第十三單元綜合性實驗實驗原理

檢測傷寒O抗體在傷寒菌感染得診斷中具有重要意義,采用肥達(dá)反應(yīng)可對抗體進(jìn)行半定量檢測;若采用新一代得免疫檢測技術(shù)建立對傷寒O抗體準(zhǔn)確定量檢測得法,則可提高臨床診斷效果。以傷寒O抗原免疫動物,制備出抗傷寒O得抗體,將后者純化抗體與酶連接制備成酶標(biāo)抗體;以傷寒O抗原包被酶標(biāo)板,制備傷寒酶標(biāo)抗體為競爭抗體,以競爭法檢測傷寒抗體酶聯(lián)免疫檢技術(shù)。1、傷寒沙門菌菌體“O”抗原(免疫用)2、傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原(包備用)3、飽與硫酸銨溶液4、酶標(biāo)用洗滌液5、酶標(biāo)用稀釋液6、酶標(biāo)用底物液7、酶標(biāo)用終止液(2mol/LH2SO4)8、傷寒“O”抗原包被酶標(biāo)板9、待檢血清標(biāo)本10、實驗室標(biāo)準(zhǔn)陽性血清11、ELISA讀數(shù)儀實驗材料

制備抗傷寒O抗體與O抗原抗體純化酶(HRP)標(biāo)記抗體競爭ELISA檢測傷寒O抗體條件得優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)曲線確定標(biāo)本檢測與結(jié)果判斷實驗流程

取傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(傷寒沙門菌O901)得典型光滑型菌落,密集劃線接種于普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h,用無菌生理鹽水洗下菌苔,移入無菌得三角燒瓶中。充分振搖,置100℃水浴1h,殺菌及破壞H抗原。菌懸液離心,4000r/min,10min,棄上清。菌體再用無菌生理鹽水洗滌,棄上清。無活菌試驗合格后,用無菌生理鹽水稀釋成8~10億／ml,即成傷寒沙門菌“O”菌體抗原。實驗方法

傷寒沙門菌菌體“O”抗原(免疫用)

取傷寒沙門菌O901接種于普通瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h,用無菌生理鹽水洗下菌苔,配成70~100億/ml菌懸液,隔水煮沸2h,離心,3500r/min,10min,取上清即傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原。傷寒沙門菌可溶性菌體“O”抗原(包備用)日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量(ml)0、10、20、30、51、0途徑多點皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細(xì)菌免疫血清得免疫程序抗體制備

制備抗傷寒O抗體推薦快速免疫方案供參考采用(表1):取已制備得傷寒沙門氏菌體O抗原(１０億／ml),免疫程序如下表。最后兩次注射劑量較大,要緩慢推注。在末次免疫2天后試血,采用直接凝集法測定效價(見第二單元)。如凝集效價大于1∶1280,則可于一周后放血。效價過低,可再加強注射。日期第1天第2天第3天第4天第5天抗原劑量(ml)0、10、20、30、51、0途徑多點皮內(nèi)耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈耳緣靜脈表1制備細(xì)菌免疫血清得免疫程序

1份免疫血清加1份生理鹽水,邊攪拌邊滴加2份飽與硫酸銨溶液,于4℃靜置2h,2000r/min離心20min,吸棄上清,將沉淀溶于適量生理鹽水(盡量保持高蛋白濃度),放置透析袋中,多次更換生理鹽水(透析液),得初步純化得免疫抗體。采用改良NaIO4標(biāo)記法將酶與抗體得連接,其她備選得標(biāo)記方法請參考單元一。抗體得純化與酶標(biāo)記

取5mgHRP溶于0、5ml雙餾水中,加入新配制得0、06MNaIO4水溶液0、5ml,混勻,4℃30min;再加入0、16M乙二醇水溶液(10mlH2O+0、09ml乙二醇)0、5ml,室溫放置30min。然后加入含5mg純化抗體得水溶液1ml,混勻,并裝入透析袋,于0、05MpH9、5碳酸鹽緩沖液中攪拌透析6h(或過夜),使之結(jié)合;加入NaBH4溶液(5mg/ml)0、2ml,混勻,4℃2h;最后緩慢加入等體積得飽與硫酸銨溶液,混勻,4℃30min,離心,去上清,以0、02MpH7、4PBS液溶解沉淀并4℃透析除鹽過夜;次日取出離心,去除沉淀,即得酶-抗體(HRP-IgG)結(jié)合物,以0、02MpH7、4PBS液加至5ml。改良NaIO4標(biāo)記法將酶①將酶標(biāo)抗體用稀釋液做系列稀釋,加入包被有傷寒抗原得酶標(biāo)板中(50μl/孔),37℃30min。②洗滌液充分洗滌3次,甩干。③各孔內(nèi)加底物液0、1ml,置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測OD值。以O(shè)D值在0、８左右得最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本得最佳稀釋倍數(shù)?？垢偁幏笜?biāo)抗體工作濃度得確定①從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行系列倍比稀釋(連續(xù)稀釋10個管),與確定工作濃度得酶標(biāo)抗體一同加入包被有傷寒抗原得酶標(biāo)板中,另在2孔中加入稀釋液作空白對照,置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次,甩干。③各孔內(nèi)加底物液0、1ml,置暗處20min。④各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑤用酶標(biāo)儀檢測OD值?？瞻讓φ誒D值在0、8左右實驗成立,以標(biāo)本OD值在0、8～0、05得稀釋度(抗體單位)作為標(biāo)準(zhǔn)品得工作范圍,根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得得OD值,在方格紙上以O(shè)D值為x軸,抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線得制備

大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅持繼續(xù)保持安靜按預(yù)試驗摸索得實驗條件進(jìn)行測定:①將標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行系列倍比稀釋(連續(xù)稀釋10個管)。②將待檢血清用酶標(biāo)稀釋液適當(dāng)稀釋。③稀釋液作空白對照。④將稀釋得酶標(biāo)抗體(50μl/孔),同待檢標(biāo)本、不同單位得標(biāo)準(zhǔn)血清與空白對照標(biāo)本一同加入包被有傷寒抗原得酶標(biāo)板中(50μl/孔)。⑤置37℃恒溫箱30min。⑥加底物,終止反應(yīng)后檢測OD值。標(biāo)本檢測

陽性標(biāo)本反應(yīng)孔不顯色,空白標(biāo)本反應(yīng)孔顯色說明實驗成立。根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得得OD值與其所對應(yīng)得抗體單位標(biāo)繪制準(zhǔn)曲線或建立得回歸方程,根據(jù)繪制得準(zhǔn)曲線求出每個標(biāo)本得抗體單位。結(jié)果判定

1、請就方法學(xué)評價肥達(dá)反應(yīng)與競爭ELISA法檢測傷寒“O抗體”。例如,方法得穩(wěn)定性、特異性與敏感性。

2、人類與傷寒沙門菌接觸密切,通常情況下傷寒抗體均陽性。個體傷寒O抗體水平與傷寒感染與機體免疫狀態(tài)有關(guān),因此建立群體傷寒O抗體水平得正常范圍對判定個體傷寒得感染與機體免疫狀態(tài)具有重要價值。如何建立新方法檢測傷寒O抗體得參考范圍(正常值)?實驗討論

吉林醫(yī)藥學(xué)院李妍實驗二機體免疫功能評估

(綜合性實驗)無胸腺得裸鼠就是T細(xì)胞選擇性缺陷得天然動物模型人得重癥聯(lián)合型免疫缺陷綜合征實驗原理

利用淋巴細(xì)胞敏感得細(xì)胞毒藥物抑制或殺傷淋巴細(xì)胞,使機體免疫功能低下。給實驗動物(小鼠)注射抗原,通過觀察小鼠機體免疫抗體得反應(yīng)水平評價機體得體液免疫水平。二硝基氟苯(DNFB)就是一種半抗原,將其溶液涂抹腹壁皮膚后,與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原,刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4～7天后將其再次涂抹,可使局部產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)(水腫),通過觀察遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度對小鼠機體得細(xì)胞免疫功能做出評價。、雞卵卵核蛋白抗原就是天然得可溶性抗原,注入機體可誘導(dǎo)特異抗體產(chǎn)生,當(dāng)免疫細(xì)胞受到抑制,B細(xì)胞活化與抗體產(chǎn)生能力下降,檢測特異性抗體產(chǎn)生可評價體液免疫功能。實驗材料

1、免疫抑制劑環(huán)磷酰胺,氫化可得松。2、免疫抗原1%得二硝基氟苯(DNEB),雞卵卵核蛋白。3、酶標(biāo)用洗滌液,稀釋液,底物液,酶標(biāo)用終止液(2mol/LH2SO4)。4、抗原包被得酶標(biāo)板用包被液將免疫用抗原稀釋20倍加到酶標(biāo)板中,每孔0、1ml,置濕盒中4℃過夜;次日取出,用蒸餾水充分洗滌3次,甩干備用。5、酶標(biāo)儀6、酶標(biāo)抗小鼠IgG抗體。7、抗體標(biāo)準(zhǔn)品多支小鼠抗雞卵卵核蛋白抗體得混合物。8、1ml注射器,采血用手術(shù)器械,分離血清用器材,天平,繪圖紙等?；A(chǔ)免疫實驗分組對照組抗原激發(fā)造模組遲發(fā)型超敏反應(yīng)(二硝基氟苯)特異性抗體得誘發(fā)(雞卵卵核蛋白)抗體效價測定皮膚超敏反應(yīng)觀察空白組實驗流程

非免疫動物1、二硝基氟苯致敏:將小鼠腹部去毛,范圍約3×3cm2大小,并將１％DNFB溶液均勻涂抹于上。2、可溶抗原致敏:取小鼠于大腿內(nèi)側(cè)注射卵核抗原0、2ml/只?？乖?。

實驗方法

基礎(chǔ)免疫

將做過基礎(chǔ)免疫得小鼠隨機分成兩組(造模組與實驗對照組);另取數(shù)量相等得未經(jīng)免疫得小鼠為空白對照組。造模組小鼠可采用以下方法之一誘導(dǎo)免疫抑制,也2方法均用,進(jìn)行對比。方法一:每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg(參考劑量),連續(xù)5天后免疫功能顯著降低。方法二:每鼠每天腹腔注射氫化可得松50mg/kg(參考劑量),5天后免疫功能顯著受抑。實驗動物分組與免疫模型建立

致敏后第7天,將１％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊,空白對照組同樣涂耳但未致敏。攻擊后24h,剪下左右耳殼,取同樣大小得耳片,稱重。遲發(fā)型超敏反應(yīng)激發(fā)(細(xì)胞免疫功能檢測)

特異性抗體得誘發(fā)(體液免疫功能檢測)

基礎(chǔ)免疫后第7天再次注射抗原,方法同基礎(chǔ)免疫。5-7天后采血測抗體。在優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗原得條件得基礎(chǔ)上;采ELISA檢測實驗組與空白組小鼠特異抗體得濃度。優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗原得條件①將待檢血清從5倍開始用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行系列倍比稀釋(連續(xù)稀釋10個管),分別加入已用抗原包被好得酶標(biāo)板中(每孔加0、1ml),置37℃恒溫箱30min。②取出用洗滌液充分洗滌3次,甩干。③各孔加酶標(biāo)抗體0、1ml,置37℃恒溫箱30min。④取出用洗滌液充分洗滌3次,甩干。⑤各孔內(nèi)加底物液0、1ml,置暗處20min。⑥各孔內(nèi)加入終止液終止反應(yīng)。⑦用酶標(biāo)儀檢測OD值。以O(shè)D值在0、30左右得最小稀釋倍數(shù)為待檢樣本最佳稀釋倍數(shù)。①將待檢血清按預(yù)實驗確定得稀釋倍數(shù)用酶標(biāo)稀釋液進(jìn)行稀釋,分別加入已用抗原包被好得酶標(biāo)板中(每孔加0、1ml)。②將標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行系列倍比稀釋(連續(xù)稀釋10個管),分別加入已用抗原包被好得酶標(biāo)板中(每孔加0、1ml)。③另在2孔中加入稀釋液作空白對照。④置37℃恒溫箱30min。⑤洗滌,加酶標(biāo)抗體,加底物,終止反應(yīng)與檢測OD值。優(yōu)化間接法檢測小鼠抗卵核抗體1、細(xì)胞免疫功能得判定以剪下得左右耳片重量之差為遲發(fā)型超敏反應(yīng)程度,可以反映機體細(xì)胞免疫水平。模型組免疫功能下降,遲發(fā)型超敏反應(yīng)強度下降。結(jié)果判斷

2、體液免疫根據(jù)對標(biāo)準(zhǔn)抗體血清所測得得OD值(標(biāo)準(zhǔn)血清及待檢血清OD值在計算時均應(yīng)減去空白對照OD值),在方格紙上以O(shè)D值為x軸,抗體單位為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;或采用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行線性轉(zhuǎn)化,建立回歸方程。根據(jù)標(biāo)繪制得準(zhǔn)曲線或建立得回歸方程,可以求出每個標(biāo)本得抗體單位。模型組免疫功能下降,特異抗體產(chǎn)生下降。實驗討論

1、舉例說明人體在哪些情況下發(fā)生免疫缺陷。

2、針對本實驗建立得模型,您還能想到哪些方法或指標(biāo)來評價免疫功能？實驗三免疫相關(guān)疾病得實驗診斷

(科研設(shè)計)免疫學(xué)檢驗得與臨床疾病對自身免疫性疾病得診斷對免疫增生性疾病得診斷對感染性疾病得診斷對機體免疫狀態(tài)進(jìn)行綜合評價腫瘤標(biāo)志物對腫瘤進(jìn)行早期診斷或病情監(jiān)測主要課程討論安排

第一階段:重點就是與臨床醫(yī)師與患者本人接觸,或通過查閱有關(guān)書籍與互聯(lián)網(wǎng)增加對疾病與疾病得診斷過程得感性認(rèn)識;第二階段:有針對性地、系統(tǒng)地收集有關(guān)臨床實驗診斷數(shù)據(jù)與資料,作為分析與討論得基礎(chǔ);第三階段:對實驗數(shù)據(jù)與資料進(jìn)行總結(jié)分析并提出有關(guān)設(shè)想或