氣質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。定期檢測(cè)空氣中的微生物數(shù)量、塵埃顆粒和其他污染物，確?？諝赓|(zhì)量符合研究要求。植物生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)監(jiān)測(cè)：定期檢查作物的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括株高、葉面積、生長(zhǎng)速度等指標(biāo)。使用專業(yè)的生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)儀器進(jìn)行精確測(cè)量，并記錄數(shù)據(jù)以便后續(xù)分析。病蟲害監(jiān)控：定期檢查作物是否受到病蟲害的侵害。使用病蟲害監(jiān)測(cè)工具和方法進(jìn)行早期預(yù)警和防治。轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)控：對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的生長(zhǎng)和表達(dá)情況進(jìn)行定期檢測(cè)。使用基因檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)效率。數(shù)據(jù)記錄與分析實(shí)驗(yàn)記錄：在實(shí)驗(yàn)過程中詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)操作步驟、試劑使用情況、儀器參數(shù)等。確保實(shí)驗(yàn)記錄的可追溯性和結(jié)果可復(fù)現(xiàn)性。數(shù)據(jù)記錄：建立完善的試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)，詳細(xì)記錄試驗(yàn)過程中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析：使用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，包括溫濕度、光照、空氣質(zhì)量等環(huán)境數(shù)據(jù)以及作物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。根據(jù)分析結(jié)果調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件或優(yōu)化研究方法，以得出準(zhǔn)確的結(jié)論。安全監(jiān)控安裝安全監(jiān)控?cái)z像頭，對(duì)試驗(yàn)地進(jìn)行全方位、全天候的監(jiān)控。配備報(bào)警系統(tǒng)，當(dāng)發(fā)生異常情況時(shí)，能夠立即發(fā)出警報(bào)并采取相應(yīng)的應(yīng)急措施。試驗(yàn)地的監(jiān)控年限屬于試驗(yàn)全年間不間斷無死角監(jiān)控。隔離措施物理隔離在試驗(yàn)地周圍設(shè)置圍欄或圍墻，入口設(shè)置門禁系統(tǒng)，設(shè)置明顯的警示標(biāo)志，設(shè)置隔離種植帶隔欄帶。生物隔離對(duì)進(jìn)出試驗(yàn)區(qū)域的人員、設(shè)備和物品進(jìn)行消毒處理；采取防蟲防鼠措施，設(shè)置防蟲網(wǎng)、使用滅鼠藥等，以防止昆蟲和鼠類等動(dòng)物進(jìn)入試驗(yàn)區(qū)域；對(duì)于植物試驗(yàn)，采取隔離種植措施，如設(shè)置隔離帶、使用無菌土壤等，以防止病原體或有害微生物的傳播。信息隔離應(yīng)對(duì)試驗(yàn)過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行保密；對(duì)試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)的信息進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理異?；顒?dòng)或潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。其他措施對(duì)試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)的環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格控制，如溫度、濕度、光照等，以確保試驗(yàn)條件的穩(wěn)定性和一致性。定期對(duì)試驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行安全巡查，檢查圍欄、門禁系統(tǒng)、警示標(biāo)志等是否完好有效，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理安全隱患。制定應(yīng)急預(yù)案，針對(duì)可能出現(xiàn)的突發(fā)事件或緊急情況，如火災(zāi)、泄露等，進(jìn)行及時(shí)有效的應(yīng)對(duì)。試驗(yàn)地的隔離措施應(yīng)綜合考慮物理、生物、信息等多個(gè)方面，以確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和安全性。同時(shí)，這些措施應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的具體需求和實(shí)際情況進(jìn)行靈活調(diào)整和優(yōu)化。試驗(yàn)地周圍留有邊界標(biāo)記，設(shè)立警示牌和空白隔離帶；明確試驗(yàn)區(qū)監(jiān)控人員，并配備緊急聯(lián)系方式。應(yīng)急措施人員安全監(jiān)控對(duì)進(jìn)入試驗(yàn)地的人員進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)，如體溫檢測(cè)、手部消毒等，確保人員遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止交叉污染；對(duì)于人身安全問題，制定詳細(xì)的應(yīng)急預(yù)案，包括人員疏散、設(shè)備關(guān)閉、報(bào)警求助等步驟；定期進(jìn)行應(yīng)急演練，提高員工的應(yīng)急處理能力和安全意識(shí)。環(huán)境異常處理當(dāng)環(huán)境參數(shù)超出設(shè)定范圍時(shí)，立即啟動(dòng)應(yīng)急處理機(jī)制。調(diào)整環(huán)境控制系統(tǒng)以恢復(fù)適宜的環(huán)境條件，并記錄異常情況以便后續(xù)分析。生物安全事件處理在發(fā)生生物安全事件時(shí)，如微生物泄漏或人員感染，立即啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案。采取必要的隔離、消毒和救治措施，防止事件擴(kuò)大和擴(kuò)散。其他安全措施試驗(yàn)結(jié)束后，由試驗(yàn)區(qū)負(fù)責(zé)人觀察調(diào)查，鏟除收獲后殘留材料，一年時(shí)間內(nèi)該地區(qū)不再種植非轉(zhuǎn)基因材料，第二年繼續(xù)檢查，如發(fā)現(xiàn)有殘留轉(zhuǎn)基因材料，及時(shí)清理，并做相應(yīng)記錄。如遇