HRP標(biāo)記抗體的方法酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉發(fā)。尤以簡(jiǎn)易過碘酸鈉法更為常用。戊二醛二步法1、原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白結(jié)合物。2、標(biāo)記步驟（1）稱取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。（2）反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如體積大于5mL，則以PEG濃縮至5mL。放置25mL小燒杯中，緩慢攪拌。（3）將待標(biāo)記的抗體112.5mg用生理鹽水稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入酶溶液中。（4）用1MpH9.5碳酸鹽緩沖液0.25mL，繼續(xù)攪拌3~4小時(shí)。（5）加0.2M賴氨酸0.25mL，混勻后，置室溫2小時(shí)。（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃（7）3000rpm/min離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。（8）將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M、pH7.4的PB緩沖液透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測(cè)），10000rpm/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。3、結(jié)果判定（1）定性及效價(jià)測(cè)定：用特異性抗原（或抗體）同酶標(biāo)記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA（或正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里）對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定（見（三）工作濃度的選擇）。（2）本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。4、試劑和器材（1）0.1M、pH6.8磷酸鹽緩沖液（PBS）：取0.2MNa2HPO449mL，0.2MNaH2PO451mL,NaCl1.8g，加蒸餾水至200mL。（2）12.5mL/L戊二醛液：取250mL/L戊二醛50mL與pH6.8的PBS確？mL混合。（3）1M、pH9.5碳酸鹽緩沖液（PBS）：取1MNa2CO33mL與1MNaHCO37mL混合。（4）0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸鹽緩沖液1mL中。（5）0.15M、pH7.4的PBS及生理鹽水。（6）pH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。（7）萘氏試劑及聚乙二醇（PEG、MW2000）。（8）純化的特異性抗體或抗Ig抗體。（9）HRP（RZ>3.0）。（10）SephadexG-25層析柱（2cmX50cm）。（11）攪拌器、分光光度計(jì)、離心機(jī)。（12）透析袋、大小燒杯，試管，吸管等。簡(jiǎn)易過碘酸鈉法本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再與Ig上的氨基相結(jié)合,所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高,將近70%的HRP和Ig結(jié)合,99%的Ig與酶集合,酶與Ig的活性無重大損失,是目前最常用的方法.1、原理：經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低pH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏堿，后者可進(jìn)一步用兵NaBH4（或乙醇胺）還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。2、標(biāo)記步驟（1）稱取5mgHRP溶解于1mL蒸餾水中。（2）于上液中加入0.2mL新配的0.1MNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。（3）將上述溶液裝入透析袋，對(duì)1mM,pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃（4）加20μL0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化物的pH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mgIgG，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。（5）加0.1mL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，再置4℃2（6）將上述溶液裝入透析袋，對(duì)0.15M，pH7.4PBS透析，4℃其余步驟（純化）同戊二醛標(biāo)記步驟的（6）、（7）、（8）。3、結(jié)果判定除標(biāo)記物igG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量（g/L）=（OD280nm-OD403nmΧ0.3）Χ0.624、試劑及器材（1）0.1MNaIO4：稱取保241mg高碘酸鈉溶于10mL蒸餾水中。（2）1mM,pH4.4的醋酸鈉緩沖液：0.2MNaAc(1.361g/50mL)3.7mL,0.2MHAc(0.601mlL/50mL)6.3mL,加蒸餾水至2000mL。（3）0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2Co30.32g,NaHCO30.586g,加蒸餾水至50mL，再用蒸餾水稀釋20倍，即成0.01M、pH9.5的碳酸鹽緩沖液。（4）4mg/mLNaBH4液：臨用時(shí)稱取NaBH44mg溶于1mL蒸餾水中。（5）其他試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)記法。工作濃度的選擇在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測(cè)定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原（或抗體）物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體（或抗Ig抗體）與吸附在載體上的抗原（或抗體）起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià)，或稱工作濃度。其步驟為：先將抗原（或抗體）用0.05MpH9。6包倍緩沖液稀釋為10mg/L左右，于聚苯乙烯板內(nèi)加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗三次。酶標(biāo)抗體用10g.LBSA-PBS液稀釋成1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600……（根據(jù)抗體的滴度而定），分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度2孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時(shí)后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃，10~30分鐘。以2M硫酸0.05mL終止反應(yīng)。結(jié)果判定主要以ELISA讀數(shù)儀度取各孔OD值。并以O(shè)D為縱坐標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫坐標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見ELISA部分。要說明的是，本法為ELISA直接法，所測(cè)的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的最適濃度可相差幾個(gè)滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，在此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度（可采用方陣法），以達(dá)到最適的實(shí)驗(yàn)條件。注意事項(xiàng)1、在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高效價(jià)高（瓊脂雙擴(kuò)